一種用于食品中腸出血性大腸桿菌檢測的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于食品中腸出血性大腸桿菌檢測的試劑盒。腸出血性大腸桿菌EHEC為出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征的病原體。引起人類疾病的主要是O157：H7血清型?，F(xiàn)有技術(shù)的檢測方法耗時(shí)耗力，檢測不便，而本發(fā)明提供了特異性檢測腸出血性大腸桿菌EHEC的試劑盒，試劑盒中含有特異性結(jié)合腸出血性大腸桿菌EHEC的適配子，所述適配子為單鏈DNA。本發(fā)明試劑盒具有檢測時(shí)間短、研發(fā)周期短、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，在食品與衛(wèi)生安全檢測中得到廣泛應(yīng)用。
【專利說明】-種用于食品中腸出血性大腸桿菌檢測的試劑盒 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于食品中腸出血性大腸桿菌檢測 的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸出血性大腸桿菌化肥C)是大腸桿菌的一個(gè)亞型，E肥C分為157、111等血清型，主 要致病菌株為〇157:H7,可引起感染性腹瀉，因能引起人類的出血性腸炎而得名。2011年5 月，德國爆發(fā)腸出血性大腸桿菌病。據(jù)羅伯特?科赫研究所6月觀日公布的最新疫情通報(bào)， 德國一個(gè)多月來腸出血性大腸桿菌感染病例累計(jì)達(dá)3901例，截至27日，死亡患者已達(dá)47人。 報(bào)告還指出，本次德國疫情與W往產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌造成的疫情不同，其特點(diǎn)為:一、感 染病例中溶血性尿毒綜合征重癥病例所占比例達(dá)25%，遠(yuǎn)高于W往疫情;二、溶血性尿毒綜 合征病例中成人患者約占89%，且多數(shù)是女性。而W往產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌感染者多數(shù)是 兒童，且沒有明顯性別差異;=、W往疫情致病菌大多數(shù)是血清型0157型大腸桿菌，運(yùn)次則 是0104型；四、本次感染的潛伏期平均為8天，W往是3到4天。
[0003] 目前，國內(nèi)外在食品中大腸桿菌檢測時(shí)常用的檢測方法因其檢測手段、識(shí)別對(duì)象 各有不同而各具優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)檢測大腸桿菌的方法需要先分離再培養(yǎng)，然后用經(jīng)典的方法 鑒定，耗時(shí)、不靈敏是運(yùn)些方法普遍存在的問題。免疫學(xué)方法簡單、方便、迅速、特異性較好， 但是仍有交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重、假陽性多、靈敏度偏低等不足之處。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技 術(shù)雖具有準(zhǔn)確、靈敏、快速的特點(diǎn)，但其在檢測數(shù)目較多的樣品時(shí)操作比較繁雜，因此在聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出很多新型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，如多重 PCR技術(shù)，然而多重PCR雖簡化了PCR實(shí)驗(yàn)的操作，但是由于該技術(shù)需數(shù)對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò) 增，很容易產(chǎn)生非特異性條帶或假陽性，影響檢測結(jié)果。
[0004] 通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic evolution of ligands by e邱onential enrichment ,SELEX)技術(shù)篩選獲得的寡核巧酸序列稱為適配子(aptamer)。其 原理就是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核巧酸文庫，其隨機(jī)序列長度 在20-100個(gè)堿基左右，將隨機(jī)寡核巧酸文庫與祀分子相互作用，保留結(jié)合的寡核巧酸配基， 經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增、篩選數(shù)個(gè)循環(huán)，即可使與該祀子特異結(jié)合的寡核巧酸序列得到富集，最終獲得 祀分子的特異寡核巧酸配基。該技術(shù)具有庫容量大、祀分子范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)等 優(yōu)點(diǎn)。在臨床檢測方面，特別是對(duì)一些未知的致病性細(xì)菌或病毒的研究，雖然不知道其內(nèi)部 結(jié)構(gòu)、功能W及運(yùn)些物質(zhì)的表位，但將其作為祀物質(zhì)，通過SELEX技術(shù)篩選到其相應(yīng)的適配 子，W檢測祀物質(zhì)，已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0005] 利用SELEX技術(shù)篩選獲得的適配子識(shí)別分子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類 抗體相比，核酸類配基具有更多的優(yōu)越性，如不受免疫條件和免疫源性限制，可體外人工合 成，變性與復(fù)性可逆，可修飾并有利于長期保存和室溫運(yùn)輸?shù)?。更重要的是，適配子的祀分 子更為廣泛，包括金屬離子、有機(jī)染料、氨基酸、細(xì)胞因子、輔因子、氨基糖巧、抗生素、堿基 類似物、核巧酸和多膚等。其中蛋白質(zhì)類祀分子最多，包括酶、生長因子、抗體、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì) 胞粘附分子和選擇素等。完整的病毒顆粒和細(xì)菌病原體，甚至完整的細(xì)胞也可W通過復(fù)合 祀子SELEX技術(shù)或消減SELEX技術(shù)篩選出高親和力的寡核巧酸配基。適配子比抗體具有更高 的特異性和精確識(shí)別能力，甚至能識(shí)別單抗不能區(qū)分的蛋白質(zhì)分子。運(yùn)些特性使得適配子 在生物醫(yī)藥和食品衛(wèi)生研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，成為不可缺少的有力工具。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明公開了一種高特異高敏感檢測腸出血性大腸桿菌E肥C的方法，提高了它的 檢測和診斷效率。
[0007] 為了解決現(xiàn)有大腸氏菌檢測中存在的檢測周期長、靈敏度低、假陽性多等問題，本 發(fā)明提供一種特異識(shí)別腸出血性大腸桿菌E肥C的試劑盒及其應(yīng)用。
[000引上述試劑盒，適配子可W采用生物素標(biāo)記。
[0009] 本發(fā)明中，所述的核酸適配體能夠特異結(jié)合腸出血性大腸桿菌。
[0010] 本發(fā)明另外提供一種腸出血性大腸桿菌邸6(：適配子的篩選方法。
[001。 隨機(jī)單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程郁良公司合成。
[0012] 隨機(jī)單鏈DNA文庫：5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N35)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 ' (注:n35代表35個(gè)A、T、C、G堿基中任意一種的35個(gè)集合）。
[0013] 引物1:5 ' - TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0014] 引物n :5'-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3'
[0015] 引物虹：5 ' -地高辛-TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0016] 引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0017] 2. SELEX篩選獲得腸出血性大腸桿菌E肥C特異的寡核巧酸適配子 [001引 1)沈LEX篩選過程：
[0019] a.首輪篩選，取合成的隨機(jī)單鏈DNA IOiig加入到400ul IX結(jié)合緩沖液，95度變性 5min，然后迅速置于冰上IOmin;
[0020] b.加入ImL腸出血性大腸桿菌E肥C菌懸液2.0 X IO8，于37°C搖床10化pm結(jié)合1.2小 時(shí)，使單鏈DNA文庫與菌充分作用；
[0021] C.更換離屯、管，W去除與管壁結(jié)合的單鏈DNA，室溫下離屯、10 000巧m離屯、IOmin分 離未與菌結(jié)合的單鏈DNA文庫；
[0022] d.棄上清，加入60化L IX沖洗緩沖液，離屯、10 00化pm離屯、IOmin，重復(fù)此過程4 次，目的是洗去未與菌結(jié)合的核酸片段；
[0023] e .接上步離屯、后去上清，加入10化L去離子水99°C加熱3min，高速離屯、18 OOO^m 離屯、15min棄沉淀，換管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0024] 2)PCR富集與腸出血性大腸桿菌E肥C特異結(jié)合的寡核巧酸適配子：
[0025] 每輪篩選后獲得的與腸出血性大腸桿菌E皿C特異結(jié)合的寡核巧酸適配子文庫通 過PCR擴(kuò)增得到富集；
[00%] a. W上述上清為模板，通過引物I和引物IV擴(kuò)增產(chǎn)生一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈 DNA ；
[0027] b. PCR擴(kuò)增條件:95 °C預(yù)變性3min，然后進(jìn)行30循環(huán)95 °C變性35s，60 °C退火37s，72 。(:延伸33s，最后72°C延伸lOmin;
[00%] c.PCR產(chǎn)物純化后，一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作 用與鏈親合素交聯(lián)的磁珠結(jié)合，經(jīng)過IX連接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)緩沖液洗涂3次，用IOOmM的新鮮化OH 37°C變性30min，使不帶生物素的單鏈 DNA從鏈親合素交聯(lián)的磁珠上洗脫下來，測定其單鏈DNA的濃度，用作下一輪篩選的富集庫。
[0029] 3)重復(fù)篩選:重復(fù)上述SELEX篩選過程和PCR擴(kuò)增富集過程，共進(jìn)行15輪篩選，其中 第6、9輪分別用克雷伯菌、腸出血性大腸桿菌進(jìn)行反篩。
[0030] 特異識(shí)別腸出血性大腸桿菌E肥C的寡核巧酸適配子的核巧酸序列如下：
[0031] E肥C-I:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTTTMTAAACAATACCTCCCATCCCTCTCCTTTCGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0032] E肥C-2:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCTTTACTATCCCCATCATCTTATCATAAACTTTACGACCAAG TGACAGTGACGAG
[00；33] E 肥 C-3: TTGGACAGTGGACGTGAAGCCTATTMACCACAAAACACTTTMCCTTCACTAACGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0034] E肥C-4:TTGGACAGTGGACGTGAAGCAAATCAACAATACATTATATCAATTACACATCTCCGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0035] E肥C-5:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCTTACCACCTACACAATCTATCACTTATAACTTCAGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0036] E肥C-6:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTACCACCTACACAATCTATCACTTATAACTTCAAAGACCAAG TGACAGTGACGAG
[00；37] E 肥 C-7: TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTMTTACCCCCTCTTCAAACACAATCTATAAAATGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0038] E肥C-8:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCATATCAACACCTCACTCCTTATTCCCAACTATTTGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0039] E肥C-9:TTGGACAGTGGACGTGAAGCATACCTTACCCTATCCAAACAATCTATCTCCCACCGACCAAG TGACAGTGACGAG
[0040] E肥C-IO:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCCCTATCCACAATTTTAATACAAATCTCTAAATAAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0041 ] E肥C-11:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCCTATTATTTATAACACATCACACCATCTCATCATGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0042] E肥C-12:TTGGACAGTGGACGTGAAGCACACCTATTCCCCCTCCCTTCCTCTACTAATCAAAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0043] E肥C-13:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTACCATCCATAACCTCCATACCTCAAAACTATTATGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0044] E肥C-14:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTTTACCTATAAAATAAATCTCTTCTATTCTTACAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0045] E肥C-I5:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTACCTCTACAAATTCCACTTCATACTACTCCTTTCGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0046] E肥C-16:TTGGACAGTGGACGTGAAGCCATATACATCCCCAACATCTACCTACCCAAAAATAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0047] E肥C-17:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTCAATCTCTCTCTATATCATTCCTCCTTTMTCAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[004引 E肥C-18:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTATTACCCTTCAATCACAACACCATTATACTATTAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0049] E肥C-19:TTGGACAGTGGACGTGAAGCATTCCATCCATTCTTMTCTCTATACATAATACTCGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0050] E肥C-20:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTTTTCCACCACATTACCACCTTACCTCAATTACCCGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0051 ] E肥C-21:TTGGACAGTGGACGTGAAGCTAAATCACACCATTCACCTCAATCATAATCTTMAGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0052] E肥C-22:TTGGACAGTGGACGTGAAGCATCCTTATCCCTCCATCACTACCATTMCTCTAACGACCAA GTGACAGTGACGAG
[0053] 本發(fā)明通過SELEX技術(shù)的篩選過程，獲得高親和性特異識(shí)別腸出血性大腸桿菌 E肥C的寡核巧酸適配子(適配體），用于快速、準(zhǔn)確檢測腸出血性大腸桿菌E肥C。
[0054] W上述核酸適配子篩選文庫為基礎(chǔ)，可對(duì)文庫兩端的固定序列的個(gè)別核巧酸進(jìn)行 替換、顛倒、移位，或?qū)ζ溟L度進(jìn)行小幅延長或縮短，或?qū)ξ膸熘虚g的隨機(jī)序列進(jìn)行延長或 縮短，或?qū)U(kuò)增文庫的引物作相應(yīng)的簡單改造，然后制備簡單改造后的文庫和引物進(jìn)行核 酸適配子的篩選、PCR擴(kuò)增和分析與應(yīng)用。
[0055] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明設(shè)計(jì)出了一個(gè)性能優(yōu)秀的隨機(jī)單鏈寡核巧酸文庫。文 庫具有接近長度下限的短固定序列和較長的隨機(jī)序列，充分保證了文庫中單鏈寡核巧酸的 多樣性。文庫固定序列（引物序列）的獨(dú)特設(shè)計(jì)能使用高退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，既能有效獲 得目的產(chǎn)物，又能有效抑制非特異性產(chǎn)物。本文庫及引物應(yīng)用于腸出血性大腸桿菌E皿C的 核酸適配子篩選獲得成功，所述的適配子可W用于制備檢測試劑盒，從而用于食品中的腸 出血性大腸桿菌E皿C的檢測。本方法具有檢測時(shí)間短、研發(fā)周期短、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡單等 優(yōu)點(diǎn)，在食品與衛(wèi)生安全檢測中能夠得到廣泛應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 實(shí)施例1腸出血性大腸桿菌E肥C菌液的制備
[0化7] 將購買的E皿C 0157 :H7抓L933的菌株，在LB液體培養(yǎng)基試管中，37攝氏度，ISOr/ min搖動(dòng)過夜，備用。
[005引實(shí)施例2適配子的獲得
[0059] 1、隨機(jī)單鏈DNA文庫和引物由上海生物工程有限公司合成。
[0060] 隨機(jī)單鏈DNA文庫：5 ' -TTGGACAGTGGACGTGAAGC(N35)GACCAAGTGACAGTGACGAG-3 ' (注:n35代表35個(gè)A、T、C、G堿基中任意一種的35個(gè)集合）。
[0061 ]引物 1:5 ' - TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0062] 引物 n : 5 ' -CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '
[0063] 引物虹：5 ' -地高辛-TTGGACAGTGGACGTGAAGC-3 '
[0064] 引物IV: 5 ' -生物素-CTCGTCACTGTCACTTGGTC-3 '。
[0065] 2. SELEX篩選獲得腸出血性大腸桿菌E肥C特異的寡核巧酸適配子
[0066] I)沈LEX篩選過程：
[0067] a.首輪篩選，取合成的隨機(jī)單鏈DNA IOiig加入到400ul IX結(jié)合緩沖液，95度變性 5min，然后迅速置于冰上IOmin;
[006引 b.加入ImL腸出血性大腸桿菌E肥C菌懸液2.0 X IO8，于37°C搖床10化pm結(jié)合1.2小 時(shí)，使單鏈DNA文庫與菌充分作用；
[0069] C.更換離屯、管，W去除與管壁結(jié)合的單鏈DNA，室溫下離屯、10 000巧m離屯、IOmin分 離未與菌結(jié)合的單鏈DNA文庫；
[0070] d.棄上清，加入60化L IX沖洗緩沖液，離屯、10 00化pm離屯、IOmin，重復(fù)此過程4 次，目的是洗去未與菌結(jié)合的核酸片段；
[0071 ] e .接上步離屯、后去上清，加入10化L去離子水99°C加熱3min，高速離屯、18 OOO^m 離屯、15min棄沉淀，換管留上清(核酸片段存于上清中），-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0072] 2)PCR富集與腸出血性大腸桿菌E肥C特異結(jié)合的寡核巧酸適配子：
[0073] 每輪篩選后獲得的與腸出血性大腸桿菌E皿C特異結(jié)合的寡核巧酸適配子文庫通 過PCR擴(kuò)增得到富集；
[0074] a. W上述上清為模板，通過引物I和引物IV擴(kuò)增產(chǎn)生一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈 DNA ；
[0075] b. PCR擴(kuò)增條件:95 °C預(yù)變性3min，然后進(jìn)行30循環(huán)95 °C變性35s，60 °C退火37s，72 。(:延伸33s，最后72°C延伸lOmin;
[0076] C.PCR產(chǎn)物純化后，一端帶生物素標(biāo)記的雙鏈DNA通過生物素-鏈親合素之間的作 用與鏈親合素交聯(lián)的磁珠結(jié)合，經(jīng)過IX連接（the standard Binding and Washing Buffer，B&W)緩沖液洗涂3次，用IOOmM的新鮮化OH 37°C變性30min，使不帶生物素的單鏈 DNA從鏈親合素交聯(lián)的磁珠上洗脫下來，測定其單鏈DNA的濃度，用作下一輪篩選的富集庫。
[0077] 3)重復(fù)篩選:重復(fù)上述SELEX篩選過程和PCR擴(kuò)增富集過程，共進(jìn)行15輪篩選，其中 第6、9輪分別用克雷伯菌、腸出血性大腸桿菌進(jìn)行反篩。
[0078] 4)富集寡核巧酸適配子與菌結(jié)合率的測定：
[0079] 第13、14、15輪SELEX篩選的產(chǎn)物，W標(biāo)記地高辛的引物虹和標(biāo)記生物素的引物IV 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化的PCR產(chǎn)物與鏈親和素標(biāo)記的磁珠充分反應(yīng)并用化OH解鏈，地高辛標(biāo)記 的單鏈DNA游離在上清中；
[0080] 5)富集寡核巧酸適配子文庫的測序結(jié)果與分析：
[0081 ] a.將最后的富集文庫擴(kuò)增為雙鏈，連接pEGM-T載體，轉(zhuǎn)化E. COl i D冊(cè)a，隨機(jī)挑取 65個(gè)陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定，其中22個(gè)為可用序列，見SEQ ID N0:l-22所示；
[0082] 實(shí)施例3結(jié)合特性驗(yàn)證
[0083] 將適配子分別取1.化g，用牛小腸堿性憐酸酶(CIP)37°C消化化，純化回收去憐酸 化的DNA;通過T4多核巧酸激酶標(biāo)記[丫-32P]ATP于去憐酸化的DNA分子末端。10皿〇1放射性 標(biāo)記的DNA適配子分別與不同濃度的菌體37°C解育30min，各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾 過，洗涂濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩次測定。 計(jì)算各個(gè)適配子與菌體的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
[0084]
[0085]
[0086] 從W上結(jié)果可W看出，本發(fā)明的22個(gè)適配子具有非常強(qiáng)的結(jié)合特性，現(xiàn)有技術(shù)中 也沒有所述結(jié)合特性的適配子能夠結(jié)合所述的菌體。
[0087] 實(shí)施例5菌體的鑒定
[0088] 寡核巧酸適配子SEQ ID NO: 1-22的序列送上海生物工程有限公司合成并在5'端 標(biāo)記徑基巧光素(FAM)。
[0089] 取5'FAM巧光標(biāo)記的寡核巧酸適配子沈Q ID NO:l-22(l〇〇nM)各30化L，分別與腸 出血性大腸桿菌E肥C，腸侵襲性大腸桿菌、化脈性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙口氏菌、腸致 病性大腸埃希菌EPEC(1.5X108)于37°C解育化，用lXBB(50mM Tris-HCKpH 7.4)，5mM KCl，100mM NaCl，ImMMgC12)洗涂2次后，將菌體重懸于500化 IX B B，用抓 FACSC alibur 流式細(xì)胞分析儀檢測結(jié)合上FAM標(biāo)記的適配子的菌體百分率(測=次取平均值），結(jié)果顯示 腸出血性大腸桿菌E肥C寡核巧酸適配子競爭結(jié)合腸出血性大腸桿菌E皿C的能力為99.7%, 而針對(duì)腸侵襲性大腸桿菌、化脈性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙口氏菌菌、腸致病性大腸埃 希菌EPEC沒有結(jié)合率。
[0090] 運(yùn)充分說明，本發(fā)明的適配子具有較好的特異性和穩(wěn)定性。
[0091] W上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于食品中腸出血性大腸桿菌檢測的試劑盒，其含有能特異性結(jié)合腸出血性大 腸桿菌的核酸適體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體序列如SEQ ID No: 1-22任一 所示。3. -種檢測食品中腸出血性大腸桿菌的方法，其特征在于利用權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所 述的試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/10GK105925661SQ201610483856
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】楊國林
【申請(qǐng)人】楊國林