一種提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種在生物技術(shù)領(lǐng)域廣為使用的有效擴增脫氧核糖核酸 (DNA)片段的方法。常規(guī)PCR基本原理為：依據(jù)已知的待擴增目的DNA序列設(shè)計一對與目的 DNA序列兩條單鏈完全互補的相向的特異性引物，然后將模板DNA、引物、DNA聚合酶、4種脫 氧核苷酸(dNTPs)放入反應(yīng)緩沖液中，然后通過高溫變性、低溫復(fù)性、中溫延伸的過程使目 的DNA片段得到擴增。在高溫變性階段，模板雙鏈DNA變性變?yōu)閱捂?在低溫復(fù)性階段，序列 互補的單鏈將重新結(jié)合為雙鏈，此時分別與模板DNA兩條單鏈完全互補的引物片段因在體 系內(nèi)的濃度優(yōu)勢將優(yōu)先與對應(yīng)的模板DNA單鏈重新結(jié)合為局部雙鏈，兩條引物在模板DNA上 的結(jié)合位置決定了擴增片段的長度。在中溫延伸階段，DNA聚合酶結(jié)合于引物的3'端并依據(jù) 模板DNA序列利用dNTPs特異的合成新的互補鏈。這三個步驟每重復(fù)一次，目的DNA片段理論 上會擴增1倍，通過對這三個步驟的重復(fù)進(jìn)行，就可大量而特異性的擴增目的DNA片段。
[0003] PCR的基本組分包括模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTPs和含有鎂離子的緩沖液，其 中引物是決定PCR反應(yīng)特異性的關(guān)鍵因素，只有當(dāng)引物與目的擴增片段完全匹配時才能特 異性擴增目的片段。目前普遍認(rèn)為常規(guī)PCR適宜采用的引物長度約為15bp~25bp，且整個引 物序列應(yīng)與目的擴增片段完全互補，但在實踐過程中發(fā)現(xiàn)僅當(dāng)引物的3 '擴增起始端部分序 列與模板DNA互補時也可以成功進(jìn)行PCR擴增。如引物3'端在模板DNA上結(jié)合的位置正確且 與模板完全互補的部分序列足夠長，則也可以成功而特異的擴增目的片段，因此引物足夠 長時其5'端局部序列與模板DNA不完全匹配可不影響PCR的成功進(jìn)行。但當(dāng)擬擴增的目的 DNA序列本身特異性不高且在模板DNA中存在較多的相似序列時，引物的3 '端就可能在模板 DNA上存在多個結(jié)合位點，在此情況下PCR就出現(xiàn)了非特異性擴增，當(dāng)非特異性擴增現(xiàn)象嚴(yán) 重時甚至?xí)?dǎo)致目的片段不能擴增，此時PCR反應(yīng)失敗。
[0004] 目前，普遍應(yīng)用的提高PCR反應(yīng)特異性的方法主要包括：（1)設(shè)計多條引物以篩選 高特異性引物，但當(dāng)目的序列特異性較差時此方案效果欠佳；（2)提高PCR反應(yīng)的退火溫度： 當(dāng)引物在模板上存在多個非特異性結(jié)合位點時，與特異性結(jié)合位點相比，大部分非特異性 結(jié)合位點僅為引物與模板的部分互補結(jié)合，其結(jié)合力弱、穩(wěn)定性差，因此當(dāng)退火溫度升高 時，引物的非特異性結(jié)合位點減少，PCR反應(yīng)特異性增高;但是此種方法也存在局限性，當(dāng)目 標(biāo)序列或引物特異性較差時，模板上多個引物結(jié)合位點的結(jié)合穩(wěn)定性差異往往不大，提高 退火溫度也不能有效提高PCR反應(yīng)特異性；（3)應(yīng)用高保真的Taq酶:此方法是在引物特異性 尚可的情況下進(jìn)一步提高PCR反應(yīng)特異性的方法，因此有很多非特異性擴增用該辦法也無 法解決。
[0005] 綜上所述，尋找更好更多的提高PCR反應(yīng)特異性的方法，對于PCR檢測的應(yīng)用十分 必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有提高PCR反應(yīng)特異性的方法的缺陷和不足， 提供一種提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)特異性的方法，即在常規(guī)PCR所使用的特異性引物的5' 端添加一段與模板非同源且不形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的序列，其長度可為幾個至幾十個堿基 (一般采用9~20個堿基）。另外進(jìn)一步地，還可采用復(fù)合PCR反應(yīng)條件進(jìn)一步提高PCR反應(yīng)特 異性(復(fù)合反應(yīng)條件:第一個循環(huán)階段采取5~10循環(huán)的常規(guī)PCR反應(yīng)條件，第二個循環(huán)階段 采用高溫的退火和延伸步驟合并的兩步法PCR條件）。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性的方法。
[0008] 本發(fā)明另一目的是提供一種提高EGFR基因18、19、20、21外顯子的？〇?反應(yīng)特異性 的方法。
[0009] 本發(fā)明再一目的是提供EGFR基因18、19、20、21外顯子的高特異性擴增引物。
[0010] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0011] -種提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性的方法，是在所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物對的5' 端加尾;所述加尾是指在引物對的5'端添加一段與模板非同源且不形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的序 列。
[0012] 引物5'端所加的尾其長度可為幾個到幾十個堿基，優(yōu)選為9~20個堿基。具體加尾 的長度取決于擬采用的目標(biāo)退火溫度。
[0013] 同時尾序列可為非固定序列，只要其不與待擴增的樣品高度同源且不會形成引物 內(nèi)或間穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)影響PCR擴增即可。
[0014] 另外，所述加尾是指在引物對中的兩條引物的5'端均加尾，兩條引物加尾的堿基 數(shù)相同，所述加尾為9~20個堿基。
[0015] 上述5 '端加尾后引物的工作濃度與常規(guī)引物一致甚至更低。
[0016] 根據(jù)上述要求所設(shè)計出的5'加尾引物使用常規(guī)三步法PCR反應(yīng)條件時即可在提高 反應(yīng)特異性的情況下有效擴增，顯著提高PCR反應(yīng)的特異性。
[0017] 具體地，作為一種可實施的優(yōu)選方案，上述加尾是指在上游引物的5'端添加10bp 上游加尾序列、15bp上游加尾序列或20bp上游加尾序列，對應(yīng)地在下游引物的5'端添加 l〇bp下游加尾序列、15bp下游加尾序列或20bp下游加尾序列；
[0018] 所述 l〇bp 上游加尾序列為 CTCGGGATTA、GTCGGCATTA、AGCGGAATTA 或 AGCGGGATTA;
[0019] 所述 15bp 上游加尾序列為 TGTTACTCGGGATTA、GGTCAGTCGGCATTA、AGTCAAGCGGAATTA 或GCTCAAGCGGGATTA;
[0020] 所述 20bp 上游加尾序列為 CGCTATGTTACTCGGGATTA、CCCCAGGTCAGTCGGCATTA、 CCCCAAGTCAAGCGGAATTA或CACGAGCTCAAGCGGGATTA;
[0021] 所述 l〇bp 下游加尾序列為 CTGAGAGCAC、CGGTCAGCAC、CTCTCAGCAC 或 CTCAAATCAC;
[0022] 所述 15bp 下游加尾序列為 CACGACTGAGAGCAC、CACGACGGTCAGCAC、CACCACTCTCAGCAC 或CACGACTCAAATCAC;
[0023] 所述 20bp 下游加尾序列為 AGCGGCACGACTGAGAGCAC、TTCGGCACGACGGTCAGCAC、 TTCTGCACCACTCTCAGCAC或TTCTGCACGACTCAAATCAC。
[0024] 更進(jìn)一步地，作為一種可實施的優(yōu)選方案，優(yōu)選地，所述加尾是指在上游引物的5' 端添加 lObp上游加尾序列CTCGGGATTA，在下游引物的5'端添加 lObp下游加尾序列 CTGAGAGCAC；
[0025] 或在上游引物的5'端添加 lObp上游加尾序列GTCGGCATTA，在下游引物的5'端添 加 lObp下游加尾序列CGGTCAGCAC;
[0026] 或在上游引物的5 '端添加 lObp上游加尾序列AGCGGAATTA，在下游引物的5 '端添加 lObp下游加尾序列CTCTCAGCAC;
[0027] 或在上游引物的5 '端添加 lObp上游加尾序列AGCGGGATTA，在下游引物的5 '端添加 1 〇bp下游加尾序列CTCAAATCAC;
[0028]或在上游引物的5'端添加15bp上游加尾序列TGTTACTCGGGATTA，在下游引物的5' 端添加15bp下游加尾序列CACGACTGAGAGCAC;
[0029] 或在上游引物的5'端添加15bp上游加尾序列GGTCAGTCGGCATTA，在下游引物的5' 端添加15bp下游加尾序列CACGACGGTCAGCAC;
[0030] 或在上游引物的5'端添加15bp上游加尾序列AGTCAAGCGGAATTA，在下游引物的5' 端添加15bp下游加尾序列CACCACTCTCAGCAC;
[0031] 或在上游引物的5'端添加15bp上游加尾序列GCTCAAGCGGGATTA，在下游引物的5' 端添加15bp下游加尾序列CACGACTCAAATCAC;
[0032] 或在上游引物的5 '端添加20bp上游加尾序列CGCTATGTTACTCGGGATTA，在下游引物 的5 '端添加20bp下游加尾序列AGCGGCACGACTGAGAGCAC;
[0033] 或在上游引物的5 '端添加20bp上游加尾序列CCCCAGGTCAGTCGGCATTA，在下游引物 的5 '端添加20bp下游加尾序列TTCGGCACGACGGTCAGCAC;
[0034] 或在上游引物的5 '端添加20bp上游加尾序列CCCCAAGTCAAGCGGAATTA，在下游引物 的5'端添加20bp下游加尾序列TTCTGCACCACTCTCAGCAC;
[0035] 或在上游引物的5 '端添加20bp上游加尾序列CACGAGCTCAAGCGGGATTA，在下游引物 的5'端添加20bp下游加尾序列TTCTGCACGACTCAAATCAC。
[0036] 作為另一種可實施的優(yōu)選方案，優(yōu)選地，所述加尾是指在上游引物的5'端添加9bp 上游加尾序列CCACTCCGA，在下游引物的5 '端添加9bp下游加尾序列ACCTGTCGA;
[0037] 或在上游引物的5'端添加13bp上游加尾序列CCGCCCACTCCGA，在下游引物的5'端 添加13bp下游加尾序列CTTGACCTGTCGA;
[0038] 或在上游引物的5'端添加17bp上游加尾序列CCGCCCGCCCACTCCGA，在下游引物的 5'端添加17bp下游加尾序列ACCGCTTGACCTGTCGA。
[0039] 另外，將本發(fā)明上述的5'加尾引物與復(fù)合PCR反應(yīng)條件結(jié)合使用，可進(jìn)一步提高 PCR反應(yīng)的特異性。與普通PCR引物相比，本發(fā)明所述的加尾引物可有效提高PCR反應(yīng)的特 異性但不影響靈敏度，同時引物工作濃度與常規(guī)引物一致甚至更低，在使用常規(guī)PCR反應(yīng)條 件時即可顯著提高PCR特異性。如果部分反應(yīng)特異性仍不理想，則可使用加尾引物結(jié)合復(fù)合 PCR反應(yīng)條件的組合模式來進(jìn)一步提高反應(yīng)特異性。
[0040] 所述復(fù)合PCR反應(yīng)條件必須由一個常規(guī)PCR反應(yīng)條件加高溫的退火和延伸步驟合 并的兩步法PCR條件；第一個循環(huán)階段采取5~10循環(huán)的常規(guī)PCR反應(yīng)條件（必須具備該步 驟，否則會導(dǎo)致兩步法擴增失敗或擴增效率低下），第二個循環(huán)階段采用高溫的退火和延伸 步驟合并的兩步法PCR條件;所述退火和延伸的溫度相同，均為64~79°C。退火合并延伸階 段的反應(yīng)溫度明顯較常規(guī)PCR反應(yīng)條件中的退火溫度高而與延伸溫度接近，具體適宜反應(yīng) 溫度的選擇需通過篩選實驗確定。
[0041 ]另外，作為本發(fā)明方法的舉例驗證，本發(fā)明以EGF