一種吡咯基氟硼二吡咯化合物的合成方法及應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及將微生物合成方法與化學合成方法領(lǐng)域，具體涉及一種吡咯基氟硼二吡咯化合物的合成方法及應用,本發(fā)明中的通過微生物粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens y2發(fā)酵產(chǎn)生的三吡咯化合物，母環(huán)7位為甲氧基，3位為甲基和2位為戊烷基的靈菌紅素（PG）。PG氟硼化后得到的熒光染料4,4?二氟?2?戊烷基?3?甲基?5?吡咯基?7?甲氧基?BODIPY可以透過細胞膜，進入細胞內(nèi)特異染色細胞器。本發(fā)明獲得熒光染料經(jīng)生物合成與化學合成結(jié)合的方案，生產(chǎn)及環(huán)境成本低，熒光結(jié)構(gòu)特異性，并可特異性進入穿透細胞膜染色細胞質(zhì)中細胞器，不與細胞核結(jié)合，無細胞毒性可作為活細胞示蹤熒光染料。CCTCC M 201617620160405
【專利說明】
一種吡咯基氟硼二吡咯化合物的合成方法及應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及將微生物合成方法與化學合成方法緊密結(jié)合，將一種微生物的次級代 謝產(chǎn)物合成為生物學研究用的熒光染料，一種透過細胞膜，可以特異性結(jié)合動物細胞內(nèi)細 胞器的無細胞毒性熒光染料。
【背景技術(shù)】
[0002] 靈菌紅素具有低細胞毒作用，對腫瘤細胞作出多方面的攻擊，濃度大于300nM時具 有明顯的淋巴細胞抑制作用。靈菌紅素對一系列的癌細胞，如肺，結(jié)腸，腎和乳房的癌細胞 系具有促凋亡作用。
[0003] 氟硼吡咯類化合物(B0DIPY)是一類具有剛性結(jié)構(gòu)的有機化合物，因大部分化合物 具有較高的熒光量子產(chǎn)率，較窄的熒光發(fā)射光譜，較好的光熱及化學穩(wěn)定性，較小的分子 質(zhì)量和較低的細胞毒性而促使科研工作者將其研制成化學傳感器，熒光探針，長波熒光染 料等功能性物質(zhì)。
[0004] 關(guān)于B0DIPY的化學合成方法已日益成熟，1988年，Richard等人利用吡咯醛縮合而 成，其他常用方法包括醛與吡咯縮合再氧化配位、酰氯或酸酐與吡咯的縮合配位、吡咯醛自 身縮合配位以及α、β不飽和酮硝化、成環(huán)再縮合，配位等。2012年，焦麗娟等人從吡咯醛 及吡咯出發(fā)合成一系列帶有吡咯基的長波長氟硼二吡咯化合物，很大程度上簡化了反應的 步驟。但以上合成反應無一例外在合成聚吡咯類骨架時都是以醛或吡咯醛類等有毒性有機 化合物為底物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于利用本發(fā)膽所提供的產(chǎn)靈菌紅素的微生物粘質(zhì)沙雷氏菌 ?Serraiia ?arcesce/3s y2出發(fā)，將生物合成與化學合成銜接，以y2為基礎(chǔ)，嘗試新型培養(yǎng)基 大量得到其次級代謝產(chǎn)物靈菌紅素，最大限度提取后（1.1 g/L，柱層析產(chǎn)率）;本發(fā)明篩選 出最佳化學反應條件對其結(jié)構(gòu)進行修飾，得到熒光染料吡咯基氟硼二吡咯化合物。在此過 程中，一步化學反應即可完成B0DIPY的合成，還不使用醛類化合物作為底物，減少了過程反 應中產(chǎn)物的損失，提高了整個過程產(chǎn)率，拓展了合成方法范圍。核磁，質(zhì)譜，紅外確定其結(jié)構(gòu) 后，將其應用于（胃癌BGC-823細胞株)細胞的染色，發(fā)現(xiàn)可以對細胞器進行熒光染色，且對 細胞無毒性。
[0006] 本發(fā)明涉及一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2 (保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中 心;保藏地址：中國武漢，武漢大學;保藏編號:CCTCC Μ 2016176;保藏時間：2016年4月5號， 分類命名為:粘質(zhì)沙雷氏菌Sferraiia ?arcesce/3s y2)，及其產(chǎn)靈菌紅素經(jīng)一步化學反應生 成熒光染料B0DIPY(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧基），該熒光染料具有特 征戊烷基，應用于腫瘤細胞染色能進行細胞膜，與細胞器結(jié)合，不與細胞核結(jié)合;無毒能用 于活細胞示蹤觀察。
[0007] 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,其特征在于:其16 S序列： aggcgctgtcttacacgtgcggtcgagtggtagcacaagggagcttgctcttgggtgacgagcggcggatggg aaagtaatgtctgggaaactggctgatggagggggataactactgtaaacggtagctaagaccgcataacgtcgcaa gacctaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggc tcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactecta cgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggcctt cgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggtggtgagcttaatacgctcatcaattgacgttactcgcagaaga agcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaag cgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatttgaaactggcaagct agagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaa ggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtcc acgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcc tggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaataaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaat tcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaac tctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcgctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccct tatcctttgttgccagcggttcggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgac gtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgttctacaatggcgtatacaaagagaagcgacctcgcga gagcaagcggacctcataaagtaagtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgcta gtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtggg ttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctagcactttgat 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2，其代謝生產(chǎn)靈菌紅素的方法如下： 從保藏斜面培養(yǎng)基（牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化鈣1.1 g/L，瓊脂20 g/L)上挑取 單菌落，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基(牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化鈣1.1 g/L)，28 °C條件下以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)24 h，按5%的接種體積另行擴大培養(yǎng)64 h，250 mL三角瓶培養(yǎng)基裝液 量為100mL。固體培養(yǎng)在直徑9 cm培養(yǎng)皿中進行，吸取種子培養(yǎng)液300 yL，涂布均勻，28 °C 培養(yǎng)24 h，最大得率。
[0008] 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,其產(chǎn)生的靈菌紅素的萃取方法： 將發(fā)酵液1000 Hz離心15 min，收集分為固液兩相，分別加入50 ml乙醇超聲助溶解5 min，再加入25 ml CH2CI2,最后加入25 ml水，待溶液分層后，萃取。
[0009] 當有機相再不能進行進一步的提取時，收集菌體再進行離心，萃取，重復幾次直至 菌體接近無色。液體萃取同樣進行萃取，薄層層析檢測至無靈菌紅素后結(jié)束萃取。有機相收 集干燥，減壓蒸餾等得粗提物，整個過程應注意避光。
[0010]所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,其產(chǎn)生的靈菌紅素的分離純化方法： 濕法裝柱，用CH2C12溶解靈菌紅素粗提物直接上樣。
[0011] 干法裝柱，用CH2C12溶解靈菌紅素粗提物，加入柱層析硅膠，減壓除溶劑，得負載固 體，上樣。洗脫劑為石油醚與二氯甲烷體積比為1/1的混合系，柱層析過程中，靈菌紅素主要 產(chǎn)物呈鮮紅色的條帶，容易區(qū)分。得到的紅色洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45°C減壓濃縮，烘干 后-80°C冷凍過夜，隨后冷凍干燥24h，置于_80°C冰箱中凍存?zhèn)溆谩?br>[0012] 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,以其產(chǎn)生靈菌紅素一步化學反應生成熒光 染料B0DIPY條件： 反應過程:在lOOmL圓底燒瓶中加入靈菌紅素（lmmol)，CH2C12 30mL，攪拌溶解或混合均 勻，再加入三乙胺1.4ml，反應混合物在-10°C下用注射器逐滴加入BF3'Et20 1.4ml，磁力攪 拌反應lOmin后，升溫至30°C，反應4小時后結(jié)束，反應完成后加入蒸餾水淬滅，有機相用 Et20 (3 X 5mL)萃取，無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓濃縮除溶劑。柱層析純化(CH2C12: PE=1: 10)得2(56%)。反應條件篩選，產(chǎn)物用高效液相檢測：C18反相柱(Eclipse plus C18, 4.6 x 1 00mm)，液相條件(H2〇:CH3〇H:PH=2的磷酸緩沖溶液=15:80:5)，ti=2 · 4min，t2=12min。 [0013] 優(yōu)化后反應條件:CH2C12為溶劑，Et3N與BF3'Et 20為10eq，在30°C下反應4小時為最 佳條件來合成目標化合物。
[0014]反應化學式見圖2。 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,以其產(chǎn)生靈菌紅素化學反應所得的B0DIPY(化 合物2)結(jié)構(gòu)特征:經(jīng)核磁共振。^、々、^(^、質(zhì)譜^工外與紫外光譜測試"亥化合物的結(jié)構(gòu)鑒 定4,4_二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧基，是具有立體結(jié)構(gòu)的氟硼化合物（經(jīng) NMR、IR、LC-MS測試），1號氫與8號氫原子相關(guān)，化合物處于順式，具有五烷基。
[0015]所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,以其產(chǎn)生靈菌紅素化學反應所得的B0DIPY (化合物2 )用于細胞染色的方法： 離心收集細胞樣品于1.5 ml離心管內(nèi)，加入lml固定液重懸細胞，4°C固定10分鐘或者 更長時間。離心去固定液，用PBS洗1遍，洗滌期間手動晃動。去上清，加入lml PBS或完全培 養(yǎng)液重懸細胞，再加入5ul濃度為lmg/ml B0DIPY置于37°C染色20-30分鐘。離心去2染料，加 入50-100ul PBS重懸細胞，并去5-10ul滴于潔凈載玻片上，蓋上潔凈蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生 氣泡。熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下檢測。激發(fā)波長為340 nm，480 nnuUV下可持續(xù) lmin,染色1.5 h小時即可持續(xù)30min分鐘。
[0016]在熒光顯微鏡下觀察，B0DIPY(化合物2)染色效果明顯好于PG。但在熒光顯微鏡下 未能分辨出其染色部位。在激光共聚焦顯微鏡對其進行觀察，三種波長下（560 nm、500 nm 和365 nm)，觀察到B0DIPY(化合物2)對BGC-823的細胞器染色清晰;染色結(jié)果在能在顯微鏡 下看到明亮的紅、綠、藍色熒光。不特異性染色細胞核。
[0017] 所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,以其產(chǎn)生靈菌紅素化學反應所得的B0DIPY (化合物2 )對細胞無毒，能用于細胞活性染色，示蹤觀察。
[0018] 不同濃度染色劑PG和B0DIPY(化合物2)對BGC-823細胞存活率的影響，采用 Biotool Cell Counting Kit_8 (CCK-8)試劑盒完成，0.0001-0.01 mg/ml作用濃度范圍 內(nèi)，作用時間為48小時，原反應物靈菌紅素(PG)具有毒性，實驗所選濃度范圍內(nèi)，隨著作用 濃度增大，細胞存活率下降，濃度為〇. 〇lmg/ml時，細胞存活率只有4%;但B0DIPY(化合物2) 未顯不毒性。
【附圖說明】
[0019] 圖1細菌培養(yǎng)時間產(chǎn)色素及存化后PG層析圖（1，混合體系;2,培養(yǎng)時間72 h; 3， PG ) 圖2反應化學式(其中反應物成分1為靈菌紅素 PG;產(chǎn)物化合物2為熒光化合物B0DIPY) 圖3條件篩選的液相圖（表一 Entry 1) 圖4條件篩選的液相圖（表一 Entry 2) 圖5條件篩選的液相圖（表一 Entry 4) 圖6化合物2的立體結(jié)構(gòu) 圖7化合物2的19F NMR，溶劑為CDC13 圖8化合物2的1H NMR，溶劑為CDC13 圖9化合物2的13C NMR，溶劑為CDC13 圖10化合物2的NOESY圖 圖11化合物2的紅外圖 圖12化合物2的LC-MS圖· 圖13化合物2的裂解圖 圖14熒光顯微鏡下化合物1(PG)對細胞的染色效果 圖15熒光顯微鏡下化合物2對細胞的染色效果 圖16激光共聚焦掃描顯微鏡下BODIPY2對細胞的染色效果 圖17 PG和BODIPY(化合物2)對BGC-823細胞存活率的影響。
【具體實施方式】
[0020] 以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0021] 實施例1 (1)粘質(zhì)沙雷氏菌yS^ei-raiia ?a_rcesce/3s y2)的分離鑒定： 本發(fā)明涉及一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2，由2007年5月從南京市郊田野麥田表面分 離獲得，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心;保藏編號:CCTCC Μ 2016176;保藏時間：2016年4 月5號，分類命名為:粘質(zhì)沙雷氏菌ferraiia ?arcescaos y2)，及其產(chǎn)靈菌紅素經(jīng)一步化學 反應生成熒光染料B0DIPY(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧基），該熒光染料 具有特征戊烷基，應用于腫瘤細胞染色能進行細胞膜，與細胞器結(jié)合;無毒能用于活細胞示 蹤觀察。
[0022]所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌y2,其特征在于:其16 S序列： aggcgctgtcttacacgtgcggtcgagtggtagcacaagggagcttgctcttgggtgacgagcggcggatggg aaagtaatgtctgggaaactggctgatggagggggataactactgtaaacggtagctaagaccgcataacgtcgcaa gacctaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggc tcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactecta cgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggcctt cgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggtggtgagcttaatacgctcatcaattgacgttactcgcagaaga agcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaag cgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatttgaaactggcaagct agagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaa ggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtcc acgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcc tggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaataaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaat tcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaac tctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcgctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccct tatcctttgttgccagcggttcggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgac gtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgttctacaatggcgtatacaaagagaagcgacctcgcga gagcaagcggacctcataaagtaagtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgcta gtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtggg ttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctagcactttgat (2)粘質(zhì)沙雷氏菌y2,其代謝生產(chǎn)靈菌紅素的培養(yǎng)方法 從保藏斜面培養(yǎng)基（牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化鈣1.1 g/L，瓊脂20 g/L)上挑取 單菌落，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基(牛肉膏18 g/L，蔗糖20g/L，氯化鈣1.1 g/L)，28 °C條件下以200 r/min的轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)24 h，按5%的接種體積另行擴大培養(yǎng)64 h，250 mL三角瓶培養(yǎng)基裝液 量為100mL。固體培養(yǎng)在直徑9 cm培養(yǎng)皿中進行，吸取種子培養(yǎng)液300 yL，涂布均勻，28 °C 培養(yǎng)24 h(圖1中1、2)。
[0023] (3)粘質(zhì)沙雷氏菌y2產(chǎn)生的靈菌紅素的萃取 將發(fā)酵液1000 Hz離心15 min，收集分為固液兩相，分別加入50 ml乙醇超聲助溶解5 min，再加入25 ml CH2CI2,最后加入25 ml水，待溶液分層后，萃取。
[0024]當有機相再不能進行進一步的提取時，收集菌體再進行離心，萃取，重復幾次直至 菌體接近無色。液體萃取同樣進行萃取，薄層層析檢測至無靈菌紅素后結(jié)束萃取。有機相收 集干燥，減壓蒸餾等得粗提物，整個過程應注意避光。
[0025] (4)粘質(zhì)沙雷氏菌y2產(chǎn)生的靈菌紅素的分離純化 濕法裝柱，用CH2C12溶解靈菌紅素粗提物直接上樣。
[0026]干法裝柱，用CH2C12溶解靈菌紅素粗提物，加入柱層析硅膠，減壓除溶劑，得負載固 體，上樣。洗脫劑為石油醚與二氯甲烷體積比為1/1的混合系，柱層析過程中，靈菌紅素主要 產(chǎn)物呈鮮紅色的條帶，容易區(qū)分。得到的紅色洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中45°C減壓濃縮，烘干 后-80 °C冷凍過夜，隨后冷凍干燥24 h，置于-80 °C冰箱中凍存?zhèn)溆茫▓D1中3)。
[0027] (5)化學反應(反應式1)過程 在100 mL圓底燒瓶中加入1(1 mmol)，CH2Cl2 30 mL，攪拌溶解或混合均勻，再加入三乙 胺1.4 ml，反應混合物在-10 °C下用注射器逐滴加入BF3'Et20 1.4 ml，磁力攪拌反應10 min后，升溫至30 °C，反應4小時后結(jié)束，反應完成后加入蒸餾水淬滅，有機相用Et20 (3X5 mL)萃取，無水硫酸鎂干燥，過濾，減壓濃縮除溶劑。柱層析純化(CH2C12: PE=1:10)得2(56%)。 反應條件篩選（圖3);產(chǎn)物用高效液相檢測:C18反相柱，Eclipse plus C18, 4.6 X 100mm (H2〇:CH3OH:PH=2的磷酸緩沖溶液=15:80:5)，ti=2.4 min，t2=12 min。
[0028] (6)反應物的量篩選過程 首先，我們對反應物的量進行篩選(表1);不添加催化劑三乙胺的話(Entry 5)，發(fā)現(xiàn)反 應不能進行，加入等摩爾的三乙胺與三氟化硼（Entry 1)反應幾乎沒有進行，加入10 eq (Entry 2)反應達到最好（圖4)，但加入20 eq(Entry 3)時反應就開始有所降低。由此，我們 可以得出三乙胺作為吡咯氫的活化劑，需要和三氟化硼相同的量（10 eq)，才能使反應更好 的進行，單獨升高或減少其中一個化合物的量(Entry 4、6)，都不能得到更高的產(chǎn)率。
[0029]反應式1 B0DIPY(化合物2)的合成方法(見圖2) 表1不同反應物的量對產(chǎn)率的影響
[а] 由HPLC所得 (б) 反應溫度、反應時間、溶劑的篩選(表2) 隨后，我們進行了溫度的篩選，在_l〇°C條件下(Entry 1)，不能反應，隨著溫度的升高， 產(chǎn)率也慢慢有所提高(Entry 2、3、4)(圖5)，到30°C產(chǎn)率達到最高(Entry 5)。40 °C時產(chǎn)率 反而下降，雜質(zhì)增多。在確定溫度后又對反應時間進行篩選，得出最佳反應時間為4小時。太 短的反應時間反應產(chǎn)量比較低(Entry 7、8)反應時間延長至6小時(Entry 9)，產(chǎn)率反而有 所下降；特別是延長12小時(Entry 10)，而體系又不加密封時(Entry 11)，生成的氟硼化合 物竟然分解。在進行溶劑的篩選時，我們發(fā)現(xiàn)CH2C12較其它溶劑甲醇，Et 20，EA，CH3⑶CH3 (Entry 12、13、14、15、16)的產(chǎn)率高。最終，我們確定以〇12(：12為溶劑4七必與8? 3飛^0為10 eq，在30 °C下反應4小時為最佳條件來合成目標化合物。
[0030]表2反應條件的篩選
[a]由HPLC所得 實施例2 BODIPY(化合物2)的結(jié)構(gòu)鑒定 與其他文獻不同，我們得到的沙雷氏菌的次級代謝產(chǎn)物靈菌紅素是支鏈為五烷基的靈 菌紅素。在進行氟硼化后，我們甚至可以得到具有立體結(jié)構(gòu)的氟硼化合物（圖6)。分析結(jié)構(gòu) 應用了 NMR、IR、LC-MS測試實驗，如圖7、8、9、10、11、12。就是說1號氫與8號氫原子相關(guān)，化合 物處于順式(圖6，裂解方式見13 )，該成分具有五烷基。
[0031] 實施例3: 染色應用 (1)染色方法 離心收集細胞（胃癌細胞株BGC-823)于1.5 ml離心管內(nèi)，加入1 ml固定液重懸細胞，4 °C固定10分鐘或者更長時間。離心去固定液，用PBS洗1遍，洗滌期間手動晃動。離心去上清， 加入lml PBS或完全培養(yǎng)液重懸細胞，再加入5ul濃度為lmg/ml B0DIPY(化合物2)置于37 °C染色20-30分鐘。離心去染料，加入50-100 ul PBS重懸細胞，并去5-10 ul滴于潔凈載玻 片上，蓋上潔凈蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡，化合物PG的染色方法相同。熒光顯微鏡或激光 共聚焦顯微鏡下檢測。
[0032] (2)染色條件優(yōu)化 在篩選染色條件時，我們發(fā)現(xiàn)細胞與2染色10 min，在熒光顯微鏡UV照射下，不到10 s， 就完全淬滅。染色20 min時，UV下可持續(xù)1 min,染色1.5 h小時即可持續(xù)30min分鐘以上，與 染色2 d效果基本一致。
[0033]如圖15，在熒光顯微鏡，能清楚地觀察它的染色效果（效果明顯好于PG圖14)。但在 熒光顯微鏡下我們不能分辨出其染色部位。于是，我們選擇了激光共聚焦顯微鏡對其進行 觀察，三種激發(fā)波長下（560 nm、500 nm和365 nm)，我們可以清楚地觀察到其對細胞器進行 染色（圖16)。
[0034] (3)PG和B0DIPY(化合物2)細胞毒性實驗 不同濃度染色劑PG和B0DIPY(化合物2)對BGC-8 2 3細胞存活率的影響，采用 BiotoolCellCountingKit-8 (CCK-8)試劑盒完成，在 0.0001-0.01 mg/ml作用濃度范圍 內(nèi)，作用時間為48 h;原反應物靈菌紅素（PG)具有毒性，實驗所選濃度范圍內(nèi)，隨著作用濃 度增大，細胞存活率下降，濃度為0.01 mg/ml時，細胞存活率只有4%;但B0DIPY(化合物2)未 顯示毒性（圖17)。該實驗表明了本發(fā)明中的化合反應使得原反應物PG，這一對腫瘤細胞有 毒性的色素，經(jīng)一步法反應生成的B0DIPY類化合物2，有了熒光染料的特征，其特征還體現(xiàn) 在該染料不但能透過細胞膜進入細胞，特異性染色細胞器，但不特異性著色細胞核;進一 步，其特征還體現(xiàn)在本發(fā)明生成的B0DIPY類化合物2又去除了原反應物PG的細胞毒性，具有 了新的活細胞示蹤染料的特性。
【主權(quán)項】
1. 一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌ferraiia ?arcescaos y2，中國典型培養(yǎng)物保藏中心； 保藏編號:CCTCC M 2016176。2. 權(quán)利要求1所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌《Serraiia ?arcesce/3s y2,其產(chǎn)生的 色素靈菌紅素經(jīng)一步化學反應合成BODIPY類化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯 基-7-甲氧基-B0DIPY)的方法。3. 權(quán)利要求2所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌ferraiia ?arcesce/3s y2,其發(fā)酵產(chǎn) 生色素靈菌紅素用SCN培養(yǎng)基（牛肉膏18 g/L，蔗糖20 g/L，氯化鈣1.1 g/L)最大產(chǎn)率1.1 g/L(柱層析產(chǎn)率)。4. 權(quán)利要求2所述的一株產(chǎn)紅色素粘質(zhì)沙雷氏菌《Serraiia ?arcesce/3s y2,其產(chǎn)生的 色素靈菌紅素經(jīng)一步化學反應合成BODIPY類化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯 基-7-甲氧基-B0DIPY)，其一步化學反應條件為：以CH 2Cl2為溶劑，催化劑Et3N與反應物 BF3'Et20為I Oeq，在30 °C下反應4小時。5. 權(quán)利要求2所述的BODIPY類化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧 基-B0DIPY)具有特征集團戊烷基，能特異性進入穿透細胞膜染色細胞質(zhì)中細胞器，不染色 細胞核。6. 權(quán)利要求2所述的BODIPY類化合物(4，4-二氟-2-戊烷基-3-甲基-5-吡咯基-7-甲氧 基-B0DIPY)對細胞無毒，用于活細胞示蹤熒光染料的用途，用于觀察細胞長期活動的實驗。
【文檔編號】C12R1/43GK105907660SQ201610217491
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月9日
【發(fā)明人】王飛, 羅海瀾, 馬翠云, 游顏杰, 趙麗芳
【申請人】漯河醫(yī)學高等?？茖W校