專利名稱：人源糖基化改造的漢遜酵母的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及人源糖基化改造的漢遜酵母。
背景技術：
越來越多的醫(yī)用疫苗、治療性蛋白、多肽等可以通過基因重組技術生產(chǎn)，并在臨床治療中發(fā)揮著重要作用。其中糖蛋白類藥物是基因工程藥物發(fā)展的主體，其需求不斷地迅速增長。糖蛋白中蛋白是生理功能的主要承擔者，糖鏈則對蛋白的功能起到修飾作用。許多蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)都與糖基化修飾密切相關。糖鏈可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而導致蛋白功能發(fā)生改變。糖基化對于蛋白質(zhì)的折疊、運輸、定位起著重要作用，并參與受體激活、信號轉(zhuǎn)導等諸多重要的生物進程。至今，哺乳動物細胞是唯一能生產(chǎn)類似于人的復雜型糖基修飾的糖蛋白藥物表達系統(tǒng)，但該表達系統(tǒng)成本高，難以放大，嚴重制約了治療性糖蛋白藥物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。酵母作為最簡單的真核生物，雖然具有培養(yǎng)成本低，可高密度發(fā)酵和易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，但它合成的糖蛋白糖基是高甘露糖型結(jié)構(gòu)，這種糖基結(jié)構(gòu)在體內(nèi)存在易被清除、高免疫原性等問題，一般不能作為治療藥物。另外真核生物產(chǎn)生的天然糖蛋白廣泛存在不均一性，即在一種給定的蛋白質(zhì)的同一糖基化位點的聚糖結(jié)構(gòu)有一定范圍的變化，甚至這種不均一性程度在不同的位點、不同的蛋白和不同的細胞之間也有相當大的差異。為確保藥品的藥效、安全性和均一性，重組糖蛋白的糖基化形式也是很重要的。糖蛋白上的糖鏈從連接方式上可分為兩類一類是與天冬氨酸(Asn)殘基連接， 即N-連接糖蛋白；另一類與絲氨酸或蘇氨酸連接，稱為O-連接糖蛋白。由于N-糖鏈位點保守、功能重要，糖基工程的研究目前主要集中在這N糖鏈上。N-糖基化修飾指包含N-乙酰葡萄糖胺殘基的糖鏈與多肽中的天冬酰胺(Asn)殘基的酰胺氮相連接，糖鏈的主要組分包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸。糖基化修飾主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔與翻譯同時進行，并在高爾基體中繼續(xù)反應成N-糖基化蛋白。真核細胞中各種N-糖基化加工都起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，幾乎所有的生物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的糖基化過程都是保守的。其糖鏈通常都會有一個五糖核心Man3GlcNAc2,具有相同的生物合成起源，即高甘露糖聚合前體Man5_9GlcNAc2。該前體并非直接在蛋白質(zhì)上合成出來的，而是在脂質(zhì)載體多萜醇(Dol)上合成寡糖鏈后轉(zhuǎn)運到蛋白質(zhì)受體上。進一步的糖基化發(fā)生在高爾基體，不同真核生物產(chǎn)生不同的糖鏈結(jié)構(gòu)。在哺乳動物細胞，甘露糖苷酶I(a l，2mann0SidaSeI，MnsI)切除多余的甘露糖殘基形成 Man5GlcNAc2 ;再有 N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 I ( β-I, 2-N_acetylglucosaminyltran sferasel, GlcNAcTI)在 α-I, 3_ 臂添加 GlcNAc。由甘露糖昔酶 II/III (mannosidasell/ III，MnsII/III)切除a -1,3-Man和a -1,6-Man分支，由N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 II-VI (N-acetylglucosaminyl transferase II-VI, GlcNAcTII-VI)繼續(xù)添加 GlcNAc 形成二天線型或多天線型結(jié)構(gòu)；最后由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase)、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(galactosyltrnsferase, GalT)、唾液酸轉(zhuǎn)移酶(sialytransferase, ST)添加巖藻糖、半乳糖、和唾液酸形成完整的復雜型N-聚糖。上述各酶依次定位于高爾基體膜上，糖蛋白在從高爾基體運送和向外分泌的過程中逐步被修飾(Helenius 2001)。然而，在酵母中卻發(fā)生了一系列由甘露糖轉(zhuǎn)移酶(mannosyltransferase, MnT)催化的高甘露糖基化反應形成含有9-200個甘露糖殘基的高甘露糖結(jié)構(gòu)。常見的工程酵母中都存在不同程度的高甘露糖基化并且不同的酵母形成的糖鏈組成和結(jié)構(gòu)也不盡相同。雖然畢赤酵母酵母獲得巨大成功，但在漢遜酵母的人源糖基化改造尚未見有成功的案例。多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)是當前國際上公認的理想外源基因表達系統(tǒng)(Gellissen 2000 ；Gellissen,Kunze et al. 2005)。漢遜酵母最適生長溫度高(37 43°C )，生長速率快，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，易于培養(yǎng)，能夠在廉價培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)。多形漢遜酵母能夠按一定的基因劑量比分步整合多個基因，重組菌可按最佳的比例表達所需基因。而且具有遺傳操作簡單、外源基因拷貝數(shù)高、外源蛋白產(chǎn)量高等優(yōu)點，是一個已得到廣泛關注的外源基因表達系統(tǒng)。另外，與釀酒酵母相比，多形漢遜酵母在表達糖蛋白方面具有顯著優(yōu)勢，其連接的糖鏈長度與釀酒酵母(20-100)和畢赤酵母￠-15)相比要短，成份構(gòu)成相對簡單(Cid, Gomis et al. 2000 ；Kim, Kim et al. 2006);其次，酶解分析表明夕卜鏈甘露糖的連接方式主要以α-1-2和α-1-6形式存在，除了前期形成的基本M3糖鏈形式外，幾乎沒有α -1-3連接的甘露糖末端產(chǎn)物出現(xiàn)(0h，Park et al. 2008 ；Song, Qian et al. 2010)。因此我們采用另一方法進行漢遜酵母的糖基化改造，避免了甘露糖苷酶的引入。 我們在原始菌株中過表達反轉(zhuǎn)酶基因(Rftl)的基礎上，敲出漢遜酵母N-糖基化代謝途徑相關基因ALG3、ALGll基因，而不必引入相應的甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因，直接獲得獲得五糖核心Man3GlcNAc2前體(Song, Qian et al. 2010)。由此又篩選有效的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(N-acetylglucosaminyl transferase, GlcNAcT)轉(zhuǎn)入得到的 ALG3 和 ALGll 雙缺陷菌株中得到菌株H. PGNT，此步得到菌株所表達的糖蛋白帶有較為均一的GlCNAC2Man3GlCNAC2。 在本申請中，我們又篩選了合適的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(galactosyltrnsferase, GalT),并按照漢遜酵母密碼子優(yōu)化了部分基因序列。然后，構(gòu)建了 I組巧妙的質(zhì)粒組合，通過篩選標記轉(zhuǎn)入H. pGNT菌株中，得到了 I株基因工程菌株H. pGAL，這株酵母菌表達的糖蛋白帶有 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 形式的糖鏈。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人源糖基化改造的漢遜酵母。本發(fā)明提供了重組質(zhì)粒甲，包括如下功能兀件UGnT基因的表達盒、MMN9基因和 GnTI基因的表達盒、MNN2基因和GnTII基因的表達盒；所述UGnT基因如序列表的序列I自 5’末端第548至1535位核苷酸所示；所述MMN9基因如序列表的序列I自5’末端第2438 至2551位核苷酸所示；所述GnTI基因如序列表的序列I自5’末端第2558至3781位核苷酸所示；所述MNN2基因如序列表的序列I自5’末端第4685至4825位核苷酸所示；所述 GnTII基因如序列表的序列I自5’末端第4832至5899位核苷酸所示。所述UGnT基因的表達盒中，可由序列表的序列I自5’末端第7至541位核苷酸所示的GAP啟動子啟動所述UGnT基因的表達，可由序列表的序列I自5’末端第1559至1896 位核苷酸所示的A0X1TT終止序列終止所述UGnT基因的表達。
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所述MMN9基因和GnTI基因的表達盒中，可由序列表的序列I自5’末端第1903 至2437位核苷酸所示的GAP啟動子啟動所述MMN9基因和所述GnTI基因的表達，可由序列表的序列I自5’末端第3806至4143位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述MMN9基因和所述GnTI基因的表達。所述MNN2基因和GnTII基因的表達盒中，可由序列表的序列I自5’末端第4150 至4684位核苷酸所示的GAP啟動子啟動所述MNN2基因和所述GnTII基因的表達，可由序列表的序列I自5’末端第5924至6261位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述MNN2 基因和所述GnTII基因的表達。所述重組質(zhì)粒甲還可包括篩選基因的表達盒。所述篩選基因具體可為序列表的序列I自5’末端第6747至7562位核苷酸所示的G418基因。所述篩選基因的表達盒中，可由序列表的序列I自5’末端第6268至6678位核苷酸所示的TEFlp啟動子啟動所述篩選基因的表達，可由序列表的序列I自5’末端第7850至8167位核苷酸所示的CYClTT終止序列終止所述篩選基因的表達。所述重組質(zhì)粒甲還包括I3UC ori (復制起始子)。所述I3UC ori具體可如序列表的序列I自5’末端第8178至8851位核苷酸所示。所述重組質(zhì)粒甲具體可如序列表的序列I所示。本發(fā)明提供的重組菌(重組菌乙)為將所述重組質(zhì)粒甲和重組質(zhì)粒乙導入漢遜酵母得到的重組菌；所述重組質(zhì)粒乙包括如下功能元件MNN2基因和GnTII基因的表達盒、 UGT基因的表達盒和UGalE基因的表達盒；所述UGalE基因如序列表的序列2自5’末端第 1164至2231位核苷酸所示；所述UGT基因如序列表的序列2自5’末端第3601至4659位核苷酸所示；所述MNN2基因如序列表的序列2自5’末端第7975位核苷酸至8115位核苷酸所示；所述GnTII基因如序列表的序列2自5’末端第8122至9192位核苷酸所示。所述UGalE基因的表達盒中，可由序列表的序列2自5’末端第623至1157位核苷酸所示的GAP啟動子啟動所述UGalE基因的表達，可由序列表的序列2自5’末端第2256 至2593位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述UGalE基因的表達。所述UGT基因的表達盒中，可由序列表的序列2自5’末端第2600至3600位核苷酸所示的PMAl啟動子啟動所述UGT基因的表達，可由序列表的序列2自5’末端第4684至 5021位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述UGT基因的表達。所述MNN2基因和GnTII基因的表達盒中，可由序列表的序列2自5’末端第7440 至7974位核苷酸所示的GAP啟動子啟動所述MNN2基因和所述GnTII基因的表達，可由序列表的序列2自5’末端第9220至9554位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述MNN2 基因和所述GnTII基因的表達。所述重組質(zhì)粒乙還包括至少一個篩選基因。所述篩選基因具體可為序列表的序列 2自5’末端第5028至7433位核苷酸所示的LEU2基因。所述篩選基因具體還可為序列表的序列2自5’末端第10619至11434位核苷酸所示的G418基因。所述重組質(zhì)粒乙也可同時具有上述兩種篩選基因。所述重組質(zhì)粒乙上還可以具有根據(jù)所述酵母的基因組DNA設計的同源臂，以促進重組的發(fā)生。所述同源臂具體由上游同源臂和下游同源臂組成。所述上游同源臂具體可為序列表的序列2自5’末端第12至616位核苷酸為ALG3-HD片段。所述下游同源臂具體可為序列表的序列2自5’末端第9560至10133位核苷酸為ALG3-HU片段。所述重組質(zhì)粒乙還可包括I3UC ori (復制起始子)。所述I3UC ori具體可如序列表的序列2自5’末端第12050至12723位核苷酸所示。所述重組質(zhì)粒乙具體可如序列表的序列2所示。所述漢遜酵母具體可為敲除ALG3基因(GENBANK ACCESSION NO. DQ193533) 和ALGll基因(GENBANK ACCESSION NO. EF990145)的漢遜酵母，優(yōu)選為漢遜酵母 Hpalg3 AalglI ApRftl0所述ALG3基因和所述ALGll基因均參與N-糖基化代謝途徑。所述重組菌乙可用于制備人源糖基化蛋白。所述人源糖基化蛋白具體可為具有如下糖苷結(jié)構(gòu)的糖蛋白Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。糖蛋白；所述糖蛋白的糖苷結(jié)構(gòu)為Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。所述糖蛋白具體可為 rGOD 蛋白(GENBANK ACCESSION NO. AAA32695)。本發(fā)明還保護將所述重組質(zhì)粒甲導入漢遜酵母得到的重組菌甲。所述漢遜酵母具體可為敲除ALG3基因(GENBANK ACCESSION NO. DQ193533)和ALGll基因 (GENBANKACCESSI0N NO. EF990145)的漢遜酵母，優(yōu)選為漢遜酵母 Hpalg3 Λ algll Λ pRftl。 所述ALG3基因和所述ALGll基因均參與N-糖基化代謝途徑。所述重組菌甲可用于制備糖蛋白；所述糖蛋白的糖苷結(jié)構(gòu)為GlCNAC2Man3GlCNAC2。 所述糖蛋白具體可為rGOD蛋白(GENBANK ACCESSION NO. AAA32695。本發(fā)明提供的工程菌(重組菌乙)表達的糖蛋白所帶糖鏈結(jié)構(gòu)為 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,該糖鏈類似于人類糖蛋白所帶糖鏈結(jié)構(gòu)，因此消除了在野生型酵母表達的蛋白由于高甘露糖鏈所引起的抗原性，可以直接用了生產(chǎn)表達藥用糖蛋白。本發(fā)明提供的質(zhì)粒以及工程菌對于制備人源糖基化蛋白具有重大價值。


圖I為重組質(zhì)粒甲的結(jié)構(gòu)示意圖譜。圖2為重組質(zhì)粒乙的結(jié)構(gòu)示意圖譜。圖3為工程菌株表達的糖蛋白的糖鏈質(zhì)譜(MALDI-T0F MS)分析結(jié)果；A :對照菌表達的rGOD的糖鏈結(jié)構(gòu)；B:重組菌pGNT-rGOD表達的rGOD的糖鏈結(jié)構(gòu)；C:重組菌
H.pGAL-rGOD表達的rGOD的糖鏈結(jié)構(gòu)。圖4為人源糖基化改造菌株分泌表達的重組葡萄糖氧化酶糖蛋白(rGOD)的 SDS-PAGE電泳圖；泳道I :對照菌表達的rGOD ;泳道2 H. pGAL菌表達的rGOD ;泳道3 :對照菌表達的rGOD被糖苷酶F酶切后的產(chǎn)物；泳道4 H. pGAL菌表達的rGOD被糖苷酶F酶切后的產(chǎn)物。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AH109 菌株購自 clontech 公司。
人肝臟Marathon-Ready cDNA (Human Liver Marathon-Ready cDNA)購自 clontech公司，產(chǎn)品編號為639307。乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iacti):購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC 編號為 2. 1494。大鼠肝臟Marathon-ready cDNA (rat-liver Marathon-ready cDNA)購自 clontech公司，產(chǎn)品編號為639413。果妮cDNA 文庫(Drosophila melanogaster)，又稱 Insect cDNA Library:購自安捷倫科技有限公司(中國)(Agilent Technologies)，產(chǎn)品編號為937602。巴斯德畢赤酵母GSl 15 :購自invitrogen公司。栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe):購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC編號為2. 1630。質(zhì)粒pUG73 :帶有釀酒酵母LEU2篩選標記，購自Euroscarf (Frankfurt, Germany ；http //web. uni-frankfurt. de/fbl5/mikro/euroscarf/data/pUG73. html)(見 Giildener, U.，Heinisch，J.，Kohler G. J.，Voss, D.，and Hegemann, J. H. 2002 A second set of IoxP marker cassettes for Cre—mediated multiple gene knockoutsin budding yeast. Nucleic Acids Research 30，e23)，產(chǎn)品目錄號為P30118，公眾也可從中國科學院微生物研究所獲得。載體pHGAPGA :公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得；參考文獻宋厚輝，漢遜酵母表達系統(tǒng)技術平臺的建立和口蹄疫新型粘膜免疫疫苗的研究，中國科學院微生物所博士論文，2005。漢遜酵母NCYC495 (LEU1. I):是一種亮氨酸營養(yǎng)缺陷型的多型漢遜酵母，公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得；參考文獻leeSOn，Μ.，G. Ortori, et al. (1986). " Transformation of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. " Journal ofGeneral Microbiology 132(12) :3459-3465.。漢遜酵母Hpalg3AalgllApRftl :敲除了 ALG3 和 ALGll 的漢遜酵母，公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得；參考文獻Song，H.，W. Qian, et al. (2010). " Identification and functional characterization of the HpALGlI and the HpRFTlgenes involved in N-Iinked glycosylation in the methylotrophic yeast HansenuIapoIymorpha. " Glycobiology 20(12) 1665-1674.。質(zhì)粒pHFMDZ a L2-rG0D :能表達糖蛋白rGOD，公眾可以從中國科學院微生物研究所獲得；參考文獻Song，H.，W. Qian, et al. (2010). " Identification and functionalcharacterization of the HpALGl I and the HpRFTl genes involved in N-Iinkedglycosylation in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. " GlycobioloRy20(12) 1665-1674.。SD培養(yǎng)基0. 17%無氨基酸酵母氮源(YNB W/0 Amino acid，BD/Difco培養(yǎng)基，產(chǎn)品編號:291920),0. 5%硫酸銨，2%葡萄糖。YNG培養(yǎng)基0. 17%無氨基酸酵母氮源(YNB W/0 Amino acid，BD/Difco培養(yǎng)基， 產(chǎn)品編號:291920),0. 5%硫酸銨，2%甘油。實施例I、重組質(zhì)粒甲和工程菌甲的構(gòu)建
一、重組質(zhì)粒甲的構(gòu)建重組質(zhì)粒pGNT(又稱重組質(zhì)粒甲)的結(jié)構(gòu)示意圖見圖I。重組質(zhì)粒pGNT的核苷酸序列如序列表的序列I所示。序列I中，自5’末端第I至6位核苷酸為BglII酶切識別序列、第7至541位核苷酸為GAP啟動子、第548至1535位核苷酸為UGnT基因、第1559 至1896位核苷酸為AOXlTT終止序列、第1903至2437位核苷酸為GAP啟動子、第2438至 2551位核苷酸為MMN9基因、第2558至3781位核苷酸為GnTI基因、第3806至4143位核苷酸為AOXlTT終止序列、第4150至4684位核苷酸為GAP啟動子、第4685至4825位核苷酸為MNN2基因、第4832至5899位核苷酸為GnTII基因、第5924至6261位核苷酸為AOXlTT 終止序列、第6268至6678位核苷酸為TEFlp啟動子、第6747至7562位核苷酸為G418抗性篩選基因、第7850至8167位核苷酸為CYClTT終止序列、第8178至8851位核苷酸為PUC ori (復制起始子)。重組質(zhì)粒pGNT可采用任何現(xiàn)有方法制備。本專利中采用以下步驟制備I、重組質(zhì)粒pHGAPG-MNN9的構(gòu)建(I)以釀酒酵母AH109菌株的基因組DNA為模板，采用MNN9-U和MNN9-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(MNN9基因，約114bp)。MNN9-U:5’ -ATGTCACTTTCTCTTGTATCGT-3’ ；MNN9-D 5，~GGGGAATTCAGATTGATCTCTCTGGAAA~3，(下劃線標注 EcoRI 酶切位點)。(2)以載體pHGAPGA為模板，采用GAP-U和GAP-MNN9組成的弓I物對進行PCR擴增， 得到PCR擴增產(chǎn)物(GAP啟動子)。GAP-U 5 ’ -TTTGCAAGCAGCAGATTACGC-3 ’(此引物序列在 GAP 啟動子的外側(cè)，與 gap 啟動子之間有BglII酶切位點);GAP-MNN9 :5’ -GATACAAGAGAAAGTGACATGGTGTTTCTATATTAT-3’。(3)同時以步驟⑴和步驟⑵的PCR產(chǎn)物為模板，采用引物GAP-U和MNN9-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(GAP-MNN9融合基因)(4)用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI雙酶切步驟(3)的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(5)用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI雙酶切載體pHGAPGA，回收約3. Ikb的載體骨架。(6)將步驟(4)的酶切產(chǎn)物和步驟(5)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 PHGAPG-MNN9。2、重組質(zhì)粒pHGAPG-UGnT的構(gòu)建(I)以乳酸克魯維酵母的基因組DNA為模板，采用UGnT-U和UGnT-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(UGnT基因，約O. 98kb)。UGnT-U :5’ -GGGCTGCAGATGAGTTTTGTATTGATT-3，(下劃線標注 PstI 酶切位點);UGnT-D :5’ -AAAGTCGACTCAGCGAGGCAGTGCAGT-3，(下劃線標注 SalI 酶切位點)。(2)用限制性內(nèi)切酶PstI和SalI雙酶切步驟⑴的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶PstI和Sal I雙酶切載體pHGAPGA，回收約3. 6kb的載體骨架。(4)將步驟⑵的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pHGAPG-UGnTο3、重組質(zhì)粒pHGAPG-GnTI的構(gòu)建(I)以人肝臟Marathon-Ready cDNA為模板，采用GnTI-U和GnTI-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(GnTI基因，約I. 2kb)。GnTI-U :5’ -GGTGAATTCTCAGTCAGCGCTCTCGAT-3，(下劃線標注 EcoRI 酶切位點);GnTI-D :5’ -GGTGTCGACCTAATTCCAGCTAGGATC-3，(下劃線標注 SalI 酶切位點)。(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切步驟⑴的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pHGAPG_MNN9，回收約3. 7kb 的載體骨架。(4)將步驟⑵的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pHGAPG-GnTI。4、載體 pHGAPG-MNN2 的構(gòu)建(I)以釀酒酵母AH109菌株的基因組DNA為模板，采用MNN2-U和MNN2-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(MNN2基因，約141bp)。MNN2-U:5， -CATGCTGCTTACCAAAAGGTT-3，；MNN2-D 5，~GGGGAATTCATATCTGTCTAAGTACTCC~3，(下劃線標注 EcoRI 酶切位點)。(2)以載體pHGAPGA為模板，采用GAP-U和GAP-MNN2組成的引物對進行PCR擴增， 得到PCR擴增產(chǎn)物(GAP啟動子)。GAP-MNN2 :5’ -AACCTTTTGGTAAGCAGCATGGTGTTTCTATATTAT-3’。(3)同時以步驟⑴和步驟⑵的PCR產(chǎn)物為模板，采用引物GAP-U和MNN2-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(GAP-MNN2融合基因)(4)用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI雙酶切步驟(3)的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(5)用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI雙酶切載體pHGAPGA，回收約3. Ikb的載體骨架。(6)將步驟(4)的酶切產(chǎn)物和步驟(5)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pHGAPG-MNN205、重組質(zhì)粒pHGAPG-GnTII的構(gòu)建(I)以大鼠肝臟Marathon-ready cDNA為模板,米用GnTII-U和GnTII-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(GnTII基因，約I. Okb)。GNTII-U :5’ -CCGGAATTCTCCCTAGTGTACCAGTTGAAC-3> (下劃線標注 EcoRI 酶切位點)；GNTII-D :5’ -GGGGTCGACTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3’(下劃線標注 SalI 酶切位點)。(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切步驟⑴的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pHGAPG_MNN2，回收約3. 7k的載體骨架。
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(4)將步驟⑵的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pHGAPG-GnTIL·6、重組質(zhì)粒pGNT的構(gòu)建(I)用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pHGAPG-GnTI，回收約2. 2kb 的片段(自上游至下游依次含有GAP啟動子、MNN9基因、GnTI基因和AOXlTT終止序列)。(2)用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pHGAPG-GnTII，回收約2. Okb 的片段(自上游至下游依次含有GAP啟動子、MNN2基因、GnTII基因和AOXlTT終止序列)。(3)用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切重組質(zhì)粒pHGAPG-UGnT，回收約4. 5kb的片段并進行脫磷酸化。(4)將步驟⑴回收的片段與步驟(3)回收的片段連接，得到重組質(zhì)粒pGNTI。(5)用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切重組質(zhì)粒pGNTI，回收約6. 8kb的片段并進行脫磷酸化。(6)將步驟⑵回收的片段與步驟(5)回收的片段連接，得到重組質(zhì)粒pGNT。二、工程菌甲的構(gòu)建I、用限制性內(nèi)切酶BglII酶切重組質(zhì)粒pGNT，回收約8. 8kb的片段。2、將步驟I的片段采用電穿孔法(電擊參數(shù)為I. Okv, 100 Ω，50 μ F)轉(zhuǎn)化漢遜酵母Hpalg3 Λ algll Λ pRftl，得到重組酵母H. pGNT (又稱工程菌甲)。重組酵母H. pGNT進行三次PCR鑒定，第一次PCR鑒定采用GnTI-U和GnTI-D組成的引物對、第二次PCR鑒定采用GnTII-U和GnTII-D組成的引物對、第三次PCR鑒定采用 UGnT-U和UGnT-D組成的引物對，三次PCR鑒定結(jié)果均為陽性。實施例2、重組質(zhì)粒乙和工程菌乙的構(gòu)建一、重組質(zhì)粒乙的構(gòu)建重組質(zhì)粒PGAL2 (又稱重組質(zhì)粒乙)的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。重組質(zhì)粒PGAL2的核苷酸序列如序列表的序列2所示。序列2中，自5’末端第6至11位核苷酸為SnaBI酶切識別序列、第12至616位核苷酸為ALG3-HD片段(同源臂)、第623至1157位核苷酸為GAP 啟動子、第1164至2231位核苷酸為UGalE基因、第2256至2593位核苷酸為AOXlTT終止序列、第2600至3600位核苷酸為PMAl啟動子、第3601至4659位核苷酸為UGT基因、第 4684至5021位核苷酸為AOXlTT終止序列、第5028至7433位核苷酸為LEU2基因、第7440 至7974位核苷酸為GAP啟動子、第7975位核苷酸至8115位核苷酸為MNN2基因、第8122 至9192位核苷酸為GalTI基因、第9220至9554位核苷酸為AOXlTT終止序列、第9560至 10133位核苷酸為ALG3-HU片段(同源臂)、第10619至11434位核苷酸為G418抗性篩選基因、第12050至12723位核苷酸為I3UC ori (復制起始子)。重組質(zhì)粒pGNT可采用任何現(xiàn)有方法制備。本專利中采用以下步驟制備I、重組質(zhì)粒pHPMAl的構(gòu)建(I)以巴斯德畢赤酵母GSl 15的基因組DNA為模板，采用PMAl-U和PMAl-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(PMA1啟動子)。PMAl-U :5’ -GGGAGATCTATTCAAGCGAATGAGAATAATG-3> (下劃線標注 BglII 酶切位點)；PMAl-D : 5 ’ -TTGAATTCGCGGCCGCGAAGTTTTTAAAGGAAAGAGAT-3 ’ (下劃線標注 EcoRI酶切位點)。(2)用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI雙酶切步驟(I)的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶BglII和EcoRI雙酶切載體pHGAPGA，回收約3. Ikb的載體骨架。(4)將步驟⑵的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pHPMAl。2、重組質(zhì)粒pHPMAl-UGT的構(gòu)建(I)以果蠅cDNA文庫為模板，采用UGT-U和UGT-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(UGT基因，約I. Okb)。UGT-U 5 ’ -TTTGCGGCCGCATGAACGCCAATACGCTGAAG-3 ’(下劃線標注 NotI 酶切位點)；UGT-D :5’ -TTTGTCGACCTAGACGCGCGGCAGCAGCT-3> (下劃線標注 SalI 酶切位點)。(2)用限制性內(nèi)切酶NotI和SalI雙酶切步驟⑴的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶NotI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pHPMAl，回收約4. Okb的載體骨架。(4)將步驟⑵的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pHPMAl-UGTο3、重組質(zhì)粒pHGAPG-GalE的構(gòu)建(I)以栗酒裂殖酵母的cDNA為模板，采用UGalE-U和UGalE-D組成的引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(UGalE基因，約I. Ikb)。UGalE-U :5’ -GGGGAATTCATGACTGGTGTTCATGAAG-3’ (下劃線標注 EcoRI 酶切位點)；UGalE-D 5，-TTTGTCGACTTACTTATATGTCTTGGTAT-3，(下劃線標注 SalI 酶切位點)。(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切步驟(I)的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切載體pHGAPGA，回收約3. 6kb的載體骨架。(4)將步驟⑵的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pHGAPG-UGalE。4、重組質(zhì)粒pHGAPG-GalTI的構(gòu)建(I)以人肝臟Marathon-Ready cDNA為模板，采用GalTI-U和GalTI-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(GalTI基因，約I. Okb)。GalTI-U :5’ -TTTGAATTCATGGGCCGCGACCTGAGCCG-3’(下劃線標注 EcoRI 酶切位點)；GalTI-D 5，-TTTGTCGACCTAGCTCGGTGTCCCGATGT-3，(下劃線標注 SalI 酶切位點)。(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切步驟⑴的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pHGAPG_MNN2，回收約3. 7kb的載體骨架。(4)將步驟⑵的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pHGAPG-GalTI。5、重組質(zhì)粒pGAL的構(gòu)建(I)以質(zhì)粒pUG73為模板，采用LEU2-U和LEU2組成的引物對進行PCR擴增，得到 PCR擴增產(chǎn)物(LEU2基因，約2. 4kb)。LEU2-U 5，-GGAAGATCTGTATGCTTCCGGCTCGTATG-3’(下劃線標注 BglII 酶切位點)；LEU2-D 5 ’ -GCGGGATCCAAATGAAACAACCGCTGATG-3 ’ (下劃線標注 BamHI 酶切位點)。(2)用限制性內(nèi)切酶BamHI和BglII雙酶切步驟(I)的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶BglII單酶切重組質(zhì)粒pHGAPG-GalTI，脫磷酸化后回收約 4. 8kb的載體骨架。(4)將步驟⑵的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pHGAPG-GalTI-LEU2。(5)用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pHGAPG-UGalE，回收約2. Ikb 的片段(自上游至下游依次含有GAP啟動子、UGalE基因和AOXlTT終止序列)。(6)用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒pHPMAl-UGT，回收約2. 4kb 的片段(自上游至下游依次含有PMAl啟動子、UGT基因和AOXlTT終止序列)。(7)用限制性內(nèi)切酶BglII酶切重組質(zhì)粒pHGAPG-GalTI_LEU2，回收約7. 2kb的片段并進行脫磷酸化。(8)將步驟(6)的片段和步驟(7)的片段連接，得到重組質(zhì)粒 pHGAPG-GaITI-LEU2-UGT。(9)用限制性內(nèi)切酶BglII酶切重組質(zhì)粒pHGAPG-GalTI-LEU2-UGT，回收約9. 6kb 的片段并進行脫磷酸化。(10)將步驟(9)的片段和步驟(5)的片段連接，得到重組質(zhì)粒pGAL。6、重組質(zhì)粒pGAL2的構(gòu)建為了使重組質(zhì)粒pGAL在漢遜酵母中能有效的整合，在載體加入整合同源臂，具體方法如下(I)根據(jù)漢遜酵母ALG3基因序列設計如下引物ALG3-A 5 ’ -GGGAGATC TACGTA TGGGCGATATCAAGTTTG-3 ’ (下劃線標注 Bgl 11 酶切位點，斜體標注SnaBI酶切位點);ALG3-B :5’ -TTTGGATCCAACAACTGTGCGCTGAAAAAGGTG-3> (下劃線標注 BamHI 酶切位點)；ALG3-C 5’ -TTTAGATCTGCAGGCAGGCATTAACTGGGA-3’(下劃線標注 BglII 酶切位點)；ALG3-D . 5 >-TTTGGATCC TACGTA TCCTGTTTGGGTTTGCCG-3 (下劃線標注 BamHI 酶切位點，斜體標注SnaBI酶切位點)。(2)以漢遜酵母NCYC495(LEU1. I)的基因組DNA為模板，采用ALG-A和ALG-B組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(ALG3-HU片段)。(3)以漢遜酵母NCYC495(LEU1. I)的基因組DNA為模板，采用ALG-C和ALG-D組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物(ALG3-HD片段)。(4)用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI酶切步驟⑵的PCR擴增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物。(5)用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切重組質(zhì)粒pGAL，回收約11. 7kb的片段并進行脫磷酸化。(6)將步驟(4)的酶切產(chǎn)物和步驟(5)的片段連接，得到重組質(zhì)粒PGALl。(7)用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI酶切步驟(3)的PCR擴增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物。(8)用限制性內(nèi)切酶BglII酶切重組質(zhì)粒pGALl，回收約12. Ikb的片段并進行脫
磷酸化。(9)將步驟(7)的酶切產(chǎn)物和步驟⑶的片段連接，得到重組質(zhì)粒PGAL2。二、工程菌乙的構(gòu)建I、用限制性內(nèi)切酶SnaBI酶切重組質(zhì)粒PGAL2，回收約IOkb的片段。2、將步驟I的片段采用電穿孔法(電擊參數(shù)為1.01 ν，100Ω，50μΡ)轉(zhuǎn)化工程菌甲，得到重組酵母H. pGAL(又稱工程菌乙)。重組酵母H. pGAL進行三次PCR鑒定，第一次PCR鑒定采用UGT-U和UGT-D組成的引物對、第二次PCR鑒定采用GalTI-U和GalTI-D組成的引物對、第三次PCR鑒定采用 UGalE-U和UGalE-D組成的引物對，三次PCR鑒定結(jié)果均為陽性。實施例3、工程菌表達的糖蛋白的純化與鑒定I、將質(zhì)粒pHFMDZ a L2_rG0D導入工程菌甲，得到重組菌H. pGNT-rGOD。2、將質(zhì)粒pHFMDZ a L2_rG0D導入工程菌乙，得到重組菌H. pGAL-rGOD。3、將質(zhì)粒pHFMDZ a L2_rG0D導入漢遜酵母Hpalg3 Λ algll Λ pRftl，得到對照菌。4、分別將步驟I得到的重組菌H. pGNT-rGOD、步驟2得到的重組菌H. pGAL-rGOD和步驟3得到的對照菌進行如下實驗(I) rGOD蛋白的誘導表達①接種工程菌單菌落到含有5mL SD培養(yǎng)基的試管中，30°C培養(yǎng)48h ;然后轉(zhuǎn)接到含有50mL YNG培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C培養(yǎng)32小時(30_35h均可);②轉(zhuǎn)接IOOmL步驟①得到的培養(yǎng)物至含有450mL YPG培養(yǎng)基的5L三角瓶中，30°C 培養(yǎng)30h(菌體0D_ > I. 5)，然后加入作為誘導劑的甲醇(使甲醇的在培養(yǎng)體系中的體積百分含量為0. 5% ) ;25°C培養(yǎng)84小時(72-90h均可)，每6小時(4_8h均可)檢測甲醇濃度并補加甲醇，使甲醇的在培養(yǎng)體系中的體積百分含量為0.5%。(2)將完成步驟⑴的培養(yǎng)體系離4°C心并收集上清液，使用賽多利斯 (Sartorius)公司的Vivaf low50濃縮裝置濃縮上清液至50_100mL之內(nèi)(大約10倍)，高速離心去掉沉淀過0. 22濾膜后保存待用，即為樣品濃縮液。(3)將步驟⑵得到的樣品濃縮液使用GE公司的HisTrap FF Columns (產(chǎn)品目錄號為:17-5319-01)純化rGOD蛋白。①平衡HisTrap FF Columns
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安裝好純化柱后，首先用去離子水沖洗3-5個柱體積，然后用PBS緩沖液(pH = 7. 4,0. 01M)平衡5個柱體積。②上樣將樣品濃縮液用蠕動泵上柱，速率控制在lml/min。③洗脫雜蛋白用含20mM咪唑的PBS緩沖液(pH = 7. 4、0. 01M)沖洗5個柱體積，速率控制在Iml/ min。④洗脫rGOD蛋白用含300mM咪唑的PBS緩沖液(pH = 7. 4,0. 01M)洗脫柱子，流速控制在O. 5mL/ min,過柱后溶溶液，即為純化后的rGOD蛋白。5、將收集的rGOD蛋白用內(nèi)切-β-Ν-乙酰葡萄糖胺的糖苷酶F(PNGase F ； NewEngland Biolabs)酶切(從糖蛋白上切下糖鏈)，通過MALDI-T0F分析糖鏈結(jié)構(gòu)，具體步驟如下①取純化后的rGOX 蛋白樣品 500μ 1，加入 55μ L IOXDenatuing Buffer(5% SDS，4M DTT)，沸水浴5min ；自然冷卻至室溫。②步驟①的樣品400ul,加入 50ul 10XReaction Buffer (0. 5M憐酸鈉，pH = 7· 5， 25°C )和 50ul 10% NP-40，混合均勻后加入 5 μ L PNGase F，37°C水浴反應 16h。③將步驟②的產(chǎn)物中加入4倍體積的冷丙酮進行沉淀，-20°C放置20min，然后 12，000r/min離心lOmin，收集沉淀，室溫下晾干丙酮,然后再加入冷的60%甲醇，渦旋混勻，_20°C放置過夜。④將步驟③的產(chǎn)物12，000r/min離心lOmin，收集上清液并再次12，000r/min離心 IOmin,收集上清液并真空冷凍干燥,得到沉淀物。⑤將步驟④得到的沉淀物溶于15ul純水，然后通過MALDI-T0F分析糖鏈結(jié)構(gòu)。取樣品和DHB基質(zhì)(IOmg 2, 5_ 二輕基苯甲酸溶于ImL超純水中)I : I混合物
O.SuL點于不銹鋼靶板上，自然揮發(fā)結(jié)晶。送入基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀 ABI4700中進行檢測(型號ABI 4700MALDI T0F-T0F)進行檢測，激光源波長355nm，重復頻率200Hz，加速電壓20kv，選擇陽離子反射模式，分子量掃描范圍為899-2509m/z。MS數(shù)據(jù)用 Data Explorer Version 4· 3 軟件(Applied Biosystems, Framingham, MA)來分析。對照菌分泌得到的rGOD蛋白的糖鏈的質(zhì)譜圖，見圖3A。其中圖譜峰圖指示了糖苷的分子量大小，分別為933. 2559和1095. 2960。這分別是Man3GlcNAc2和Man_4GlcNAc2的分子量大小。因此對照菌分泌得到的rGOD蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)為Man3_4GlcNAc2。重組菌pGNT-rGOD分泌得到的rGOD蛋白的糖鏈的質(zhì)譜圖見圖3B，圖譜峰圖顯示的糖苷分子量大小為1339. 3994，此分子量的糖苷結(jié)構(gòu)為GlcNAc2Man3GIcNAc2。重組菌H. pGAL-rGOD分泌得到的rGOD蛋白的糖鏈的質(zhì)譜圖為圖3C，圖譜峰圖顯示的糖苷分子量大小為1663. 5177，此分子量的糖苷結(jié)構(gòu)為Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。重組菌H. pGAL-rGOD純化后上清的電泳圖見圖4。
1權利要求
1.重組質(zhì)粒甲，包括如下功能元件=UGnT基因的表達盒、MMN9基因和GnTI基因的表達盒、MNN2基因和GnTII基因的表達盒；所述UGnT基因如序列表的序列I自5’末端第548 至1535位核苷酸所示；所述MMN9基因如序列表的序列I自5’末端第2438至2551位核苷酸所示；所述GnTI基因如序列表的序列I自5’末端第2558至3781位核苷酸所示；所述 MNN2基因如序列表的序列I自5’末端第4685至4825位核苷酸所示；所述GnTII基因如序列表的序列I自5’末端第4832至5899位核苷酸所不。
2.如權利要求I所述的重組質(zhì)粒甲，其特征在于所述UGnT基因的表達盒中，由序列表的序列I自5’末端第7至541位核苷酸所示的 GAP啟動子啟動所述UGnT基因的表達，由序列表的序列I自5’末端第1559至1896位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述UGnT基因的表達；所述MMN9基因和GnTI基因的表達盒中，由序列表的序列I自5’末端第1903至2437 位核苷酸所示的GAP啟動子啟動所述MMN9基因和所述GnTI基因的表達，由序列表的序列 I自5’末端第3806至4143位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述MMN9基因和所述 GnTI基因的表達；所述MNN2基因和GnTII基因的表達盒中，由序列表的序列I自5’末端第4150至4684 位核苷酸所示的GAP啟動子啟動所述MNN2基因和所述GnTII基因的表達，由序列表的序列 I自5’末端第5924至6261位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述MNN2基因和所述 GnTII基因的表達。
3.如權利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒甲如序列表的序列I所示。
4.重組菌乙，是將權利要求I至3中任一所述重組質(zhì)粒甲以及重組質(zhì)粒乙導入漢遜酵母得到的重組菌；所述重組質(zhì)粒乙包括如下功能元件MNN2基因和GnTII基因的表達盒、 UGT基因的表達盒和UGalE基因的表達盒；所述UGalE基因如序列表的序列2自5’末端第 1164至2231位核苷酸所示；所述UGT基因如序列表的序列2自5’末端第3601至4659位核苷酸所示；所述MNN2基因如序列表的序列2自5’末端第7975位核苷酸至8115位核苷酸所示；所述GnTII基因如序列表的序列2自5’末端第8122至9192位核苷酸所示。
5.如權利要求4所述的重組菌乙，其特征在于所述UGalE基因的表達盒中，由序列表的序列2自5’末端第623至1157位核苷酸所示的GAP啟動子啟動所述UGalE基因的表達，由序列表的序列2自5’末端第2256至2593 位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述UGalE基因的表達；所述UGT基因的表達盒中，由序列表的序列2自5’末端第2600至3600位核苷酸所示的PMAl啟動子啟動所述UGT基因的表達，由序列表的序列2自5’末端第4684至5021位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述UGT基因的表達；所述MNN2基因和GnTII基因的表達盒中，由序列表的序列2自5’末端第7440至7974 位核苷酸所示的GAP啟動子啟動所述MNN2基因和所述GnTII基因的表達，由序列表的序列 2自5’末端第9220至9554位核苷酸所示的AOXlTT終止序列終止所述MNN2基因和所述 GnTII基因的表達。
6.如權利要求5所述的重組菌乙，其特征在于所述重組質(zhì)粒乙如序列表的序列2所示。
7.權利要求4或5或6所述重組菌乙在制備人源糖基化蛋白中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述人源糖基化蛋白為具有如下糖苷結(jié)構(gòu)的糖蛋白 Gal2GlcNAc2Man3G I cNAc2。
9.重組菌甲，是將權利要求I至3中任一所述重組質(zhì)粒甲導入漢遜酵母得到的重組菌。
10.權利要求9所述重組菌甲在制備糖蛋白中的應用；所述糖蛋白的糖苷結(jié)構(gòu)為 GlcNAc2Man3GlcNAc2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源糖基化改造的漢遜酵母。本發(fā)明提供了將重組質(zhì)粒甲和乙導入漢遜酵母得到的重組菌。重組質(zhì)粒甲包括UGnT基因的表達盒、MMN9基因和GnTI基因的表達盒、MNN2基因和GnTII基因的表達盒；UGnT基因如序列1第548至1535位所示；MMN9基因如序列1第2438至2551位所示；GnTI基因如序列1第2558至3781位所示；MNN2基因如序列1第4685至4825位所示；GnTII基因如序列1第4832至5899位所示。重組質(zhì)粒乙包括MNN2基因和GnTII基因的表達盒、UGT基因的表達盒和UGalE基因的表達盒；UGalE基因如序列2第1164至2231位所示；UGT基因如序列2第3601至4659位所示。本發(fā)明提供的重組菌對制備人源糖基化蛋白具有重大價值。
文檔編號C12N1/19GK102586316SQ201210035318
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月16日 優(yōu)先權日2012年2月16日
發(fā)明者王輝, 邱并生 申請人:中國科學院微生物研究所