Na,K-ATP酶的α2亞型的選擇性抑制劑和用于降低眼內(nèi)壓的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及地高辛和洋地黃毒苷衍生物，其為Na,K?ATP酶的α2亞型的選擇性抑制劑，并且其降低眼內(nèi)壓。本發(fā)明進一步涉及這些衍生物用于治療與眼內(nèi)壓升高相關(guān)的病狀，諸如青光眼，和/或作為強心劑的用途。
【專利說明】Na,K-ATP酶的〇t2亞型的選擇性抑制劑和用于降低眼內(nèi)壓的 用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及地高辛(digoxin)和洋地黃毒苷(digitoxin)衍生物，其為Na,K-ATP酶 的a2亞型的選擇性抑制劑，并且其降低眼內(nèi)壓。本發(fā)明進一步涉及這些衍生物用于治療與 眼內(nèi)壓升高相關(guān)的病狀，諸如青光眼，和/或作為強心劑的用途。
[0002] 發(fā)明背景 青光眼是導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的失明的疾病。眼內(nèi)壓（I0P)的控制是當(dāng)前青光眼治療的主體， 并且通過局部或全身給予各種藥物，諸如阻滯劑、前列腺素類似物、a2腎上腺素能受體激 動劑、膽堿能激動劑和碳酸酐酶抑制劑來實現(xiàn)。如果藥物能有效地透過角膜，局部途徑是優(yōu) 選的，因為這使全身性副作用降到最低。盡管有可用的藥物選擇，但許多患者的I0P失控最 終使手術(shù)干預(yù)成為必要。因此，青光眼藥物治療的新方法是非常需要的。
[0003] Na，K-ATP酶是睫狀體上皮中房水產(chǎn)生的發(fā)動機(motor)，并且原則上，Na，K-ATP酶 的抑制應(yīng)抑制房水的產(chǎn)生，并控制I0PJ0P的控制是青光眼治療的主體，但盡管有可用的藥 物選擇，但藥物治療的新方法是非常需要的。以前，靜脈注射地高辛，一種Na，K-栗的經(jīng)典抑 制劑，主要用于治療充血性心力衰竭，由于這種作用而被考慮但由于全身毒性而被廢棄（1， 2) 〇
[0004] Na，K-ATP酶由a和0亞基(邱)及附屬FXYD調(diào)節(jié)亞基組成。存在al亞基的四種亞型(a 1-4)和0亞基的三種亞型(m-3)，其以組織特異性方式表達。al是常見的亞型，其在所有組 織中維持Na和K梯度，而a2王要在肌肉和星形|父質(zhì)細(xì)胞中表達，和a3王要在神經(jīng)細(xì)胞中表 達。人心臟表達al(c. 70%)及a2和a3亞型二者(c. 30%)以及01。眼中的睫狀體上皮是由朝向 血液的頂端色素細(xì)胞(PE)和朝向眼前房的基底外側(cè)無色素 (NPE)細(xì)胞組成的功能合胞體。
[0005] 已知PE的主要Na，K-ATP酶亞型是aim，而NPE的主要Na，K-ATP酶亞型是a203(3)。 因此，原則上，穿透完整眼睛并到達睫狀體上皮的局部施用的a2選擇性強心苷可有效地降 低I0P，且如果它們穿透完整眼睛并到達睫狀體上皮，它們可局部施用。局部施用的潛在優(yōu) 勢可能是強心苷的典型的全身毒性作用應(yīng)是最小的。
[0006] a2_選擇性強心苷的另一種可能的應(yīng)用可以是作為有效的強心劑，與已知的藥物 諸如地高辛相比，其具有降低的心臟毒性。洋地黃類藥物諸如地高辛已用于治療心力衰竭 兩百多年，但為具有多種副作用的危險藥物?，F(xiàn)有充分的證據(jù)表明a2的選擇性抑制在增強 心臟興奮-收縮耦聯(lián)和調(diào)解強心苷介導(dǎo)的正性肌力中特別有效(4)。<!2(其為次要的亞型）的 抑制可能不會引起細(xì)胞Ca超載(心臟毒性的標(biāo)志）（5)。
[0007] 先前已經(jīng)研究了大量的已知強心苷的亞型選擇性(6)，其使用表達Na，K-ATP酶亞 型(al01、a201、a301)的酵母畢赤酵母(P.pastoris)和Na，K_ATP酶的純化的清潔劑可溶性 (detergent-soluble)亞型復(fù)合物(7-11)。相對于al，在膜的 3H_烏本苷(ouabain)置換測定 中測量的洋地黃糖苷地高辛和洋地黃毒苷的解離常數(shù)Kd顯示出對a2/a3的中度選擇性(3-4 倍）。相比之下，糖苷配基諸如地高辛配基（digoxigenin)和洋地黃毒苷配基 (digitoxgenin)沒有顯示出亞型選擇性。在用純化的亞型蛋白復(fù)合物測量的Na，K-ATP酶活 性抑制的測定中，與al相比，地高辛和洋地黃毒苷顯示出對a2低3-4倍的Ki值，a3更類似于a 1。同樣，沒有任何測試的強心苷的糖苷配基顯示出亞型選擇性。對于具有一至四個洋地黃 毒糖(digitoxose)部分的地高辛衍生物，發(fā)現(xiàn)最大的a2/al選擇性為具有三個洋地黃毒糖 的糖的地高辛本身。與洋地黃糖苷相比，烏本苷的Kd顯示出相對于a2有一些傾向于al和針 對所有三個亞型的Ki值類似。
[0008] 基于這些研究，確定地高辛的糖部分可能決定亞型選擇性，其通常與具有結(jié)合型 烏本苷的Na，K-ATP酶的最新結(jié)構(gòu)相一致（12-14)。烏本苷的不飽和內(nèi)酯環(huán)和類固醇部分在a 亞基的跨膜片段Ml、M4、M5之間結(jié)合，其中亞型之間沒有氨基酸差異。假定所有強心苷的糖 苷配基類似地結(jié)合，其含意是在任何糖苷配基之間亞型不能區(qū)分，如實驗所發(fā)現(xiàn)的。與此相 反，糖在鄰近胞外環(huán)處結(jié)合，在此處亞型之間存在一定數(shù)量的氨基酸差異。這些殘基可能以 亞型選擇性方式與結(jié)合地高辛的糖相互作用。
[0009] 對治療與眼內(nèi)壓升高相關(guān)的眼部病狀，諸如青光眼的新療法，和對一方面是有效 的，且另一方面證實可接受的安全性的新強心劑，存在未滿足的需求。
[0010] 發(fā)明概述 本發(fā)明涉及地高辛和洋地黃毒苷衍生物，相對于Na，K_ATP酶的其它亞型，其為該酶的a 2亞型的選擇性抑制劑。本發(fā)明的化合物有效地降低眼內(nèi)壓，并且可用于治療與眼內(nèi)壓升高 相關(guān)的病狀，諸如青光眼，和/或作為強心劑。
[0011] 先前已使用重組人aim、a2m和a3f31亞型表明，經(jīng)典抑制劑地高辛是部分a2-選擇 性的和三-洋地黃毒糖部分負(fù)責(zé)亞型選擇性。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)：相對于al，第三洋地黃 毒糖的修飾增加對a2的選擇性。因此，地高辛的第三洋地黃毒糖已通過高碘酸鹽氧化和使 用多種R-NH 2取代基還原胺化進行化學(xué)修飾，導(dǎo)致一系列地高辛的全氫-1，4_氧氮雜草 (oxazepine)衍生物。如本文首次證實，相對于al，幾種衍生物顯示出對a2高達約8倍的增加 的選擇性。此外，結(jié)合至Na，K_ATP酶的地高辛的分子模型表明，用不同的脂族取代的地高辛 的全氫-1，4_氧氮雜草衍生物可以對a2P3復(fù)合物具有相對選擇性。事實上，相對于aim，一 系列脂族衍生物顯示出對a2P3改善的選擇性-高達約16倍。局部施用的強心苷對兔子眼內(nèi) 壓的效果已通過其預(yù)防或逆轉(zhuǎn)由4-氨基吡啶或A3腺苷受體的選擇性激動劑誘導(dǎo)的急性眼 內(nèi)壓增加的能力進行評估。與地高辛本身、地高辛配基或烏本苷相比，所述a2_選擇性地高 辛/洋地黃毒苷衍生物更有效地預(yù)防或逆轉(zhuǎn)高眼壓癥。因此，本發(fā)明的地高辛/洋地黃毒苷 衍生物具有治療與眼內(nèi)壓升高相關(guān)的病狀，諸如青光眼的效用。如本文所證明的，最高(the most) a2f33_選擇性衍生物是特別有效的。這些觀察與a2f33在房水產(chǎn)生中的主要作用是一 致的并建議，潛在地，a2_選擇性且特別是a2P3-選擇性地高辛衍生物可能感興趣作為用于 眼內(nèi)壓控制的新型藥物。
[0012]此外，本發(fā)明的a2_選擇性地高辛/洋地黃毒苷衍生物可顯示出降低的毒性，尤其 是當(dāng)局部施用時。首先，角膜和晶狀體的腫脹(swelling)應(yīng)最小，因為僅al和少量的a3但沒 有a2在角膜上皮表達且僅al在晶狀體上皮表達。其次，從眼睛到達全身循環(huán)的a2_選擇性地 高辛/洋地黃毒苷衍生物應(yīng)僅有最低限度的心臟毒性。因此，本發(fā)明提供不僅有效的作為 I0P降低劑，而且有潛力比母體化合物地高辛或洋地黃毒苷的毒性顯著較低的化合物。
[0013]根據(jù)一個方面，本發(fā)明涉及由通式(I)的結(jié)構(gòu)代表的化合物：
其中 R選自O(shè)HXrU烷基、Ci-Cs鹵代 (CRbRc) n-C (=Y) -NHOH、- (CRdRe) n-C (=Y) -COOR3;和-NHC (=Y) NR1!?2; Y為0或S; X為H或OH; R1、R2和R3各自獨立地為11或&-〇4烷基； 儼為&_〇4烷基； Rb、RC和Rd各自獨立地選自HA-C4烷基和&-C4羥基烷基； Re選自&-C4烷基和&-C4羥基烷基;且 n為0、1或2; 包括鹽、水合物、溶劑合物、多晶型物、幾何異構(gòu)體、旋光異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、非對映異 構(gòu)體及其混合物。
[0014]在式（I)的一個實施方案中，R選自 CZ3、-CZ2CZ3、- (CH2) 2CH3、-CH( CH3) 2、_(CH2) 3CH3、-CH2CH (CH3) 2、_CH (CH3) CH2CH3和-C (CH3) 3，其中每個Z在每次出現(xiàn)時獨立地為H或鹵素。 在一個特定實施方案中，每個Z為H或F。
[0015] 在式 I 的另一個實施方案中，R選自-CH2-C (=0) -NH2、-CH3、- (CH2) 2-C (=0) -NH2、-NHC (=0) -NH2、OH、-CH( CH3) CONH2、-CH (CH2OH) C00H、-CH (CH2OH) CONH2、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2C (CH3) 2、-CH2CF3、-CH2CONHOH、-NHCSNH2、-CH2CH2F、_CH (CH2) 3、_C (CH3) 3 和-CH2-S i (CH3) 3。每種 可能性代表本發(fā)明的單獨的實施方案。
[0016] 在式（I)的一個實施方案中，R\R2和R3各自為H。在式(I)的另一個實施方案中，n為 1。在式(I)的另一個實施方案中，n為2。在式(I)的另一個實施方案中，Y為0。在式(I)的另一 個實施方案中，Y為S。在式I的另一個實施方案中，&-C4羥基烷基為CH20H (即，化合物衍生 自絲氨酸或絲氨酰胺）。
[0017] 在一個目前優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物為地高辛的衍生物，即，式I中X為 0H。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R為-CH 2-C(=0)-NH2 (本文中 稱為"DGlyN"或"化合物1"）。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R 為_CH 3(本文中稱為"DMe"或"化合物2"）。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物， 其中X為0H且R為-(CH 2) 2-C(=0) -NH2 (本文中稱為"DPrN"或"化合物3"）。在另一個實施方案 中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R為-NHC(=0) -NH2 (本文中稱為"DSCar"或"化合 物4"）。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X和R各自為OH (化合物6)。在 另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R為-CH(CH3) C0NH2 (化合物8)。 在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為OH且R為-CH(CH20H)C00H (化合物 9)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R為-CH(CH20H)C0NH2 (化 合物10)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為OH且R為-CH2CH3 (化合物 12) 。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R為_(CH2)2CH 3 (化合物 13) 。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R為-CH2CH(CH3) 2 (化合 物14)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R為-CH2CF3 (本文中稱 為"DMeCF3"或"化合物15"）。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R 為-CH 2C(=0)-NH0H (化合物17)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為 0H且R為-NHCSNH2 (化合物18)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H 且R為-CH2CH2F (化合物19)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R 為-CH(CH3) 2 (化合物21)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R 為-C(CH3) 3 (化合物22)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式I的化合物，其中X為0H且R為-CH2-Si(CH3) 3 (化合物23)。
[0018]在另一個目前優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物為洋地黃毒苷的衍生物，即，式 I中X為H。
[0019]在一個實施方案中，相對于Na，K-ATP酶的其它亞型，本發(fā)明的化合物對Na，K-ATP 酶的a2亞型具有選擇性。在其它實施方案中，相對于Na，K_ATP酶的aim亞型，本發(fā)明的化合 物對Na，K_ATP酶的a2f31、a2f32和/或a2f33亞型具有選擇性，其中每種可能性代表本發(fā)明的單 獨的實施方案。
[0020]在其它實施方案中，本發(fā)明涉及包含式（I)的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦 形劑的藥物組合物。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物是適合于以滴眼液、軟膏、 懸浮液、凝膠或乳膏的形式局部施用至眼的眼用組合物。每種可能性代表本發(fā)明的單獨的 實施方案。
[0021 ]優(yōu)選地，所述組合物進一步包含至少一種藥學(xué)上可接受的選自穩(wěn)定劑、防腐劑、螯 合劑、粘度改性劑、緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑中的一種或多種的試劑。每種可能性代表本發(fā)明的單 獨的實施方案。
[0022] 相對于Na，K-ATP酶的其它亞型，本發(fā)明的化合物優(yōu)選對Na，K-ATP酶的a2亞型具有 選擇性，即，相對于該酶的其它亞型，例如，al亞型，他們抑制a2亞型（特別是a2P3亞型）。因 此，他們可用于降低高眼壓癥或治療與高眼壓癥相關(guān)的疾病，諸如青光眼的方法中。因此， 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過向需要此類治療的個體給予有效量的根據(jù)本發(fā)明的式 I的化合物或藥物組合物用于降低高眼壓癥或用于治療與高眼壓癥相關(guān)的病癥諸如青光眼 的方法。在其它實施方案中，可用于降低高眼壓癥或治療與高眼壓癥相關(guān)的病癥諸如青光 眼的化合物為式IA的化合物：
其中 R選自O(shè)HXrCs烷基、CrCs鹵代 (CRbRc) n-C (=Y) -NHOH、- (CRdRe) n-C (=Y) -COOR3; -NHC (=Y) NR1!?2;和-(CRbRc) n-NH2; Y為0或S; X為H或OH; R1、R2和R3各自獨立地為11或&-〇4烷基； 1^為&_〇4烷基； Rb、Rc、Rd^PRe各自獨立地選自H、&-C4烷基和&-C4羥基烷基；且 n為0、1或2; 包括鹽、水合物、溶劑合物、多晶型物、幾何異構(gòu)體、旋光異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、非對映異 構(gòu)體及其混合物。
[0023]在式（I)的一個實施方案中，R選自 CZ3、_CZ2CZ3、-(CH2)2CH 3、_CH(CH3)2、_(CH2) 3CH3、-CH2CH (CH3) 2、-CH (CH3) CH2CH3和-C (CH3) 3，其中每個Z在每次出現(xiàn)時獨立地為H或鹵素。 在一個特定實施方案中，每個Z為H或F。
[0024]在式（IA)的另一個實施方案中，R選自-CH2-C(=0)0H、-CH2-C(=0)_0CH 3 和 CH2-CH2-NH2。每種可能性代表本發(fā)明的單獨的實施方案。
[0025] 在式（IA)的一個實施方案中，R1和R2各自為H。在式（IA)的一個實施方案中，R 3為H 或CH3。在式（IA)的另一個實施方案中，n為1。在式（IA)的另一個實施方案中，n為2。在式 (IA)的另一個實施方案中，Y為0。在式（IA)的另一個實施方案中，Y為S。在式（IA)的另一個 實施方案中，&-C4羥基烷基為CH 20H (即，化合物衍生自絲氨酸或絲氨酰胺）。
[0026] 在一個目前優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物為地高辛的衍生物，即，式IA中X 為0H。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及式IA的化合物，其中X為0H且R為-CH 2-C(=0)0H(本文 中稱為"DGly"或"化合物5"）。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及式IA的化合物，其中X為0H 且R為-CH 2-C(=0)-〇CH3 (本文中稱為"DG1 yMe"或化合物7)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉 及式IA的化合物，其中X為0H且R為-CH2-CH 2-NH2 (本文中稱為"DEtDA或化合物11"）。
[0027] 在另一個目前優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物為洋地黃毒苷的衍生物，即，式 IA中X為H。
[0028] 式IA的化合物可在對式I的上述藥物組合物中給予。在一些實施方案中，相對于 Na，K_ATP酶的其它亞型，式IA所涵蓋的化合物對Na，K-ATP酶的a2亞型具有選擇性，即，相對 于該酶的其它亞型，例如，al亞型，他們抑制a2亞型。在其它實施方案中，相對于Na，K_ATP酶 的aim亞型，式IA所涵蓋的化合物對Na，K-ATP酶的a2m、a202和/或a203亞型具有選擇性， 其中每種可能性代表本發(fā)明的單獨的實施方案。
[0029] 在其它實施方案中，本發(fā)明涉及式I或IA的化合物，或這種結(jié)構(gòu)式(formulae)所涵 蓋的任何化合物，用于制備降低高眼壓癥或治療與高眼壓癥相關(guān)的疾病或病狀諸如青光眼 的藥物的用途。每種可能性代表本發(fā)明的單獨的實施方案。
[0030] 在其它實施方案中，本發(fā)明的化合物也可用作強心劑。因此，在一個實施方案中， 本發(fā)明涉及包含式(I)的化合物或式(IA)的化合物的強心組合物。在另一個實施方案中，本 發(fā)明涉及式（I)或式（IA)的化合物作為強心劑的用途。每種可能性代表本發(fā)明的單獨的實 施方案。
[0031] 本發(fā)明將連同下面的說明書、附圖和權(quán)利要求書得到更好地理解。
[0032] 附圖簡述 圖1高眼壓癥實驗的技術(shù)特性。新西蘭白兔用于I0P測量，兔子的I〇P(mm Hg)使用校 準(zhǔn)的Pneumatonometer(型號30，Reichert technologies)測量。
[0033]圖2圖2A:地高辛的全氫-1，4-氧氮雜草衍生物的合成。圖2B:DGlyN(本發(fā)明的代 表性化合物）的反相HPLC純化。
[0034]圖3地高辛衍生物對純化的亞型復(fù)合物的Na，K_ATP酶活性的抑制。DGlyN (A) DMe (B)對Na，K_ATP酶活性的抑制的代表性實驗。al/m亞型□ ;a2/m亞型 ;a3/f31亞型 ▼。曲線是單點抑制模型的擬合曲線(參見實施例4:實驗部分）。
[0035]圖4 4-氨基吡啶(4AP)-誘導(dǎo)的兔子短暫性高眼壓癥。對照_;4AP，1滴(40 mg/ml) □ ;4AP，2滴（40mg/ml) A。
[0036] 圖5 DMe (A)、DGlyN (B)、地高辛（C)、烏本苷(D)和地高辛配基(E)對4AP-誘導(dǎo)的 高眼壓癥的效果。在加入4AP(40mg/ml，l滴，25yl)前30min，將指定濃度的強心苷(CG's) (1 滴，25iil)加入到兩只眼睛中。在此預(yù)溫育期間I0P有很少或沒有變化。加入4AP后在指定的 時間測量I0P。在每個實驗中每個濃度使用一只兔子。值為雙眼I0P的平均值。
[0037] 圖6不同CG's的I0P變化的比較。該圖描繪施用4AP和O.lmM CG 1.5小時后I0P的 變化(以mmHg計）。該圖表示有SEM的3個不同實驗的平均值。
[0038]圖7地高辛衍生物對I0P的效果的時間過程。在該實驗中，通過在強心苷不存在下 或在施用一滴強心苷后每2小時施用4AP(A和B)，或者在首次施用4AP后一小時施用一滴強 心苷(C)，使I0P升高7-8小時。所有其它條件和測量如圖5中所述。
[0039] 圖8 DMe、DGlyN和地高辛配基對IB-MECA-誘導(dǎo)的高眼壓癥的效果。A.在IB-MECA 之前30分鐘加入指定濃度的DMej.在首次加入IB-MECA后1.5小時加入ImM的地高辛配基、 DGlyN或DMeX.在首次加入IB-MECA后1.5小時加入3mM的地高辛配基或DGlyN。在零時和此 后每2小時加入lyM IB-MECA(箭頭）。
[0040]圖9地高辛配基、地高辛、DGlyN和DMe從a2亞型的解離。圖9描繪來自如方法中所 述獲得的使用四種不同強心苷的代表性實驗的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。
[00411圖10結(jié)合至Na，K-ATP酶的地高辛的模型。A.該模型描繪具有結(jié)合地高辛(3B0W) 的豬aim復(fù)合物(4HYTKB.臨近結(jié)合地高辛的殘基的細(xì)節(jié)(編號為豬al和m)<X和D描繪顯 示 mGln84 和 03Val89 的択與03。
[0042] 圖11顯示a203和a202以及a2m和aim亞型復(fù)合物在考馬斯藍染色的凝膠中的表 達。在用PNGase處理之前將蛋白質(zhì)變性。
[0043] 圖12 〇101、(1201、€[202、€[203亞型復(fù)合物的似，1(4了?酶活性的1(-激活。該圖顯示代 表性曲線。
[0044] 圖13地高辛對〇101、<1201、(1202、€[203的似，1(4了?酶活性的抑制。該圖顯示代表性 曲線。
[0045] 圖14 DIB對〇101、<1201、€[202、€[203的似，1(-六了?酶活性的抑制。該圖顯示代表性曲 線。
[0046]圖15 DIB對急性高眼壓癥的抑制。該圖表示四個實驗中不同濃度的DIB的平均效 果。
[0047]發(fā)明詳述 除非另有規(guī)定，"一 (a)"或"一 (an)"表示"一個或多個"。
[0048]本發(fā)明涉及地高辛和洋地黃毒苷衍生物，其為Na，K_ATP酶的a2亞型的選擇性抑制 劑。本發(fā)明的化合物有效地降低眼內(nèi)壓，并且可用于治療與眼內(nèi)壓升高相關(guān)的病狀，諸如青 光眼，和/或可用作強心劑。
[0049] 術(shù)語"Na，K_ATP酶的a2亞型的選擇性抑制劑"表示所述化合物抑制Na，K_ATP酶的a 2亞型的程度比其它亞型例如al大。在一些實施方案中，相對于Na，K_ATP酶的aim亞型，本 文所述的化合物對Na，K_ATP酶的a2f31、a2f32和/或a2f33亞型具有選擇性。在一些實施方案 中，相對于其它亞型，化合物對Na，K_ATP酶的a2亞型（例如，a2m、a202和/或a203亞型）的選 擇性高達約20倍，例如，相對于該酶的其它亞型，對a2亞型的抑制大高達16倍、8倍、5倍或2 倍。
[0050] 化合物 根據(jù)一個方面，本發(fā)明涉及由通式(I)的結(jié)構(gòu)代表的化合物：
其中 R選自O(shè)HXrU烷基、Ci-Cs鹵代 (CRbRc) n-C (=Y) -NH0H、- (CRdRe) n-C (=Y) -C00R3;和-NHC (=Y) NR1!?2; Y為0或S; X為H或OH; R1、R2和R3各自獨立地為11或&-〇4烷基； 儼為&_〇4烷基； Rb、RlPRd各自獨立地選自H、&-C4烷基和&-C4羥基烷基； Re選自&-C4烷基和&-C4羥基烷基;且 n為0、1或2; 包括鹽、水合物、溶劑合物、多晶型物、幾何異構(gòu)體、旋光異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、非對映異 構(gòu)體及其混合物。
[0051]根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及由通式(IA)的結(jié)構(gòu)代表的化合物：
其中 R選自O(shè)HXrU烷基、Ci-Cs鹵代 (CRbRc) n-C (=Y) -NH0H、- (CRdRe) n-C (=Y) -C00R3; -NHC (=Y) NR1!?2;和-(CRbRc) n-NH2; Y為0或S; X為H或OH; R1、R2和R3各自獨立地為11或&-〇4烷基； 儼為&_〇4烷基； Rb、R。、Rd和Re各自獨立地選自H、&-C4烷基和&-C4羥基烷基;且 n為0、1或2;包括鹽、水合物、溶劑合物、多晶型物、幾何異構(gòu)體、旋光異構(gòu)體、對映異構(gòu) 體、非對映異構(gòu)體及其混合物。
[0052]在一些目前優(yōu)選的實施方案中，所述化合物選自地高辛衍生物(X為0H)或洋地黃 毒苷衍生物(X為H)。幾種優(yōu)選的式(I)或（IA)的化合物舉例如下，其中每種可能性代表本發(fā) 明的單獨的實施方案。
[0053] 式（1)的化合物，其中X為0H且R衍生自甘氨酰胺(R = -CH2C(=0)-NH2)，本文中縮寫 為 "DGlyN，，。
[0054] 式(2)的化合物，其中X為0H且R為CH3，本文中縮寫為"DMe"。
[0055] 式(3)的化合物，其中X為0H且R衍生自丙酰胺(R = -CH2CH2C(=0)-NH2)，本文中縮 寫為 "DPrN"。
[0056] 式(4)的化合物，其中X為0H且R衍生自氨基脲(R = -NHC(=0)-NH2)，本文中縮寫為 "DSCar"。
[0057]式（5)的化合物，其中X為0H且R衍生自甘氨酸(R = -CH2C(=0)0H)，本文中縮寫為 "DGly"。
[0058] 式(6)的化合物，其中X和R各自為0H，本文中縮寫為"D0H"。
[0059] 式(7)的化合物，其中X為0H且R衍生自甘氨酸甲酯(R = -CH2-C(=0)-0CH3)，本文中 縮寫為"DGlyMe"。
[0060] 式（8)的化合物，其中X為0H且R衍生自丙氨酰胺(alanineamide)(R = -CH(CH3) C0NH2)，本文中縮寫為"DAlaN"。
[0061 ] 式(9)的化合物，其中X為0H且R衍生自絲氨酸(R = -CH(CH20H)C00H)，本文中縮寫 為 "DSer，，。
[0062] 式（10)的化合物，其中X為0H且R衍生自絲氨酰胺(R = -CH(CH2OH)CONH2)，本文中 縮寫為"DSerN"。
[0063] 式（11)的化合物，其中X為0H且R衍生自乙二胺(R = -CH2-CH2-NH2)，本文中縮寫為 "DEtDA"。
[0064] 式（12)的化合物，其中X為0H且R為-CH2CH3本文中縮寫為"DEt"。
[0065] 式(13)的化合物，其中X為0H且R為-(CH2)2CH 3本文中縮寫為"DPr"或"DP"。
[0066] 式(14)的化合物，其中X為0H且R為-CH2CH(CH3) 2本文中縮寫為"DiBu"。
[0067]式（15)的化合物，其中X為0H且R衍生自2,2,2_三氟乙基(R = -CH2CF3)，本文中縮 寫為 "DMeCF3"。
[0068] 式（17)的化合物，其中X為0H且R為-CH2C(=0)-NH0H，本文中縮寫為"DG1 yNHOH"。
[0069] 式（18)的化合物，其中X為0H且R衍生自氨基硫脲（semithiocarbazide) (R=-NHCSNH2)，本文中縮寫為"DSSCar"。
[0070] 式（19)的化合物，其中X為0H且R為-CH2CH2F，本文中縮寫為"DCH 2CH2F"。
[0071] 式(21)的化合物，其中X為0H且R為-CH(CH3)2，本文中縮寫為"DiPro"或"DIP"。
[0072]式(22)的化合物，其中X為0H且R為-C(CH3)3，本文中縮寫為"DtBu"。
[0073] 式(23)的化合物，其中X為0H且R為甲基(三甲基甲硅烷基）（-CH2-Si(CH 3)3)，本文 中縮寫為"DTMS"。
[0074] 這些和其它代表性化合物示于下文表1中。
[0075] 術(shù)語"&-C6烷基"基團是指任何飽和脂肪烴，包括含有1至6個碳原子的直鏈和支鏈 基團。術(shù)語"&-C4烷基"基團是指任何飽和脂肪烴，包括含有1至4個碳原子的直鏈和支鏈基 團。烷基基團的非限制性實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊 基、2-戊基、3-戊基、新戊基、1-己基、2-己基和3-己基。該烷基基團可以是取代的或未取代 的。
[0076]術(shù)語"鹵素"是指氟、氯、溴或碘。
[0077] 本發(fā)明化合物的所有立體異構(gòu)體、旋光和幾何異構(gòu)體均考慮在內(nèi)，無論以混合物 或純的或基本純的形式。本發(fā)明化合物可在一個或多個原子處具有不對稱中心。因此，化合 物可以對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體形式或以其混合物形式存在。本發(fā)明考慮使用任何外消 旋體(即含有等量的各對映異構(gòu)體的混合物）、對映異構(gòu)體富集的混合物（即，富含一種對映 異構(gòu)體的混合物）、純的對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體、或其任何混合物。手性中心可命名為R 或S或R，S或d，D，1，L或d，l，D，L。包含氨基酸殘基(例如，甘氨酸或甘氨酰胺）的化合物包 括D-氨基酸、L-氨基酸、或氨基酸的外消旋衍生物的殘基。
[0078] 本發(fā)明的一種或多種化合物可以鹽存在。術(shù)語"鹽"包括堿加成鹽和酸加成鹽，并 包括與有機和無機的陰離子和陽離子形成的鹽。術(shù)語"有機或無機陽離子"是指酸的抗衡離 子?？购怆x子可選自堿金屬和堿土金屬，（諸如鋰、鈉、鉀、鋇、鋁和鈣）、銨等。此外，術(shù)語包括 通過堿性基團與有機或無機酸的標(biāo)準(zhǔn)酸堿反應(yīng)形成的鹽。此類酸包括鹽酸、氫氟酸、氫溴 酸、三氟乙酸、硫酸、磷酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸、馬來酸、富馬酸、膽酸、撲酸、粘酸、D-樟腦酸、鄰苯二甲酸、酒石酸、水楊酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲 酸、肉桂酸及類似酸。
[0079] 本發(fā)明還包括本發(fā)明的化合物的溶劑合物及其鹽。"溶劑合物"表示本發(fā)明的化合 物與一種或多種溶劑分子的物理締合。該物理締合包括不同程度的離子和共價鍵合，包括 氫鍵合。在某些情形下，所述溶劑合物將能夠分離。"溶劑合物"涵蓋溶液相和可分離的溶劑 合物。合適的溶劑合物的非限制性實例包括乙醇鹽、甲醇鹽等。"水合物"為一種溶劑合物， 其中溶劑分子為水。
[0080] 本發(fā)明還包括本發(fā)明的化合物的多晶型物及其鹽。術(shù)語"多晶型物"是指物質(zhì)的特 定晶態(tài)，其可由特定物理性質(zhì)諸如X-射線衍射、IR光譜、熔點等來表征。
[0081 ] 藥物組合物和治療用途 在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過給予有效量的包含作為活性成分的式I和/或IA的 化合物(例如，化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、21、22 或 23)和藥 學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，用于治療與眼內(nèi)壓升高相關(guān)的病狀，并且特別是用于治 療青光眼的方法。
[0082]在其它實施方案中，本發(fā)明提供通過給予有效量的包含作為活性成分的式I和/或 IA 的化合物(例如，化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、21、22 或 23) 和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，用于降低升高的眼內(nèi)壓的方法。
[0083]優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物為局部給予至患者眼部以用于促使藥物達到有效的 眼內(nèi)水平并防止其它器官中不必要的藥物水平的眼用組合物。此類非全身性的、位點特異 性的給藥降低了與藥物相關(guān)的副作用。然而，以有效降低眼內(nèi)壓的劑量口服或其它方式的 全身性給藥也是可能的。例如，所述組合物可通過皮膚貼片給藥以延長釋放。
[0084] 當(dāng)局部給藥時，含有式I或IA的地高辛衍生物的藥物組合物可以適于局部遞送的 各種治療形式(包括溶液、懸浮液、乳液和凝膠)來配制。這些制劑中的載體可以是任何藥學(xué) 上可接受的載體諸如鹽水、緩沖鹽水、卡波姆凝膠(carbopo 1 ge 1)、礦物油等。所述制劑可 根據(jù)已知的制備眼用制劑的程序來制備。優(yōu)選地，藥物組合物中地高辛衍生物的濃度在約1 至約5,000 μg/ml的范圍內(nèi)，優(yōu)選約80至約800 μg/ml并且所述制劑優(yōu)選以每天一至四個劑 量施用，其中每個劑量含有約1至125 yg的地高辛衍生物，更優(yōu)選約2至約20 yg的地高辛衍 生物。
[0085] 所述局部藥物組合物可以滴眼液的形式通過滴入眼中施用或可以粘性軟膏、凝膠 或乳膏的形式通過涂抹(ointment)在眼部表面上施用并可含有控釋裝置以在較長時間內(nèi) 促進緩釋。
[0086] 所述組合物可進一步包括無毒的輔助性的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)諸如穩(wěn)定劑、防腐 劑、螯合劑、粘度改性劑、緩沖劑和/或pH調(diào)節(jié)劑。此外，所述組合物可含有其它眼用活性劑 諸如抗菌劑、舒適增強劑、抗氧化劑、降低眼內(nèi)壓（I0P)的藥物等。
[0087]根據(jù)其它實施方案，地高辛/洋地黃毒苷衍生物可以裝入藥物遞送裝置中以嵌入 或植入患者眼中以使藥物以受控且持續(xù)的速率通過溶解、擴散或浸出而釋放，從而在較長 時間內(nèi)維持有效治療濃度。藥物遞送裝置可以是例如裝有活性劑、嵌入例如下眼瞼之下的 生物相容性薄膜。
[0088] a2-選擇性強心苷的另一種可能的應(yīng)用為作為有效的強心藥物，與已知的藥物諸 如地高辛相比，其具有降低的心臟毒性。因此，在其它實施方案中，本發(fā)明提供包含作為活 性成分的式I和/或IA的化合物(例如，化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、 18、19、21、22或23)和藥學(xué)上可接受的載體的強心組合物。根據(jù)該實施方案，根據(jù)本發(fā)明的 化合物可因此配制用于口服、頰(buccal)、局部、腸胃外或直腸給藥。
[0089] 對于口服給藥，所述組合物可例如以使用可接受的稀釋劑通過常規(guī)方法制備的片 劑、膠囊劑、粉劑、溶液、糖漿或懸浮液的形式提供。對于頰給藥，所述組合物可以常規(guī)配制 的片劑或小藥囊的形式提供。
[0090] 根據(jù)本發(fā)明的化合物可經(jīng)配制用于通過推注或連續(xù)輸注進行腸胃外給藥。用于注 射的制劑可以含有單劑量的安瓿的形式提供或者他們可在多劑量容器中與加入的防腐劑 一起提供。所述組合物可以是懸浮液、溶液等的形式。
[0091] 或者，所述活性成分可以粉末形式提供以在使用前用適當(dāng)?shù)妮d體重構(gòu)。對于局部 使用，根據(jù)本發(fā)明的化合物可以常規(guī)方式作為軟膏、乳膏、凝膠、洗劑、粉劑或噴霧劑來配 制。
[0092]本發(fā)明的原理(使用結(jié)合至生物活性部分諸如顯像劑或治療劑的白蛋白綴合物異 黃酮衍生物以選擇性遞送至對根據(jù)本發(fā)明的異黃酮敏感的細(xì)胞)可參照以下非限制性實施 例更好地理解。 實施例
[0093]實施例1:地高辛的全氫-1，4-氧氮雜草衍生物的合成和測試 全氫-1，4-氧氮雜草衍生物根據(jù)（15)中描述的方法制備。圖2A顯示合成路線，包括(a) 第三洋地黃毒糖部分的選擇性高碘酸鹽氧化和(b)對于甘氨酰胺的情況，使用游離胺(R-NH2)加上NaCNBH 3的二醛的還原胺化?；衔锿ㄟ^HPLC純化，如圖2B中的DGlyN衍生物的代表 性實例所見。反應(yīng)的兩個階段的進度以及化合物的純化通過薄層色譜和質(zhì)譜測量常規(guī)監(jiān) 測。獲得幾種衍生物的咕和 13C NMR光譜和全部分配(assignments)并將另行公布。本發(fā)明的 代表性化合物的結(jié)構(gòu)示于表1中。為了驗證結(jié)構(gòu)，然后測定純化的化合物的質(zhì)量。該表顯示 十五種地高辛衍生物以及雙-洋地黃毒糖地高辛配基的甘氨酸衍生物的不同胺取代基的結(jié) 構(gòu)、名稱和理論和實測質(zhì)量。在具有電噴霧電離的Micromass ZQ 4000光譜儀中獲得質(zhì)譜。 [0094] 表1地高辛的全氫-1,4-氧氮雜罩衍生物的結(jié)構(gòu)、名稱和質(zhì)量
*雙-甘氨酸是指雙-洋地黃毒糖地高辛配基的甘氨酸衍生物。
[0095] 實施例2: Na，K_ATP酶活性的抑制 圖3顯示與地高辛本身相比對a2具有改進的選擇性的兩種衍生物DGlyN(化合物1)和 DMe (化合物2)的純化的人亞型(a 1 f31、a 201和a 301)的Na，K-ATP酶活性的抑制曲線。表2提供 根據(jù)本發(fā)明的16種地高辛全氫-1-4-氧氮雜草衍生物的抑制作用的信息。表2中的數(shù)據(jù)顯 示，幾種衍生物的亞型選擇性比率(Kial/a2):DGlyN(7.45±0.46)、DME(6.47±0.71)、DGly (5.1±0.54)、0?冰(5.28±0.75)和030&44.98±1.2)明顯高于地高辛的亞型選擇性比率 (3.44±0.34)。對于這些化合物，對<11和€[2二者的1^值低于地高辛，但與€[1相比對€[2的作用 更大。因此，與地高辛相比，本發(fā)明的化合物的Ki al/a2比率更高。在所有情況下，與a2相 比，對a3的Ki更接近對al的Ki。這一特點在圖3的DMe和DGlyN中清楚地見到，并且也適用于 式（I)所包括的其它化合物。因此，Kial/a2主要受第三洋地黃毒糖的改變影響。表2中的幾 種衍生物(例如DEt)的Ki值明顯低于地高辛本身，但亞型之間的差異作用沒有觀察到，所以 選擇性比率沒有改善。表2中的幾種其它衍生物(例如DEtDA)的Ki值明顯低于地高辛本身且 觀察到一些差異作用。在其它情況下(例如D0H和DSer)，Ki值高于地高辛且對a2的選擇性沒 有改善。表2中的結(jié)果為與三-洋地黃毒糖的甘氨酸衍生物(DGly)相比，雙-洋地黃毒糖地高 辛配基的甘氨酸衍生物(DbisGly)顯示對a2的選擇性較低，相對于a 1，這顯示第三洋地黃毒 糖殘基的改變最適合于這種作用，與（6)中類似的結(jié)論一致?？傊?，改變第三洋地黃毒糖部 分的策略產(chǎn)生具有改善的Kial/a2比率的化合物，在最高a2_選擇性衍生物，DGlyN和DMe 的情況下達到地高辛值的兩倍以上。
[0096] 表2:具有選擇性比率的亞型algl和a2gl的Na，K_ATP酶活性抑制的Ki值
* Dbis為地高辛配基雙洋地黃毒糖苷(digitoxide)。
[0097] CG縮寫對應(yīng)于以下起始胺:D0H-羥胺;DGly-甘氨酸;DGlMe-甘氨酸甲酯;DGlyN-甘 氨酰胺;DAlaN-丙氨酰胺;Dser-絲氨酸;DserN-絲氨酰胺;DSCar-氨基脲;DPrN-丙酰胺； DEtDA-乙二胺;DMe-甲胺;DEt-乙胺;DMeCF 3-2，2，2三氟乙胺;Db i sGly-雙-洋地黃毒糖苷甘 氨酸(bis-digitoxoside glycine) 4值通過t檢驗計算并表示為*p〈0.05、**P〈0.01、***p〈 O.OOUn，獨立實驗次數(shù)。p(a2val)表示Kia2m和Kiaim之間的差異顯著性。p( v地高辛）表 示與地高辛的(Kiaim /Kia2m)相比，選擇性比率(Kiaim /Kia2m)的差異顯著性。
[0098]實施例3:通過局部施用的地高辛和全氫-1，4-氧氮雜草衍生物降低眼內(nèi)壓。
[0099] 用局部麻醉劑麻醉角膜后，使用"Reichert Model 30 ? Pneumatonometer"測定 兔子的眼內(nèi)壓。使用兩種不同的藥理學(xué)試劑誘導(dǎo)IPO的急性升高并測定本發(fā)明的局部施用 的糖苷是否能夠抵制這一效果。首先，I0P升高用4-氨基吡啶(4AP)急性誘導(dǎo)，先前已報道其 使兔眼的I0P從22-24mmHg的靜止I0P急性和短暫升高4-8 mm Hg (16)。由4AP(其是公知的 電壓依賴性K通道的阻滯劑)誘導(dǎo)的高眼壓癥的機制顯示涉及從虹膜-睫狀體的交感神經(jīng)釋 放去甲腎上腺素，導(dǎo)致房水流入速率增加。圖4證實4AP的基本作用。在每只眼睛中，一或兩 滴4AP使I0P升高3-6mm Hg，且作用在5小時后消退。
[0100]由于10P反映房水流入和流出的平衡，因此通過強心苷減少4AP誘導(dǎo)的房水流入增 加應(yīng)防止I0P增加。因此，測試強心苷效果的標(biāo)準(zhǔn)實驗設(shè)計涉及在施用4AP前30分鐘局部施 用化合物(每只眼睛1滴)并且每30分鐘測量I0P達五小時。圖5顯示使用這一方案的地高辛、 DGlyN和DMe、地高辛配基和烏本苷對IOP的效果。每個實驗進行三次，但附圖描繪對每個濃 度的強心苷使用不同兔子的代表性實驗。繪制的值表示兩只眼睛的平均壓力，雖然分別測 量的每只眼睛的值類似。高濃度（1 mM)的地高辛（圖5C)能夠防止4AP誘導(dǎo)的10P上升，而 0.2511^地高辛效果較差。通過比較，0617_^^(圖54,8)，最高€ [2選擇性的新的全氫-1，4-氧氮雜草衍生物，在比地高辛低得多的濃度(0. 05-0.1 mM)下是有效的。類似地，地高辛的 糖苷配基地高辛配基在比地高辛低的濃度下有效地降低I0P(圖5E)。最后，烏本苷，一種廣 泛使用的水溶性強心苷，僅在ImM下一定程度降低I0P而更低的濃度則效果不佳(圖f5D)。 [0101] 圖6比較DGlyN、DMe、地高辛配基、地高辛和烏本苷對I0P的相對效果，其均在0.1 mM 下和一個時間點。數(shù)據(jù)代表三個獨立的實驗（即總共6只眼）的平均效果土SEM，且證實順序 為DGlyN ? DMe ?地高辛配基〉地高辛〉烏本苷。
[0102]隨著時間的推移，單獨施用后穿透到睫狀體上皮的強心苷將被洗出眼睛進入全身 循環(huán)，并因此對I0P的作用將消散。盡管圖5和6表明，強心苷降低I0P的功效更大或更小，但 由于4AP效果本身的短暫性質(zhì)，通過該實驗方案無法評估效果的長久性。因此，進行另外的 實驗，其中當(dāng)然后每兩個小時加入4AP以維持I0P在升高的水平7-8小時時，甚至在不存在強 心苷的情況下，比較單滴地高辛、地高辛配基、DGlyN、DMe或烏本苷的效果（圖7)。通過該方 案，在圖7中I0P的降低的確被視為是短暫的。圖7A顯示DMe的代表性實驗，表明洗出時間對 濃度的明顯依賴。在I0P升回4AP導(dǎo)致的升高水平之前，對于2mM、0.5mM和0.2mM，I0P分別保 持低水平5.8、4.5和2.5小時。其它實驗顯示，在相同濃度下，DGlyN的洗出時間比DMe稍快。 當(dāng)DMe、DGlyN、地高辛配基、地高辛和烏本苷以相同濃度（ImM)施用時，在它們之間檢測到洗 出時間的顯著差異。如在圖7B中所見，DMe維持I0P在低水平約5.5小時，相比之下，DGlyN為 3.5小時，地高辛配基為約2小時和地高辛僅為1小時。烏本苷以地高辛和地高辛配基之間的 速率洗出。為清楚起見數(shù)據(jù)沒有顯示?？傊?，與地高辛(較低a2-選擇性強心苷(CG))或非選 擇性CG地高辛配基相比，最高a2_選擇性衍生物DMe(化合物2)和DGlyN(化合物1)產(chǎn)生最長 作用效果以降低I0P。
[0103]圖7C顯示DGlyN和DMe快速逆轉(zhuǎn)預(yù)先建立的高眼壓癥。在首次施用4AP后一小時，施 用DGlyN或DMe(0.1或lmM)，4AP每兩小時進行添加。顯然，在30分鐘內(nèi)DGlyN和DMe逆轉(zhuǎn)I0P的 初始上升，表明所述化合物透過角膜并足夠快地與栗結(jié)合以具有這一作用。然后將標(biāo)準(zhǔn)化 的I0P維持至少4小時，如圖7B中。與地高辛本身相比，不依賴于低濃度的a2_選擇性衍生物 的優(yōu)異效果，DGlyN和DMe作用的迅速起始暗示a2的抑制，因為已知a2結(jié)合強心苷比al更迅 速(17)。
[0104]為驗證地高辛衍生物直接抑制房水流入而非通過例如干擾4AP本身間接起作用， 使用局部IB-MECA。IB-MECA通過一種不同的和明確的機制誘導(dǎo)急性高眼壓癥。即，IB-MECA 是A3-腺苷受體的選擇性激動劑，并通過激活NPE細(xì)胞的C1通道使房水流入和I0P升高（18， 19)。單滴IB-MECA(lyM)誘導(dǎo)I0P顯著但短暫的增加，而每2小時重復(fù)施用維持增加的I0P達 4-5小時（參見圖8A對照）。圖8A描繪在IB-MECA之前施用DMe (0.1-lmM)的效果，并且DGlyN 獲得類似的結(jié)果(未示出）。圖8B描繪IB-MECA之后施用地高辛配基、DGlyN和DMe (ImM)的效 果。ImM的地高辛配基、DGlyN和DMe的效果幾乎與如在圖7中用4AP所見的相同，明顯排除CG' s干擾4AP本身的作用的觀念。此外，DMe和DG1 yN的效果持續(xù)時間明顯大于地高辛配基。另 外，當(dāng)DGlyN和地高辛配基的濃度升至3 mM時，與ImM的實驗相比，效果持續(xù)時間的差異極大 地放大。
[0105] 也在4AP后施用地高辛（lmM)、DGlyN (0.5mM)、DMe (0.5mM)和烏本苷（lmM)之后 測量角膜厚度。至少經(jīng)4小時的時間尺度，以微米測量的角膜厚度無顯著影響。因此，在該研 究中，未檢測到角膜厚度的變化(表3)，表示缺乏局部毒性作用。此外，未在結(jié)膜或角膜觀察 到紅腫或局部刺激。IB-MECA之后施用CG's獲得類似的結(jié)果。
[0106] 表3:厚度測量法-施用強心苷之前和之后的角膜厚度
RE，右眼，LE，左眼。角膜厚度以微米給出。每個值代表三次獨立測量的平均值。
[0107] 實施例4:強心苷從a2m的解離 由于NPE細(xì)胞中的主要亞型為a2且預(yù)計從栗的解離對I0P效果的持續(xù)時間有影響，因此 對不同強心苷從純化的a2m亞型的離解率進行比較。使用（20)中所述的方案比較地高辛、 地高辛配基、DGlyN和DMe的離解率。圖9描繪了四種化合物中的每種的代表性實驗且表4顯 示三個或四個實驗的平均速率常數(shù)和半衰期。顯然，糖苷配基地高辛配基比地高辛或任何 其它糖基解離快得多，且DMe和DGlyN也比地高辛本身明顯解離地慢。DMe和DGlyN的緩慢解 離表明其對I0P持久作用的潛力。
[0108] 表4:強心苷從a2m亞型復(fù)合物的離解率。
[0109]實施例5:具有對a2P3復(fù)合物增強選擇性的地高辛衍生物 因為a203而不是a2m是NPE細(xì)胞中的主要亞型復(fù)合物，所以進一步研究m、02或03亞型 是否是重要因素。
[0110] 地高辛結(jié)合Na，K-ATP酶的分子建模 圖10A中示出了第三洋地黃毒糖殘基和亞型選擇性的相互作用的分子觀察。該圖顯示 分子模型，其中將地高辛分子(坐標(biāo)3B0W)引入到高親和力烏本苷結(jié)合分子(4HYT) (14)上， 使得烏本苷和地高辛的內(nèi)酯和類固醇部分緊密重疊，然后獲得最小能量結(jié)構(gòu)。三個洋地黃 毒糖殘基向外指向亞基。圖10B中放大的圖像顯不臨近（〈3.5A) a的L7/8中的殘基 AspAspArgTrp887的洋地黃毒糖部分，第三洋地黃毒糖既接近aTrp887,也接近Kln84。朝向 0亞基這一方向的支持來自舊觀察:位于洋地黃毒苷的第三洋地黃毒糖的光親和性探針標(biāo) 記a和0亞基，而位于強心苷分子的其它區(qū)域的光親和性探針僅標(biāo)記a亞基（21，22)。如模 型所表明的，aTrp887是胞外環(huán)中僅有的四個殘基之一，其在a2(和a3)中與al不同，（在豬al 中為Glnll9、Glu307、Val 881和Trp887)，且先前推斷為用于確定亞型選擇性的候選物 (23)。緊鄰這四個殘基之一與第三洋地黃毒糖的相互作用對于亞型選擇性重要的主張，和 第三洋地黃毒糖的衍生物可以提高亞型選擇性的目前發(fā)現(xiàn)非常吻合。在a2中，Trp887被蘇 氨酸替換。
[0111] 此外，m中的Gln84被03中的Val89和02中的Glu替換（圖10C和D)。由于a203是NPE 細(xì)胞中的主要亞型復(fù)合物，似乎通過將比已經(jīng)嘗試的Me和Et更大的脂族基團引入全氫-1， 4_氧氮雜草地高辛衍生物，有可能產(chǎn)生與所有其它細(xì)胞中的主要亞型復(fù)合物aim相比，對a 203的選擇性增強的地高辛衍生物。更疏水的衍生物的另一可能的優(yōu)點是，預(yù)計它們更能穿 透角膜，并因此，潛在地，以比DMe或DGlyN更低的濃度有效地降低I0P。
[0112] 人a2g3和a2g2亞型復(fù)合物的表達、純化和表征。
[0113] 為開發(fā)對人a2P3具有更高選擇性的化合物，a2P3和a2P2人亞型復(fù)合物按如下方法 所述進行表達。圖11顯示純化的亞型復(fù)合物a2m、a202、a203和aim在用PNGase(在變性狀 態(tài)下）處理之前或之后的蛋白凝膠。m具有3個糖基化位點，03具有2個糖基化位點，而02具 有7個糖基化位點。在凝膠上的流動順序，f33>f32>m，與01，37172.6>f32，35422.2 >03， 33678.9的去糖基化亞基的預(yù)測質(zhì)量非常吻合。純化復(fù)合物的平均Na，K-ATP酶活性為aim， 19 ? 3 ± 2;a2m，18 ? 2± 1 ? 6;a202，7 ? 7 ± 1 ? 8和a203 9 ? 7 ±0 ? 26 wnoles/min/mg蛋白（n=4)。 因為強心苷和K離子是相互對立的，與強心苷結(jié)合相關(guān)的重要的點是用于Na，K-ATP酶的活 化的K0.5 K。如本文所用的術(shù)語"K〇.5 K"意指Na，K-ATP酶活性的活化所需的鉀離子(K)的半 數(shù)最大濃度。圖12和表5顯示K的表觀親和力在亞型復(fù)合物之間顯著不同，順序為aim〈a2m <a202〈a203。地高辛的抑制對具有較高Ko. 5 K的亞型更有效(Ki aim>a2m>a202>a203)，因 此導(dǎo)致對a2P3的選擇性較高，相對于aim (圖13)。該增加的選擇性通過較低程度的K-地高 辛拮抗作用來解釋且預(yù)計對所有的強心苷與對地高辛的程度相同。
[0114] 表5:€11択、€[201、(1202和€[203亞型復(fù)合物的恥，1(41?酶活性活化的1((). 51(
[0115] 地高辛的脂族衍生物的合成和亞型選擇性。
[0116]已合成和純化了另一組具有脂族取代基丙基(DP)、異丙基(DIP)、異丁基(DIB)、叔 丁基(DtB)和三氟乙基(DMeCF3)的全氫-1，4-氧氮雜草地高辛衍生物。表6顯示與地高辛本 身和DMe相比，最近的脂族衍生物對四種Na，K-ATP酶亞型復(fù)合物的抑制和選擇性的結(jié)果，圖 14描繪了最高選擇性的異丁基衍生物，DIB的效果。當(dāng)與DMe相比時，在aim與a2m中未觀察 到顯著差異。然而，對于a2P3,包括DMe在內(nèi)的所有脂族衍生物顯著優(yōu)于地高辛且在異丁基 衍生物的情況下選擇性比率達16倍。通常，a2P2的曲線位于a2P3和a2m的曲線之間。如上述 提到的，a2m_3復(fù)合物之間心. 51(的差異應(yīng)轉(zhuǎn)化為Ki的差異，如對地高辛所見的，在某種意義 上Ki a2m>a202 2 a203。然而，對a203:aim的選擇性增加比地高辛對所有這些新衍生物所 見的明顯更高（6.5倍），且特別是對于異丁基衍生物，DIB(16倍）。這一發(fā)現(xiàn)可能意味著，所 有脂族衍生物，但尤其是DIB，與a2P3的相互作用比a2m更特定。在任何情況下DIB對a2P3抑 制的5.8nM的Ki比任何其它的脂族(或其它)衍生物所見的更低。
[0117] a 203抑制的低K i意味著DIB可能是兔子中10P的良好抑制劑。這在圖15所總結(jié)的實 驗中測試。事實上，在4AP之前局部施用DIB有效地防止I0P上升。完全防止I0P上升所需的濃 度(>30yM)比先前測試的最有效衍生物(DMe)所需的低約2倍。
[0118] 表6 ?脂族地高辛全氫-1，4-氧氮雜草衍生物對a2P3亞型復(fù)合物的選擇性
[0119] 總之，目前已證明地高辛的第三洋地黃毒糖殘基的修改可產(chǎn)生對a2比對al的選擇 性增加的衍生物。與地高辛相比（Kial/a2 3.44倍），選擇性比率顯著增加，順序為DGlyN> DMe>DGly ? DPrN* DSCar，對DGlyN達到Kial/a2=7.45的最大值(表2)。
[0120] 此外，選擇性比率，Kia2f33/alf31，地高辛本身為6.5，對所有更多脂族衍生物0卩、 DIP、DIB、DtB和DMeCF3明顯增強，對DIB達到c.16倍。
[0121] 考慮到全氫-1-4-氧氮雜草環(huán)中的取代基的結(jié)構(gòu)(表1、2和6)，似乎增加的a2:al選 擇性(尤其是a2/P3)用具有H鍵潛力的小R基團（例如，甘氨酸、甘氨酰胺、丙酰胺、氨基脲、氨 基硫脲），或小疏水基團（例如，Me、Et、Pr、iPr和tBu)來實現(xiàn)，而較大的取代基(丙氨酸、丙氨 酰胺、絲氨酸、絲氨酰胺)改善選擇性程度較低，盡管這些化合物在治療上也可以是有用的。 亞型選擇性的重要特征是(a)a2_選擇性可能受限于具有洋地黃毒糖殘基的洋地黃糖苷， 由于例如烏本苷(一種a-鼠李糖苷)對al比a2略有選擇性和(b)如上述以及(6)中所總結(jié)的， 第三洋地黃毒糖殘基是最佳的。
[0122] 盡管腎Na，K_ATP酶的烏本苷結(jié)合構(gòu)象的結(jié)構(gòu)（12-14)通常與觀察到的糖苷配基的 亞型選擇性缺乏一致，因為烏本苷本身對al比a2僅略有選擇性(表2)，但這些結(jié)構(gòu)既不能詳 細(xì)解釋地高辛對a2的中度選擇性，也不能解釋全氫-1，4_氧氮雜草衍生物對a2的增強的選 擇性。不希望受任何特定機制或理論的束縛，假設(shè)本發(fā)明的全氫-1，4_氧氮雜草衍生物(例 如，DGlyN)對a2比對al的選擇性相對高，表明與a2和al的外環(huán)中的亞型特異性殘基的差異 相互作用。糖苷配基和糖基之間的解離速率的非常大的差異強調(diào)結(jié)合至a2的糖的作用。與 DGlyN和DMe部分的改變的洋地黃毒糖衍生物的a2的特異性相互作用也直接通過與地高辛 相比較慢的解離速率表明（圖9和表4)。類似地，表6中更多脂族衍生物諸如DIB對a2P3復(fù)合 物比對aim的增強的選擇性可能表明與0Val89的更特異性的相互作用。目前的發(fā)現(xiàn)證實和 驗證這一觀念，第三洋地黃毒糖殘基的修飾可增加對a2亞型的選擇性。
[0123] 總之，本文所述的a2_選擇性地高辛衍生物降低眼內(nèi)壓，并且因此具有作為控制 I0P和預(yù)防青光眼的新型藥物的潛力。當(dāng)通過劑量和尤其是效果的持續(xù)時間評價時，最高a 2_選擇性化合物DMe和DGlyN比中度a2_選擇性地高辛或非選擇性地高辛配基明顯更有效。 此外，當(dāng)考慮到a203的選擇性與化合物例如DIB時，觀察到優(yōu)異的效力。一個重要的結(jié)論是， a2P3確實起產(chǎn)生房水的主要作用，如可以從NPE細(xì)胞中其突出表達所預(yù)測的。
[0124] 本文所述的新的全氫-1，4_氧氮雜草衍生物也可具有良好的安全性，使得它們適 于作為藥物候選物。a2P3_選擇性強心苷的局部毒性，即角膜和晶狀體的腫脹應(yīng)最小，因為 角膜內(nèi)皮表達al和少量的a3但無a2,且晶狀體上皮僅表達al。另外，全身性心臟毒性效應(yīng)應(yīng) 最小。
[0125] 最后，更疏水的洋地黃毒苷的全氫-1，4_氧氮雜草衍生物在降低高眼壓癥上，和/ 或作為強心劑可能甚至比地高辛衍生物更有效。
[0126] 實施例5 -對大鼠眼內(nèi)壓的效果 為了評價本發(fā)明的化合物在慢性高眼壓癥的動物模型中是否能夠控制I0P，和為了評 估其局部和全身毒性，例如通過使用微珠阻止房水外流在大鼠中誘導(dǎo)高眼壓癥(24)。每日 加入地高辛衍生物且隨后出現(xiàn)I0P變化、炎癥、角膜水腫或晶狀體透明的跡象。對于全身毒 性，通過放射免疫測定法測定血液中的地高辛衍生物的濃度。
[0127] 實施例6:實驗部分 材料 大腸桿菌XL-1藍色株用于質(zhì)粒構(gòu)建的繁殖和制備。來自ICN Biomedicals Inc的酵母 裂解酶（目錄152270)用于畢赤酵母蛋白酶缺陷菌株SMD1165(his4，prbl)的轉(zhuǎn)化。DDM(目錄 D310)和C12E8(25% w/w，目錄號0330)購自Anatrace。合成的SOPS(鈉鹽）獲自Avanti Polar Lipids，并作為氯仿溶液儲存。BD Talon金屬親合樹脂（目錄635503)獲自Clontech。膽固 醇、烏本苷(03125)、地高辛(D6003)、4_氨基吡啶(A78403)和IB-MECA(I146)獲自 Sigma。甲 醇HPLC梯度購自Baker。所有有機溶劑和胺類均為最高純度分析級。
[0128] ha 1 1、ha 1 h02、ha 1 h03、ha 2h01、ha 2h02、ha 2h03、ha 3h01 構(gòu)建的制備 將人m、f32和f33克隆到含有人al或a2的PHIL-D2表達載體中。預(yù)先生成含有豬(p) al、 人(h) al或人a2(其帶有HisxlO標(biāo)記的豬f31)的pHIL-D2表達載體(7,9)4305載體中的人f31 (登記：P05026)、人02(登記：P14415)和人03(登記:P54709) cDNA是來自K. Geering Univ. Lausanne 5*;^261'1311(1的禮物。使用含有1^111和3311切割位點的合成引物通過聚合酶鏈 反應(yīng)(PCR)分別擴增hm、hP2和hP3(pSD5中）的開放閱讀框和側(cè)翼區(qū)。每一個擴增片段用 Bglll和Sail消化，并連接到Bglll和Sail處理的質(zhì)粒pHIL-D2-(pal/Hisl0pm)上以生成 PHIL-D2 (pal/HislOhm或2或3)。將含有hm、h02和M3的片段從pHIL-D2-(pal/Hisl0hm 或2或3)切除并亞克隆到pHIL-D2_(hal/Hisl0pm)或pHIL-D2_(ha2/Hisl0pm)中以產(chǎn)生 pHIL-D2-(hal/Hisl0hm 或2或3)和 pHIL-D2-(ha2/Hisl0hm 或2或 3)。通過限制性酶消化和 測序分析新建質(zhì)粒的正確整合和正確的插入序列。在大腸桿菌XL-1藍(E.coli XL-1 Blue) 中大量制備每個構(gòu)造的DNA用于畢赤酵母轉(zhuǎn)化。
[0129] 酵母轉(zhuǎn)化。人Na，K-ATP酶亞型的表達和純化 轉(zhuǎn)化、畢赤酵母克隆培養(yǎng)、Na，K-ATP酶人亞型(<1101、€[201、€[301)的蛋白表達、膜制備、 DDM中膜的溶解以及在BD-Talon珠上純化的方法已進行了詳細(xì)描述(6-9，11，25)。在最初的 實驗中，將三種純化的亞型復(fù)合物（0.3-0.5 11^/1111)從含有咪唑17011^、似(：110011^; Tricine.HCl 20 mM pH 7.4;C12E8,0.1 mg/ml;S0PS 0.07 mg/ml膽固醇0.01 mg/ml，甘油 25%的溶液中的BD-Talon珠中洗脫。在以后的實驗中，在aimFXYDl、a2mFXYDl和a3mFXYDl 復(fù)合物洗脫之前，將亞型復(fù)合物用純化的FXYD1在BD-Talon珠上重構(gòu)在一起，如（10，11)中 詳細(xì)所述。將蛋白質(zhì)在_80°C下貯存。蛋白質(zhì)濃度用BCA(B9643 Sigma)測定。
[0130]純化的亞型復(fù)合物的Na，K-ATP酶活性的試驗 CG' s 對洗滌劑可溶（detergent-soluble)的a 101、a201 和a301復(fù)合物的Na，K_ATP 酶活 性的抑制使用邱或aPFXYDl復(fù)合物如（6)所述進行測定。FXYD1的存在或不存在不影響強心 苷對Na，K-ATP酶活性的抑制(6)，但強烈穩(wěn)定復(fù)合物(9-11)。Ko.況通過含有固定的60mM的總 K+氯化膽堿和恒定的140mM的NaCl的培養(yǎng)基中變化的K濃度進行評估。將曲線擬合成Hi 11函 數(shù)v=Vmax* [ S]7 ([ S]n +Kn)，其中S為K濃度，n為Hi 11系數(shù)且Kn為K〇. 5K。為了比較不同的曲線， 計算和重新繪制每個曲線的v/Vmax比率。在評估本發(fā)明的強心苷對Na，K-ATP酶活性的抑制 的實驗中，計算抑制百分?jǐn)?shù)VCG/V0,并通過將數(shù)據(jù)擬合至函數(shù)VCG/V0 = Ki /([CG] + Ki) + c獲得Ki值。在3-8個獨立實驗中評估抑制并計算平均Ki值土 SEM。通過未配對的學(xué)生t檢驗 (P值)計算Kial和Kia2之間的差異顯著性。計算每種化合物的Kial/a2土 SEM的比率，并通過 與地高辛比較計算P值。P值〈0.05被認(rèn)為是顯著的。
[0131] 強心苷的解離速率將純化的a2mFXYDl復(fù)合物(0.3-0.5mg/ml)在含有ATP，lmM; NaCl 100mM;MgCl2,4mM組氨酸.HC1 25mM pH 7.4無(對照）或有1虛的不同強心苷的培養(yǎng) 基中在37°C下溫育30分鐘。然后將酶溶液稀釋100倍至含有l(wèi)OOmM NaCl、5mM KCl、lmM EDTA (Tris)、0.005 mg/ml C12E8、0.01 mg/ml SOPS和0.001 mg/ml膽固醇的培養(yǎng)基中并在37°C 下溫育不同的時間長度。在不同的時間取出等分試樣并經(jīng)0.5分鐘（地高辛配基）或2分鐘 (其它強心苷)在含有200yM ATP的標(biāo)準(zhǔn)活性培養(yǎng)基中一式三份測定Na，K-ATP酶活性。將測 試樣品的活性除以對照樣品的活性并通過將數(shù)據(jù)擬合至函數(shù) Vt=V〇〇erkt+C分析抑制逆轉(zhuǎn)的 時間過程。通過從每個活性值中減去恒定值c并重新擬合比率vt/ V〇〇= l_eTkt獲得不同實驗 比較的標(biāo)準(zhǔn)曲線(例如如圖9)。
[0132] 地高辛的全氫-1，4-氧氮雜草衍生物的合成 不同的地高辛全氫-1，4-氧氮雜卓衍生物的合成以兩個步驟進行：1)用高碘酸鈉氧化 地高辛以得到第三糖部分中開環(huán)的二醛和2)在NaCNBH3存在下用伯胺還原胺化，閉合7元環(huán) 以得到地高辛全氫-1，4-氧氮雜草衍生物。作為實例，下面提供DGlyN的合成。對本領(lǐng)域技術(shù) 人員顯而易見的是，本發(fā)明的其它化合物可通過相同或類似的方法來制備。
[0133] 用NaI〇4氧化地高辛（26) 在50ml聚丙稀試管中，在室溫攪拌下將NaI〇4(400 mg，1840 ymol)在H2〇(4 ml)中的溶 液加入到地高辛(400 mg，512 wnol)在95% Et0H(36 ml，未完全溶解）中的懸浮液中，并將 立即溶解的混合物在室溫下靜置1 hr。在這段時間內(nèi)形成沉淀物。通過以3,000x g離心15 min并通過注射過濾器(PTFE，0.2 um，25 mm)過濾去除沉淀的NaI03。在蒸發(fā)器中濃縮溶液 并用40 ml CHCh萃取。用2x 8 ml水洗滌有機層，經(jīng)無水Na2S〇4干燥，過濾并在蒸發(fā)器中蒸 發(fā)，并高真空過夜以得到二醛，將其溶于48ml無水甲醇中以得到10 mM二醛溶液。
[0134] 用甘氨酰胺鹽酸鹽還原胺化 將甘氨酰胺鹽酸鹽(28.2 1^，256 _〇168，1^=110.54 41乜1(*)加入到地高辛二醛 (180 mg = 240 wnoles)溶液中以分別得到12mM和10mM的濃度。用濃乙酸甲醇溶液將表觀 pH校正至5-6,并將混合物在室溫下保持5 min。在攪拌下用NaCNBH3(59.6 mg，480 wnoles， MW = 123.95,20禮)還原形成的5(*1€€堿。反應(yīng)進程通過11(：(含丙酮/〇1(：13(3:2)的310 2)監(jiān) 測。將混合物靜置1.5 h，DGlyN的產(chǎn)生和地高辛二醛的消失通過質(zhì)譜法證實，并通過旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)和高真空過夜蒸發(fā)甲醇。由于可能發(fā)生副反應(yīng)，諸如酸或堿誘導(dǎo)的二醛水解成雙-洋地 黃毒糖苷，因此對最終產(chǎn)物進行純化。將DGlyN反應(yīng)混合物溶于最小量(5.4 ml)的50%甲醇 中，通過注射過濾器0.2 _，PTFE過濾，并用于HPLC純化（圖2B)。HPLC純化在Purospher STAR RP-18e半制備柱上，用梯度的50-80%甲醇水溶液以4 ml/min的流速以15柱體積洗脫 來進行。在施加到半制備柱之前，使用在分析性HPLC運行(Chromolith RP-18e)中建立的甲 醇最佳梯度純化其它衍生物。甲醇為JT Baker HPLC梯度級。
[0135] 通過類似的方法制備其它化合物。它們的質(zhì)譜數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于表1中。
[0136] 洋地黃毒苷衍生物可通過如本文所述的類似方法，使用洋地黃毒苷構(gòu)架(X = H) 代替地高辛構(gòu)架(X = 0H)來制備。
[0137] 兔子眼內(nèi)壓的測量 動物 將任何性別的約1歲新西蘭白兔(3-3.5 kg)以顛倒的、12小時黑暗/光照循環(huán)在動物房 條件下在分開的籠子里單獨飼養(yǎng)。為了實驗，將動物在安靜和平靜的氣氛下轉(zhuǎn)移到兔限位 器(圖1)。在實驗之前或期間未檢測到眼異常。動物護理和處理得到動物實驗的機構(gòu)委員會 批準(zhǔn)，Weizmann Institute IACUC許可（號04270911_2)〇
[0138] 藥物制備和給藥 將強心苷的儲備溶液溶于乙醇中，并在實驗的每天在磷酸鹽緩沖液(PBS)中稀釋，使得 最終的乙醇濃度不超過1%。
[0139] 建模 將地高辛(坐標(biāo)3B0W)手動引入到與烏本苷(4HYT)結(jié)合的豬腎Na，K-ATP酶的結(jié)構(gòu)中，以 便烏本苷和地高辛的類固醇和內(nèi)酯部分盡可能接近重疊，參見參考文獻。然后將具有結(jié)合 地高辛的結(jié)構(gòu)文件提交至YASARA Energy Minimization Server。用PyMOL制備結(jié)構(gòu)圖。
[0140] 眼內(nèi)壓和角膜厚度測量 兔子的I〇P(mm Hg)使用校準(zhǔn)的Pneumatonometer(型號30，Reichert technologies，圖 1)測量。在I0P測量前約一分鐘將局部麻醉劑鹽酸丁氧普魯卡因（〇.4%，25yl)施用到每個角 膜。在局部給予CG(或PBS作為對照）前和半小時后（零時)讀取兩個基線I0P讀數(shù)。兩次測量 的讀數(shù)幾乎相同，表明CG's對基底I0P無影響。在零時將一滴4AP(40mg/ml，30yl)SlB-MECA (liiM，30iil)給予至每只兔子的兩只眼睛。I0P測量在不同時間進行，如在每個實驗中所示。 在I0P升高數(shù)小時的實驗中，每1.5小時加入4AP或每2小時加入IB-MECA。當(dāng)XmmHg值的標(biāo)準(zhǔn) 差為0? 1-0.4 mmHg之間即X±0.1-0.4 mmHg時接受Pneumatonometer讀數(shù)，表示與由4AP或 113-]\0^4誘導(dǎo)的10?中最少增加31]11]1取相比6-13%的可能誤差和與最高增加61]11]1取相比1.6-6.7%的可能誤差。每個實驗重復(fù)兩或三次，其中具有類似的結(jié)果。在所有情況下，附圖描繪 與對照土SEM相比對I0P的平均效果（即四或六只眼）。未在圖中見到誤差條的地方，誤差比 使用的符號小。與對照的差異顯著性通過未配對的學(xué)生t檢驗(p值)來計算。p值〈0.05被認(rèn) 為是顯著的。在用CG和4AP處理的實驗之前和期間使用超聲測厚儀(Sonogage pachometer， ClevelancUUSA)測量角膜厚度(Mi)。值表示每只眼睛三次獨立測量的平均值。
[0141] 縮寫: I0P，眼內(nèi)壓； CG，強心苷； 4AP，4-氨基吡啶。
[0142] 雖然已經(jīng)說明和描述了本發(fā)明的某些實施方案，但應(yīng)當(dāng)清楚的是本發(fā)明不限于本 文描述的實施方案。多種修改、改變、變化、替代和等同物對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而 易見的，而不脫離如隨后權(quán)利要求所述的本發(fā)明的精神和范圍。
[0143] 參考文獻
【主權(quán)項】
1. 一種由通式(I)的結(jié)構(gòu)代表的化合物：R選自 0H、Ci-C6烷基、C廣C6面代烷基、-(CRbRG)nSi(Ra)3、-(CRbRG)n-C(=Y)-NRlR2、- (CRbRc) n-C (=Υ) -NHOH、- (CRdRe) n-C (=Υ) -COOR3;和-NHC (=Υ) NRIR2 ; Υ為Ο或S; X為Η或OH; Ri、R哺R3各自獨立地為Η或C1-C4烷基； R3為C廣C4烷基； Rb、RG和Rd各自獨立地選自Η、打-C4烷基和打-C4^基烷基； R6選自C廣C4烷基和C廣C4徑基烷基；且 η為0、1或2; 包括鹽、水合物、溶劑合物、多晶型物、幾何異構(gòu)體、旋光異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、非對映異 構(gòu)體及其混合物。2. 權(quán)利要求1的化合物，其中R選自CZ3、-CZ2CZ3、-(C也）2C也、-CH(C也）2、-(CH2)3C出、- C也CH (C也）2、-CH( C也）C也C也和-C (C也）3，其中每個Z在每次出現(xiàn)時獨立地為Η或面素。3. 權(quán)利要求2的化合物，其中每個Ζ為Η或F。4. 權(quán)利要求1的化合物，其中Ri、R哺R3各自為Η。5. 權(quán)利要求1的化合物，其中η為1或2。6. 權(quán)利要求1的化合物，其中Υ為0。7. 權(quán)利要求1的化合物，其中R選自-C也-C (=0) -Ν也、-C也、-(C也）2-C (=0)-畑2、NHC (=0)- Ν也、0Η、-CH( C出）C0NH2、-CH( CH20H ) C00H、-CH( CH20H ) CON也、-CH2C 也、-CH2C 也邸3、-CH2C (師)2、-CH2CF3、-CH2CON冊Η、-畑CSNH2、-CH2CH2F、-CH (邸2) 3-、-C (師)3和-CH2-Si (師)3。8. 權(quán)利要求1的化合物，其中X為0H，且所述化合物為地高辛衍生物。9. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-C也-C(=0)-N也(化合物1)。10. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-C也(化合物2)。11. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-(C也)2-C(=0) -N也(化合物3)。12. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-NHC (=0) -N也(化合物4)。13. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為0H(化合物6)。14. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-CH(C也)CON也(化合物8)。15. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-CH(C出OH)COOH(化合物9)。16. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-CH(C出0H) CON出(化合物10)。17. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-C出C出(化合物12)。18. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-(C出)2C出(化合物13)。19. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-C出CH(C出)2(化合物14)。20. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-C出CF3(化合物15)。21. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-C出C(=0)-畑0H(化合物17)。22. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-NHCSN出(化合物18)。23. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-C出C出F(化合物19)。24. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-CH(C出Μ化合物21)。25. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為-C(C出)3 (化合物22)。26. 權(quán)利要求8的化合物，其中R為甲基(Ξ甲基甲娃烷基）（-C出-Si(C出)3)(化合物23)。27. 權(quán)利要求1的化合物，其中X為Η，且所述化合物為洋地黃毒巧衍生物。28. 權(quán)利要求1的化合物，其中相對于化，Κ-ΑΤΡ酶的其它亞型，所述化合物對化，Κ-ΑΤΡ 酶的α2亞型具有選擇性。29. 權(quán)利要求28的化合物，其中相對于化，Κ-ΑΤΡ酶的α 1β1亞型，所述化合物對化，Κ-ΑΤΡ 酶的α2β1、α2的和/或α2盼亞型具有選擇性。30. -種藥物組合物，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的式（I)的化合物和藥學(xué)上可 接受的載體或賦形劑。31. 權(quán)利要求30的組合物，其為適合于W滴眼液、軟膏、懸浮液、凝膠或乳膏的形式局部 施用至眼的眼用組合物。32. 權(quán)利要求30的組合物，其進一步包含至少一種藥學(xué)上可接受的選自穩(wěn)定劑、防腐 劑、馨合劑、粘度改性劑、緩沖劑和抑調(diào)節(jié)劑中的一種或多種的試劑。33. -種用于降低高眼壓癥或治療青光眼的方法，其包括向需要此類治療的個體給予 有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項的化合物或根據(jù)權(quán)利要求30至32中任一項的藥物組 合物的步驟。34. 根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項的化合物或根據(jù)權(quán)利要求30至32中任一項的藥物組 合物用于制備降低高眼壓癥或治療青光眼的藥物的用途。35. 權(quán)利要求33的方法，或權(quán)利要求34的用途，其中所述高眼壓癥與青光眼相關(guān)。36. -種用于降低高眼壓癥或治療青光眼的方法，其包括向需要此類治療的個體給予 有效量的由式(ΙΑ)的結(jié)構(gòu)代表的化合物的步驟：其中 R選自 0H、Ci-C6烷基、C廣C6面代烷基、-(CRbRG)nSi(Ra)3、-(CRbRG)n-C(=Y)-NRlR2、- (CRbRc) n-C (=Υ) -ΝΗΟΗ、- (CRdRe) n-C (=Υ) -COOR3; -NHC (=Υ) NRIR2 ;和-(CRbRc) n-N 也； Y為0或S; X為H或OH; Ri、R哺R3各自獨立地為H或C1-C4烷基； R3為C廣C4烷基； Rb、R。、Rd和R6各自獨立地選自Η、打-C4烷基和Ci-C4徑基烷基;且 η為0、1或2; 包括鹽、水合物、溶劑合物、多晶型物、幾何異構(gòu)體、旋光異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、非對映異 構(gòu)體及其混合物。37. 權(quán)利要求36的方法，其中R選自-C也-C(=0)0H、-C也-C(=0)-0C也和C也-C也-畑2。38. 權(quán)利要求36的方法，其中X為0H，且所述化合物為地高辛衍生物。39. 權(quán)利要求38的方法，其中R為-C也-C(=0)0H(化合物5)。40. 權(quán)利要求38的方法，其中R為-C也-C(=0)-0C也(化合物7)。41. 權(quán)利要求38的方法，其中R為-C也-C也-N也(化合物11)。42. 權(quán)利要求36的方法，其中X為Η，且所述化合物為洋地黃毒巧衍生物。43. 權(quán)利要求36至42中任一項的方法，其中相對于化，Κ-ΑΤΡ酶的其它亞型，所述化合物 對Na，Κ-ΑΤΡ酶的α 2亞型具有選擇性。44. 權(quán)利要求43的方法，其中相對于化，Κ-ΑΤΡ酶的α 1β1亞型，所述化合物對化，Κ-ΑΤΡ酶 的口2化、α2的和/或α2盼亞型具有選擇性。45. 權(quán)利要求36至44中任一項的方法，其中式（ΙΑ)的化合物在包含所述化合物和藥學(xué) 上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物中給予。46. 權(quán)利要求45的方法，其中所述組合物為適合于W滴眼液、軟膏、懸浮液、凝膠或乳膏 的形式局部施用至眼的眼用組合物。47. 如權(quán)利要求36中所定義的式(ΙΑ)的化合物或包含運種化合物的藥物組合物用于制 備降低高眼壓癥或治療青光眼的藥物的用途。48. 權(quán)利要求36至46中任一項的方法，或權(quán)利要求47的用途，其中所述高眼壓癥與青光 眼相關(guān)。49. 一種強屯、組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項的式（I)的化合物或如權(quán)利 要求36中所定義的式(ΙΑ)的化合物。50.根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項的式（I)的化合物或如權(quán)利要求36中所述的式（ΙΑ)的 化合物作為強屯、劑的用途。
【文檔編號】C07J19/00GK105849117SQ201480059614
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年8月27日
【發(fā)明人】S.J.D.卡里斯, A.卡茨, D.M.塔爾, A.馬科維奇
【申請人】耶達研究及發(fā)展有限公司