一種用NsiI鑒定人乳腺癌BRCA1基因rs8176318多態(tài)性的方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術領域，設及一種用化i I鑒定人乳腺癌BRCAl基因rs8176318多 態(tài)性的方法。
【背景技術】
[0002] 單核巧酸多態(tài)性（single nucleotide polymor曲ism,SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個核巧酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括剪輯的置換/插入和缺失等形式。 SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種，現(xiàn)已廣泛用于簡單和復雜疾病的遺傳連鎖分析/ 關聯(lián)分析及疾病易感基因的定位，指導易感基因克隆.較常見的單堿基多態(tài)性位點的檢測 方法包括聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性技術(PCR-RFLP)，S引物等位基因擴增 法(TP-PCR)和測序等方法。運些方法雖各有優(yōu)點，但也各有其不足之處。
[0003] PCR-RFLP是一種快速，簡便，準確的檢測SNP基因型的經(jīng)典方法。其原理是:限制性 內切酶是一類識別DNA特異位點(通常4-6bp)，并在特異位點進行切割的酶類。酶切位點的 特異性意味著對特定等位基因的完全消化會產(chǎn)生同樣的片段序列。而堿基的置換，插入和 缺失可W產(chǎn)生或消除一個特定酶切位點，從而改變酶切后產(chǎn)生片段的大小和數(shù)目。運些酶 切片段帶型的不同稱為限制性片段長度多態(tài)性。如果SNP產(chǎn)生和消除了某個限制性內切酶 位點，則可W通過對PCR產(chǎn)物進行酶切、電泳加W檢測。改方法的優(yōu)點在于快速簡單，終點判 斷準確。但其主要缺點在于酶切位點的選擇，要求待測多態(tài)性位點和某一酶切位點相關。 PCR-RFLP酶的選擇具有局限性，并不是所有的SNP位點都可W用運種方法來鑒別，且部分內 切酶價格昂貴，實驗成本高。S引物等位基因擴增法(TP-PCR)-種不需要限制性內切酶和 連接酶的重組DNA方法。反應體系中有巧中模板和巧中引物，從而在同一個反應體系中產(chǎn)生一 個重組DNA分子。運種方法的主要優(yōu)點是快速，不依賴連接片段的限制酶位點。但其缺點是 擴增效率低，擴增特異性差，無法保證PCR產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性，分型結果易造成誤判。 化qman巧光探針法是一種新型高效準確的基因分型方法，其優(yōu)點是檢測靈敏度高，分型準 確。但該方法需要昂貴的儀器和較長的步驟，成本較高。
[0004] 乳腺癌1號基因（breast cancer 1 ,BRCAl)位于人類染色體17q2UBRCAl編碼一種 核蛋白，在維持基因組穩(wěn)定性中起作用。其編碼的蛋白質與其他腫瘤抑制基因、DNA損傷傳 感器及信號轉導形成一個大的多亞基蛋白復合物稱為BRCAl相關的基因組監(jiān)控復合體 (BASC)。該基因產(chǎn)物與RNA聚合酶II關系密切，并通過C端結構域，與組蛋白去乙酷化酶復合 物的相互作用。BRCAl蛋白因此在轉錄、雙鏈斷裂的核酸修復和重組中發(fā)揮了重要作用。另 外有發(fā)明表明，BRCAl和BRCA2是兩個最重要的乳腺癌抑癌基因，若其發(fā)生基因突變將導致 DNA損傷修復能力降低，突變長期積累為細胞發(fā)生癌變、腫瘤發(fā)生和發(fā)展奠定了基礎。目前 BRCAl已經(jīng)被證實是乳腺癌遺傳易感基因，與家族性乳腺癌密切相關，其基因突變可W常染 色體顯性遺傳方式傳遞給子代。BRCAl基因突變的攜帶者一生中患乳腺癌，卵巢癌危險顯著 增加，到70歲時發(fā)生乳腺癌的預測累積風險可達到大約80%，同時容易早年發(fā)病。
[0005] BRCAl基因rs8176318位點多態(tài)性在人群中存在S種基因型：GG型（人基因組 rs8176318多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為G)，GT型（人基因組rs8176318多態(tài)位點的兩 個等位基因堿基分別為G和T)和TT型（人基因組rs8176318多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均 為T)(美國國立衛(wèi)生發(fā)明院國立醫(yī)學圖書館生物信息技術中屯、，http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)。
[0006] 目前人BRCAl基因多態(tài)rs8176318的鑒定常采用PCR-RFLP方法。但是目前鑒定人 BRCAl基因多態(tài)rs817631別寸常使用的限制性內切酶價格昂貴(關于部分內切酶的參考價格 可參考后面的表1)，實驗成本高，難W在實驗室中普及使用。
[0007] 因此，本領域存在對操作簡單，成本低，使用范圍廣的新型檢測SNP方法的需求。本 領域迫切需要在節(jié)約實驗成本的前提下，通過PCR-RFLP技術的改進，來開發(fā)經(jīng)濟、快速的檢 測人BRCAlrs8176318基因多態(tài)性的試劑盒。

【發(fā)明內容】

[000引為了克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用NsiI鑒定人乳腺癌BRCAl基 因rs8176318多態(tài)性的方法，該方法是改進傳統(tǒng)的PCR-RFLP技術，通過創(chuàng)造酶切位點法 (Created Restriction Site PCR，CRS-PCR)，應用引物3'端錯配技術，在PCR產(chǎn)物進行酶切 電泳后進行基因型的鑒定，從而提供一種操作簡單、成本低、適用范圍廣泛的檢測人 BRCAlrs8176318多態(tài)性的方法及檢測試劑盒。
[0009] 其技術方案如下：
[0010] 一種用化il鑒定人乳腺癌BRCAl基因rs8176318多態(tài)性的方法，包括W下步驟：
[0011] (a)抽提樣品的基因組DNA;
[0012] (b)提供擴增人BRCAl基因多態(tài)性rs8176318位點附近序列的正向引物和反向引 物，W所述待測人基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應，獲取擴增產(chǎn)物；
[0013] (C)使用限制性內切酶對所述擴增產(chǎn)物進行酶切，獲取相應的酶切產(chǎn)物；
[0014] (d)將酶切產(chǎn)物采用3 %的瓊脂糖凝膠進行電泳，W判定BRCAl基因多態(tài)性 rs8176318位點的各基因型；
[0015] 其中，所述反向引物其3'末端倒數(shù)第一位堿基與多態(tài)rs8176318堿基相鄰一個堿 基，倒數(shù)第S位堿基為錯配堿基T，在擴增產(chǎn)物中與多態(tài)T等位基因形成ATGCAT結構，第二個 堿基T為多態(tài)等位基因，第六個堿基T為錯配堿基。
[0016] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果：
[0017] 本發(fā)明針對使用CRS-PCR鑒定BRCAlrs8176318多態(tài)性，對傳統(tǒng)PCR-R化P法進行改 進，應用了引物3'端錯配技術，克服了傳統(tǒng)PCR-RFLP法內切酶選擇余地小，價格昂貴，實驗 成本高等缺點，本發(fā)明建立的BRCAlrs8176318多態(tài)性的檢測方法，內切酶價格十分便宜，同 時PCR產(chǎn)物純度較高，酶切結果易于分辨。該檢測方法通過測序驗證，其結果準確可靠。
【附圖說明】
[0018] 圖1是BRCAlrs8176318位點的電泳圖譜；
[0019] 圖2是服CAlrs8176318位點GG基因型測序圖譜；
[0020] 圖3是BRCAlrs8176318位點GT基因型測序圖譜；
[0021] 圖4是BRCAlrs8176318位點TT基因型測序圖譜。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明的技術方案。
[0023] 本發(fā)明的方法可W通過引物上的錯配堿基將SNP附近的序列改變?yōu)榭杀活A先確定 的限制性內切酶識別的序列。因此，可W克服傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法所存在的需要采用昂貴 內切酶的缺陷，進而大大降低了檢測SNP的成本。具體而言：由于在該反向引物序列中倒數(shù) 第S位堿基為錯配堿基T(該堿基在人BRCAl基因序列中的相應位置為G)，因此錯配后PCR產(chǎn) 物中多態(tài)附近序列由AGGCAG或ATGCAG更改為AGGCAT或ATGCAT(其中第二個堿基G/T多態(tài)位 點，第六個堿基T為錯配堿基）。因此擴增產(chǎn)物中T等位基因片段可被識別ATGCAT序列的限 制性內切酶識別（即T等位基因片段可被內切酶切開）；進而，可W根據(jù)片段切開情況來判斷 多態(tài)基因型。更具體地，經(jīng)序列分析可知，基因原始序列中G/T多態(tài)可由表1中前兩種內切酶 識別。如通過堿基錯配PC時尋多態(tài)性位點后面第四位堿基G改變?yōu)門，則該多態(tài)為T等位基因 經(jīng)PCR擴增后包含ATGCAT序列可被識另ijATGCAT序列的限制性內切酶化i I識別，而G等位基因 不能切開。
[0024] 經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，檢測該G/T多態(tài)的方法可使用表一中的S種酶，其中表中前兩種 酶價格昂貴，且酶切效果不理想。在采用創(chuàng)造酶切位點法（Created Restriction Site PCR，CRS-PCR)對反向引物序列中倒數(shù)第S位堿基錯配為T后，PCR產(chǎn)物中多態(tài)附近序列生成 ATGCAT序列，從而可被限制性內切酶化i I識別。由于識別特定位點的限制性內切酶化il適 用范圍廣，價錢較為經(jīng)濟，進而大大降低了檢測SNP的成本。因此，綜合考慮簡單操作性與經(jīng) 濟實用性，限制性內切酶化i I是不二選擇。
[0025] 表1中提供的限制性內切酶的價格從肥B公司化ttp: //Ww.neb-china. com)，限制 性內切酶的選擇從WatCut限制性內切酶分析軟件上獲取化ttp: //watcut. water Ioo. Ca/ template.php?act = 3噸_116?〇，W此作為限制性內切酶識別位點和價格的參考。
[0026] 表1幾種限制性內切酶識別序列及其價格
[0027]
[0028] 在本發(fā)明的實施方案中，正向引物和反向引物的設計采用Primers.0軟件進行，設 計的原則綜合考慮引物對PCR擴增的靈敏度、特異度W及擴增效率的影響。按照堿基互不配 對的原則設計引物，引物長度一般在15~30堿基之間，過長或短均會造成特異性差，過長還 會導致其延伸溫度大于74°C，不適于化qDNA聚合酶進行反應。引物GC含量在40 %~60 %之 間，Tm值最好接近72°C，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應。堿基要隨機分布，引物自身 及引物之間不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結構使引物本身復性。引物5/ 端和中間AG值應該相對較高，而y端AG值較低。擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結構。引物 應具有特異性，引物設計完成W后，應對其進行blast檢測，W確保其與其它基因不具有互 補性。
[0029] 最終正向引物由選自下列的核巧酸序列構成:GCTTGAAGTCTCCCTTGGAAATCTG。
[0030] 反向引物由選自下列的核巧酸序列構成:TTCCATTGAAGGGTCTGACTCTA