一株高產(chǎn)甘蔗糖蜜酒精的基因重組釀酒酵母的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物工程領(lǐng)域，具體設(shè)及到到釀酒酵母的基因改造及甘薦 糖蜜酒精發(fā)酵菌株選育。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物質(zhì)資源是公認(rèn)的地球上最大的可再生資源，隨著石油等不可再生資源的日益 枯竭，對可再生的生物質(zhì)資源的研究越來越廣泛和深入，已經(jīng)上升到國家可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn) 略高度。甘薦糖蜜是薦糖生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，其中含有約50%的糖分，是廣西、廣東南部 和云南等薦糖產(chǎn)區(qū)酒精發(fā)酵生產(chǎn)的主要原料。利用甘薦糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)酒精不僅可W解決生 產(chǎn)污染環(huán)境問題，而且能夠減少酒精生產(chǎn)對糧食的消耗，具有重要的產(chǎn)業(yè)意義。但是，甘薦 糖蜜除含有能夠被釀酒酵母用于發(fā)酵產(chǎn)酒精的糖分外，還含有一部分不能被釀酒酵母利用 的糖分。運(yùn)部分糖分通常稱為非發(fā)酵糖分，主要由化-0- α -D-化喃半乳糖基-D-葡萄糖）、 棉子糖（β -D-巧喃果糖基-0-α -D-化喃半乳糖基-(1 一 6) - α -D-化喃葡萄糖巧）、水蘇 糖（D-化喃半乳糖基α -1，6-D-化喃半乳糖基α -1，6-D-化喃葡糖基α -1，2-β -D-巧喃果 糖巧）等構(gòu)成，通常占甘薦糖蜜總重量的5%，約占甘薦糖蜜總糖分的10%。近年來，隨著 制糖技術(shù)的進(jìn)步，甘薦糖蜜中非發(fā)酵糖分的含量顯著增高，一般達(dá)到了 7%，最高可達(dá)8%。 目前，工業(yè)生產(chǎn)對利用甘薦糖蜜非發(fā)酵糖分發(fā)酵生產(chǎn)酒精尚屬技術(shù)難題。如果將非發(fā)酵糖 分用于及酒精發(fā)酵將顯著降低甘薦糖蜜酒精生產(chǎn)的原料單耗，具有很高的經(jīng)濟(jì)意義。
[0003] α -半乳糖巧酶能特異性水解半乳糖類寡糖和多聚半乳-(葡）甘露聚糖的非還原 性末端α -1,6-半乳糖巧鍵，因此它能水解蜜二糖、棉巧糖、水蘇糖和毛蕊花糖等低聚糖， 也能水解半乳甘露聚糖和神經(jīng)銷氨醇己Ξ糖巧的高級同系物和衍生物。早年Emolio等將 里氏木霉的3個編碼α -半乳糖巧酶的基因 agll，agl2，agl3導(dǎo)入釀酒酵母菌株，結(jié)果能夠 使釀酒酵母水解蜜二糖和棉子糖，釋放出半乳糖。近年來國內(nèi)有報(bào)道將粟酒裂殖酵母編碼 該酶的基因 mel導(dǎo)入釀酒酵母，使后者能夠利用蜜二糖作為唯一碳源生長。但是，目前對該 酶的重組表達(dá)研究還局限于模式釀酒酵母菌株，本發(fā)明是將里氏木霉的α -半乳糖巧酶基 因 agl3導(dǎo)入野生型的釀酒酵母中，通過基因重組的方法獲得可W有效利用糖蜜非發(fā)酵糖 分提高酒精產(chǎn)率的工業(yè)用菌株，本發(fā)明對糖蜜酒精生產(chǎn)意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一株利用甘薦糖蜜混合發(fā)酵酒精產(chǎn)量高達(dá)14% (V/V)的基因重組釀 酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiaeTGSll)。該菌株是發(fā)明人利用分子手段將里氏木 霉的α -半乳糖巧酶基因轉(zhuǎn)化到野生型工業(yè)用釀酒酵母中進(jìn)行基因重組，經(jīng)過篩選獲得， 已于2013年11月10日保藏于位于中國武漢市武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏 編號為CCTCC No. Μ 2013562。本發(fā)明成功地將里氏木霉的α-半乳糖巧酶基因?qū)胍吧?釀酒酵母菌株中并實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定高效的表達(dá)，W此實(shí)現(xiàn)了對野生型釀酒酵母菌的基因重組改 造，相關(guān)技術(shù)在國內(nèi)外還未見報(bào)道。轉(zhuǎn)化后的菌株用30Βχ°和50Βχ°糖蜜混合發(fā)酵，30°C， 180~20化pm條件下酒精產(chǎn)量達(dá)到14%。
【附圖說明】
[0005] 圖 1 :PCR 擴(kuò)增 agl3 基因的凝膠電泳圖 PCR(M :DL2000DNAMarker ;1 :agl3 基因）
[0006] 圖 2 :pYX212-agl3BamHI 單酶切凝膠電泳圖（Μ : λ-Hind III digest DM Marker ; 1 :BamH I 酶切的 ρΥΧ212 ;2 :BamH I 酶切的 pYX212-agl3)
[0007] 圖3 :PCR擴(kuò)增的帶有TPI啟動子和終止子的TPIP-agl3-TP口瓊脂糖凝膠電泳圖 (M:l肺 DNA Ladder Marker ;1 :TPIP-agl3-TPIT)
[0008] 圖4基因重組菌株在不同鍵度甘薦糖蜜的細(xì)胞生長和乙醇發(fā)酵曲線（注： A-10。Bx糖蜜培養(yǎng)基；B-20。Bx糖蜜培養(yǎng)基；C-30。Bx糖蜜培養(yǎng)基；D-40。Bx糖蜜培養(yǎng) 基；"1"-膠液酒精濃度和可發(fā)酵殘?zhí)亲兓€；"2"-膠液殘總糖含量和細(xì)胞數(shù)變化曲線。 MF1001 為原始菌株，MFA1001-3 為 Saccharomyces cerevisiaeTGSll 連續(xù)傳代培養(yǎng) 50 代的 菌株）
【具體實(shí)施方式】
[0009] 實(shí)施例1 :基因工程菌株的構(gòu)建
[0010] PCR擴(kuò)增里氏木霉的α-半乳糖巧酶基因 agl3,并連接到載體PYX212上，得到 pYX212-agl3；
[0011] 根據(jù)PYX212上位于讀碼框兩側(cè)的TPI啟動子和終止子序列設(shè)計(jì)引物，并在引物的 5'端加有酵母基因組同源整合序列CCACAGCAGT，W pYX212-agl3為模板擴(kuò)增得到帶有TPI 啟動子和終止子的目的基因 TPIP-agl3-TP口；
[0012] 將TPIP-agl3-TP口片段電轉(zhuǎn)化至野生型釀酒酵母的單倍體細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的菌 液接入復(fù)倍培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，涂布YPD平板，單菌落接入液體YPR(1 %化ast Extract, 2% Peptone, 2% Ra巧nose)培養(yǎng)基中，利用酶標(biāo)儀測定菌液在0D600下的吸光值進(jìn)行篩選。
[0013] 對篩選出的生長速率較高的菌株再經(jīng)過YPSR培養(yǎng)基（27%薦糖，3%棉巧糖，2% Tryptone，l%化ast extract)發(fā)酵測定酒精產(chǎn)量進(jìn)行復(fù)篩。
[0014] 對最終篩選出的重組子提取總DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
[0015] 實(shí)施例2 :篩選出的高產(chǎn)菌株在不同鍵度的甘薦糖蜜培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長速率、 酒精發(fā)酵濃度、對糖分利用能力的測定
[0016] 本發(fā)明中所用的原料甘薦糖蜜符合地/T2685-2005標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)酵時(shí)先用YTO培養(yǎng)基 (溶解 20g P巧tone, lOg Yeast Extract 于 900血水中，121°C高壓滅菌 20min，加入 100血 20gGlucose單獨(dú)滅菌后加入）活化菌株，按5% (V/V)的接種量接入到濃度分別為10Βχ°、 20Βχ°、30Βχ°、40Βχ°的糖蜜發(fā)酵液中（將糖蜜稀釋至一定鍵度，添加0. 2% (W/W)尿素 和0. 02 % (W/W)憐酸，用濃H2SO4調(diào)節(jié)抑值3. 8~4. 0,現(xiàn)配現(xiàn)用），30°C，180巧m培養(yǎng)，ii 定膠液的菌數(shù)、乙醇濃度、總糖含量W及還原糖含量。
[0017] 乙醇濃度的測定：W乙臘為內(nèi)標(biāo)，采用氣相色譜法測定酒精含量。發(fā)酵液 12, 000巧m，5min離屯、，取上清液0. 6ml，加入等量10 %乙臘，補(bǔ)蒸饋水至2. 0ml體積，上氣相 色譜儀測定，根據(jù)乙醇和乙臘的鋒面積計(jì)算酒精含量（％，V/V)。
[0018] 酒精含量（％，V/V)=(乙醇峰面積/乙臘峰面積）X 0. 9936
[0019] 式中：0. 9936為換算常數(shù)，根據(jù)同一條件下測定乙醇和乙臘的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程 求得。
[0020] 氣相色譜條件：FID檢測器，加熱口溫度250。柱箱溫度100。檢測器溫度 325°C，W氮?dú)鉃檩d氣，進(jìn)樣口分流比50 : 1，氮?dú)饪偭髁?0. 5ml/min，檢測器氨氣流量 40ml/min，空氣流量 450ml/min。
[0021] 糖含量測定：取發(fā)酵膠液0. 2ml于2ml離屯、管中，加入1. 8ml蒸饋水，5mg堿性醋 酸鉛，反復(fù)倒置搖勻，12000巧mX5min離屯、，取上清0. 1ml用DNS法測定還原糖。另取上清 液1. 0ml，加入100 μ 1 6mol/L鹽酸，搖勻，70°C水解15min，冰水浴冷卻，加120 μ 1 20%的 化0Η溶液中和，離心取上清液100 μ 1用DNS法測定總糖。DNS法測定還原糖按美國能源 部的方法進(jìn)行。
[0022] 實(shí)施例所設(shè)及的agl3基因序列見序列表。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株能高效發(fā)酵甘鹿糖蜜產(chǎn)酒精的菌株，分類命名為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，菌株號：TGS11，-70°C保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC NO : M2013562,保藏日期：2013年11月10日。2. 權(quán)利要求1所述的能高效發(fā)酵甘蔗糖蜜產(chǎn)酒精的釀酒酵母菌株，其特征在于：是以 工業(yè)用野生型釀酒酵母菌株為出發(fā)菌株，將里氏木霉的α-半乳糖苷酶基因 ag13導(dǎo)入出發(fā) 菌株，導(dǎo)入基因與菌株基因組發(fā)生重組，經(jīng)篩選獲得的。3. 權(quán)利要求1中的釀酒酵母菌株，其特征在于：在30Bx°糖蜜中30°C，200rpm培養(yǎng)24 小時(shí)后加入等體積50Bx°糖蜜繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)56小時(shí)時(shí)酒精產(chǎn)量達(dá)到最高值14% (V/ V)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一株高產(chǎn)甘蔗糖蜜酒精的基因重組釀酒酵母TGS11。該菌株-70℃保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC？NO：M2013562，保藏日期為2013年11月10日。本發(fā)明所提供的釀酒酵母菌菌株具有如下特點(diǎn)：是通過將里氏木霉的α-半乳糖苷酶基因?qū)胍吧歪劸平湍?，基因?qū)牒笈c菌株基因組發(fā)生重組，經(jīng)篩選獲得；菌株TGS11在含有27％蔗糖和3％棉籽糖的培養(yǎng)基中發(fā)酵酒精產(chǎn)率最高可達(dá)16.18％，用30Bx°和50Bx°糖蜜混合發(fā)酵，30℃，180～200rpm條件下酒精產(chǎn)量達(dá)到14％。本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)步是：成功地將外源基因?qū)胍吧歪劸平湍覆?shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，該菌株能高效發(fā)酵甘蔗糖蜜產(chǎn)酒精，具有良好的酒精發(fā)酵生產(chǎn)潛力。CCTCC No：M201356220131110
【IPC分類】C12R1/865, C12N1/19, C12P7/08
【公開號】CN105670953
【申請?zhí)枴緾N201610092062
【發(fā)明人】陳英, 陳東, 陸琦, 陳小玲, 蘆志龍, 黃 俊, 吳仁智, 黃日波
【申請人】廣西科學(xué)院
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年2月19日