C21甾Asclepiasterol及其制備方法與其在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及C21醬Asclepiasterol及其制備方法與 其在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，對其他 結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。腫瘤耐藥是目前臨床化療失敗 的主要原因。據(jù)美國癌癥協(xié)會估計，90% W上腫瘤患者死于不同程度的耐藥。多藥耐藥的產(chǎn) 生機(jī)制非常復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，目前認(rèn)為其主要分子生物學(xué)機(jī)制包括細(xì)胞對藥物的 攝取減少和外排增加、細(xì)胞解毒系統(tǒng)和DNA修復(fù)系統(tǒng)功能增強(qiáng)等。其中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABC家 族能利用ATP水解產(chǎn)生的能量將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物累出胞外，使胞內(nèi)藥物濃度降低，是 最重要的一類耐藥機(jī)制。對多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)劑的開發(fā)已經(jīng)有了 20多年的時間?？茖W(xué)家們發(fā) 現(xiàn)了多種具有逆轉(zhuǎn)作用的藥物，并發(fā)現(xiàn)了多種逆轉(zhuǎn)機(jī)制，但迄今為止，仍然沒有安全有效的 多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)劑上市。因此，對MDR及其逆轉(zhuǎn)藥物的研究一直是腫瘤治療學(xué)及藥物學(xué)研究 的一大難題，尋找有效的逆轉(zhuǎn)劑一直是腫瘤治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
[0003] 馬利筋（Asclepias curassavica L.)為蘿摩科（Ascl邱iadaceae)馬利筋屬一年 或多年生草本植物。原產(chǎn)于熱帶美洲地區(qū)。清代《植物名實(shí)圖考》（1848年)就已有記載，傳入 我國至少已有160多年的歷史，如今在我國熱帶、亞熱帶地區(qū)已廣泛栽種。據(jù)《中華本草》俸 藥篇中記載，味甘，性涼，有小毒，主要功效為調(diào)經(jīng)止血，清火退熱，消腫止痛等。
[0004] 近年來，國內(nèi)外學(xué)者對馬利筋的化學(xué)成分進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，已從其中分離 鑒定數(shù)十種強(qiáng)屯、巧類成分。在此基礎(chǔ)上，我們對馬利筋的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，共分 離得到63個化合物，甲型強(qiáng)屯、醬體35個，C21醬體12個，木脂素類化合物11個，W及其他類型 的化合物5個。通過系統(tǒng)的活性篩選我們發(fā)現(xiàn)C21醬體Asclepiasterol具有很強(qiáng)的腫瘤多藥 耐藥逆轉(zhuǎn)作用。
[0005] 馬利筋具有其它方面的用途。中國發(fā)明專利（101603209)公開了 "一種紡紗用馬利 筋纖維棉條及其加工方法和設(shè)備"設(shè)及紡紗用馬利筋纖維棉條及其加工方法和設(shè)備；另一 發(fā)明專利（104082347A)公開了 "一種具有殺蟲作用的植物提取物"設(shè)及一種效果顯著、環(huán)境 友好的新型植物源殺蟲劑，該殺蟲劑系W馬利筋干燥全草為原料，用乙醇加熱回流提取制 得。發(fā)明專利(201410824396.1)公開了一種富含強(qiáng)屯、巧的馬利筋乳汁提取物及其制備方法 W及在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用運(yùn)些專利均是W馬利筋為研究對象，但是未設(shè)及馬利筋中的 C21醬（非強(qiáng)屯、巧)在腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種C21醬 Asclepiasterol的制備方法，該制備方法W馬利筋的全草為原料。通過酒精提取和乙酸乙 醋萃取，再經(jīng)過硅膠柱層析和重結(jié)晶分離得到C21醬Ascl巧iasterol。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供由上述制備方法得到的具有腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用 的C21醬Asclepiasterol。
[000引本發(fā)明的再一目的在于提供上述C21醬Asclepiasterol在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn) 劑中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明目的通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] -種具有腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用的C21醬Asclepiasterol,結(jié)構(gòu)式如式（1)所示：
[0011]
[0012] 化合物C21醬Asclepiasterol(l)的波譜數(shù)據(jù)：
[0013] [a]〇 -49 :識'1，MeOH);UV(Me0HUmax(log〇203(l.39),229(1.36),273 (0.34)nm;IR(邸r)vmax 3463,2933,1714,1637,1384,1165,1060cm-i;iH and "C NMR data, see Table S1;HRESIMS m/z 927.3624[M-H]-(calcd for Cso出i〇i6,927.3624)
[0014] 表1:1h and "C NMR data for 1
[0017] 1h and 1? NMR data were recorded on 300MHz spectrometers in methanol- d4(Sin ppm J in Hz).
[0018] -種具有腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用的C21醬Asclepiasterol的制備方法，具體包括 w下步驟：
[0019] (1)將馬利筋的全草用酒精提取，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮得到總提取物；
[0020] (2)將總提取物用水稀釋，得到稀釋液；向稀釋液中加入環(huán)己燒進(jìn)行萃取，收集萃 取后的環(huán)己燒層;再向剩下的水層中加入乙酸乙醋進(jìn)行萃取，收集乙酸乙醋層，棄去水層， 將乙酸乙醋層減壓濃縮，得到馬利筋總提取物的乙酸乙醋部位；
[0021] (3)將乙酸乙醋部位用硅膠柱進(jìn)行層析，依次采用體積比為100:0,100:1,50:1， 20 :1，10 :1的CHCl3-Me0H各洗脫兩個柱體積；將10 :1洗脫饋分用甲醇重結(jié)晶即得到C21醬 Asclepiasterol。
[0022] 步驟(1)中所述酒精的體積比濃度為50~100%，用量為藥材質(zhì)量(即馬利筋質(zhì)量） 的5~10倍，提取次數(shù)為2~4次。
[0023] 步驟(2)中所述減壓濃縮的溫度為30~50°C。
[0024] 步驟(3)中所述硅膠的粒度為200~300目。
[0025] 所述的〔21醬43。16口1曰3161'〇1在制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用，所述〔21醬 As C1巧ias t ero 1具有很強(qiáng)的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)的活性。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0027] (1)馬利筋（Ascl邱ias curassavica L.)是一種生活在熱帶美洲地區(qū)，溫暖多濕 環(huán)境灌木，在我國熱帶、亞熱帶地區(qū)已廣泛栽種，易于得到；
[0028] (2)本發(fā)明獲得的C21醬具有良好的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性，且對正常細(xì)胞的毒性 低；
[0029] (3)本發(fā)明獲得的C21醬，含量豐富，制備方法操作簡單方便、成本低。
[0030] (4)Asclepiasterol的細(xì)胞毒性低，但可顯著增加抗腫瘤藥在耐藥細(xì)胞中的蓄積 程度;增強(qiáng)抗腫瘤藥的誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞調(diào)亡作用；與抗腫瘤藥聯(lián)合運(yùn)用，能夠顯著性地抑制耐 藥腫瘤細(xì)胞集落的形成率、能明顯地下調(diào)P-gp在兩株耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平，但不下調(diào)耐 藥基因表達(dá)，提示Asclepiasterol可能是在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平影響了 P-即的表達(dá)，具有獨(dú)特 的作用機(jī)制。因此，本發(fā)明與現(xiàn)有腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑相比，逆轉(zhuǎn)活性高，毒性低，符合抗腫 瘤藥高效低毒的特點(diǎn)。
【附圖說明】
[0031] 圖1為C21醬Asclepiasterol對不同類型細(xì)胞增殖的影響。從圖中可見，C21醬 Asclepiasterol在ΙΟμΜ濃度下對四株模式細(xì)胞的增殖沒有明顯抑制作用，細(xì)胞存活率均在 90 % W上，并且在如Μ濃度下，四株模式細(xì)胞的存活率均在95 %左右。
[0032] 圖2為C21醬Asclepiasterol對Dox處理后的MDR細(xì)胞集落形成的影響。從圖中可 見，3. ΟμΜ阿霉素在一定程度上不能有效抑制MDR細(xì)胞集落形成，然而當(dāng)使用C21醬 Asclepiasterol于耐藥腫瘤細(xì)胞之后，相同劑量的阿霉素能夠顯著性地抑制耐藥腫瘤細(xì)胞 集落的形成率。
[0033] 圖3為C21 醬Asclepiasterol對MDR細(xì)胞P-即 protein和MDRlmRNA表達(dá)的影響。從 圖中可見，C21醬Asclepiasterol在所用逆轉(zhuǎn)濃度下，可W明顯地下調(diào)P-甜在兩株耐藥細(xì)胞 中的表達(dá)水平，并且其下調(diào)幅度均在4-7倍。但是C21醬Asclepiasterol (2.5及扣M)處理耐 藥細(xì)胞4她后，耐藥基因 ABCB1在兩株細(xì)胞中均未發(fā)生明顯變化，提示C21醬Asclepiasterol 可能是在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平影響了 p-甜的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 將馬利筋的全草1kg，用3倍量50%的酒精提取2次，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮得到 總提取物(95g)。將總提取物用水稀釋，得到稀釋液；向稀釋液中加入環(huán)己燒進(jìn)行萃取，收集 萃取后的環(huán)己燒層;再向剩下的水層中加入乙酸乙醋進(jìn)