miR-3613用于區(qū)分肺鱗癌轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移的miRNA標志物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，設及miR-3613在診治肺鱗癌轉(zhuǎn)移中的用途。
【背景技術】
[0002] 非小細胞肺癌是一類嚴重威脅人類生命健康癥情復雜的疾病，幾乎人體的所有部 位、組織、臟器均可發(fā)病。非小細胞肺癌的治療是一種多學科的綜合治療，其中化療為治療 的重要手段之一，但非小細胞肺癌耐藥性和非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移是非小細胞肺癌患者總體生 存率不高的原因。缺乏有效的針對非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的早期診斷和治療手段是目前 防治中的瓶頸。
[0003] miRNA是細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄編輯成的21-2化t的RNA分子，運些RNA分子不翻譯成蛋白 質(zhì)，但miRNA通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默對相應的祀基因表達進行調(diào)節(jié)。據(jù)估計，生物體內(nèi)約有1/3 的基因受HiiRNA的調(diào)控。miRNA與RISC的復合體通過堿基配對可與祀基因 mRNA5/-UTR或者 3/-UTR中的互補序列相結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)翻譯，或是引發(fā)mRNA降解，從而負調(diào)控祀基因的表 達。miRNA作為細胞重要的基因調(diào)控分子，與非小細胞肺癌的關系備受關注。隨著miRNA忍片 技術的發(fā)展，現(xiàn)已明確在非小細胞肺癌細胞中存在多種miRNA的異常表達或缺失，推斷 miRNA很可能是一類新的癌基因或抑癌基因，miRNA己經(jīng)成為研究非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展機 制的一個新領域，某些在非小細胞肺癌中異常表達的miRNA被證實與非小細胞肺癌對某些 藥物耐受和加速非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移有關。
[0004] 檢測miRNA的表達水平可W為癌癥的臨床診斷提供參考。而miRNA的異常表達直接 導致一些與癌癥發(fā)生相關基因的表達異常，誘導癌癥的發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移和耐藥。在未來臨 床診療中，miRNA不僅可W成為新的非小細胞肺癌早期診斷和癌癥進程相關的標記物，而且 也有望通過改變miRNA的表達或者其祀基因的表達治療非小細胞肺癌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種可用于早期診斷肺鱗癌轉(zhuǎn)移的微小RNA標記物。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供上述微小RNA的用途。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：
[000引本發(fā)明提供了一種微小RNA在制備肺鱗癌轉(zhuǎn)移診斷工具中的應用，所述微小RNA選 自W下組:初始miRNA、前體miRNA、成熟miRNA;初始miRNA能在人細胞內(nèi)被剪切并表達成成 熟miRNA;前體miRNA能在人細胞內(nèi)被剪切并表達成成熟miRNA;所述微小RNA是miR-3613。
[0009] 應當知道，本發(fā)明的微小RNA包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，其顯示 完整微小RNA核酸分子相同的功能，盡管它們通過核巧酸殘基的缺失、置換或者插入而突 變。
[0010] 本領域人員應該了解，為了保證微小RNA的穩(wěn)定性，可W在微小RNA的一端或者兩 端增加保護性堿基，如TT，也可對微小RNA堿基進行修飾，但是上述修飾不影響微小RNA的功 能。因此，本領域技術人員熟知，在不影響miR-3613功能的條件下，對miR-3613進行堿基修 飾或者在兩端增加堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體的實施方式中，所述miR-3613是成熟miR-3613。
[0012] 雖然在某些【具體實施方式】中所使用的是成熟miRNA，但是本領域技術人員可W預 期，初始miRNA、前體miRNA將可W獲得與成熟miRNA同樣的技術效果，因為細胞有能力進一 步將初始miRNA、前體miRNA加工為成熟miRNA。
[0013] 本發(fā)明的微小RNA核酸分子可W W單鏈或雙鏈的形式存在。成熟miRNA主要呈單鏈 形式，而前體miRNA是部分自互補的，W形成雙鏈結(jié)構。本發(fā)明的核酸分子可W是RNA、DNA、 PM、LNA的形式。
[0014] 進一步，上述診斷工具包括但不限于，忍片、試劑盒、試紙、高通量測序平臺。所述 診斷工具包括用于檢測miR-3613的表達水平的試劑。
[0015] 進一步，所述試劑盒包括針對miR-3613的引物和/或探針；所述忍片包括固相載 體；W及固定在所述固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括特異性地對應于 miR-3613的部分或全部序列;所述試紙包括針對miR-3613的引物和/或探針;所述高通量測 序平臺包括針對miR-3613的引物和/或探針。
[0016] 本發(fā)明提供了一種肺鱗癌轉(zhuǎn)移的診斷工具，所述診斷工具包括檢測miR-3613表達 水平的試劑。
[0017] 進一步，所述診斷工具包括試劑盒、忍片、試紙、高通量測序平臺。
[0018] 進一步，所述試劑盒包括針對miR-3613的引物和/或探針；所述忍片包括固相載 體；W及固定在所述固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括特異性地對應于 miR-3613的部分或全部序列;所述試紙包括針對miR-3613的引物和/或探針;所述高通量測 序平臺包括針對miR-3613的引物和/或探針。
[0019] 進一步，所述試劑盒中的針對miR-3613的引物和/或探針還可包括針對現(xiàn)有技術 中已經(jīng)報道的可用于檢測前面所述的微小RNA表達水平的引物和/或探針。將多種微小RNA 的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種微小RNA指標聯(lián)合診斷肺鱗癌轉(zhuǎn) 移的情況也包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0020] 進一步，所述忍片上固定的所述寡核巧酸探針還可包括針對現(xiàn)有技術中已經(jīng)報道 的可用于檢測miR-3613的表達水平的寡核巧酸探針。將多種miRNA的檢測探針放置在同一 忍片上通過檢測多種miRNA指標聯(lián)合診斷肺鱗癌也包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0021] 進一步，所述固相載體包括所述固相載體可采用基因忍片領域的各種常用材料， 例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團（如醒基、氨基等)修飾的玻片或娃片、未修飾的玻片、塑 料片等。
[0022] 所述的miRNA忍片的制備可采用本領域已知的生物忍片的常規(guī)制造方法，例如，如 果固相載體采用的是修飾玻片或娃片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核巧酸 探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或娃片上，排列成預定的序列或陣列， 然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA忍片。如果核酸不含氨基修飾，則其制 備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》；J.L.erisi， V.R.Iyer，P.0.BR0WN.Exploring the metabolic and genetic control of gene e邱ression on a genomic scale.Science，1997;278:680和馬立人，蔣中華主編?生物芯 片.北京:化學工業(yè)出版社，2000,1-130。
[0023] 本發(fā)明的miR-3613可W是天然的或是人工合成的，或者使用可W表達miR-3613的 DNA片段的載體轉(zhuǎn)染細胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核載體。
[0024] 病毒載體可W是任何適當?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關病毒載體、瘤疹病毒(例如單純瘤疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。
[0025] 真核表達載體可W是任何適當?shù)谋磉_載體，包括但不限于pCMV-My C表達載體、 PCDNA3.0表達載體、PCDNA3.1表達載體、pEGFP表達載體、pEF Bos表達載體、pTet表達載體、 pTRE表達載體、或者在公知表達載體的基礎上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301 等。
[0026] 可W表達微小RNA的DNA片段可W通過如下方式獲取:從miRNA數(shù)據(jù)庫中化ttp:// mi crorna. sanger. ac.址/sequences/)尋找微小RNA在基因組上的位置及具體序列信息，根 據(jù)基因組序列確定初始HiiRNA的位置，在初始miRNA位置的上下游500-800bp區(qū)間內(nèi)設計特 異性引物，擴增引物中間的序列即可獲得表達微小RNA的DNA片段。
[0027] 藥物篩選:在得知了前面所述的miR-3613與肺鱗癌轉(zhuǎn)移的密切相關性后，可W基 于該特征來篩選促進miR-3613表達的物質(zhì)。之后，可從所述的物質(zhì)中找到對于治療肺鱗癌 轉(zhuǎn)移真正有用的藥物。
[0028] 因此，本發(fā)明還提供了一種篩選治療肺鱗癌轉(zhuǎn)移的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法 包括:用候選物質(zhì)處理肺鱗癌相關細胞體系，若所述候選物質(zhì)可促進前