專利名稱：干細胞增殖因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從人胚細胞腫瘤細胞系中分離的自分泌生長因子。具體說來是涉及干(Stem)細胞增殖因子(SCPF)的生產(chǎn)、線化及應(yīng)用。本發(fā)明的蛋白質(zhì)以兩種形式存在，即可溶性形式及膜結(jié)合形式，后者可在少數(shù)人骨髓細胞表面上檢測到，并可刺激這些細胞的增殖。因此，SCPF可具有廣泛的應(yīng)用，包括(但不只限于)加強造血干細胞的生長。另外，可用抗體除去該蛋白質(zhì)以此來控制腫瘤細胞生長。
已有人述及生長因子對以自分泌方式產(chǎn)生它們的細胞發(fā)揮其刺激作用。這些因子也可對其他靶細胞表現(xiàn)出相似的活性。然而，文獻中尚未描述過從神經(jīng)系統(tǒng)得到的腫瘤細胞可產(chǎn)生調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)細胞生長的因子。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)的胚細胞腫瘤是很罕見的，占兒科實體瘤的不到3%。這些腫瘤大多發(fā)生于松果體腺和下丘腦，但也有報導發(fā)生在丘腦和基底神經(jīng)節(jié)的。從組織學上看，這些腫瘤最常見的是胚細胞腫瘤(germinomas)不太常見的亞型包括絨毛膜癌，胚胎生殖細胞腫瘤及混合的胚細胞腫瘤。這些類型的腫瘤一般予后都很差。
治療這些腫瘤有多種方法，對于胚細胞瘤可用外科和放射療法，對于患有非生殖細胞瘤性胚細胞腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤或再發(fā)性腫瘤疾病的病人使用以增強鉑為基礎(chǔ)的化學療法及自體骨髓移植，具有明顯療效。已報導轉(zhuǎn)移瘤通過腦室旁路傳播并可發(fā)生在沿分流束的任何部位。已有人報導代謝沉積物在頸部和肺部出現(xiàn)，但最多見的是這些沉積物與腦室內(nèi)膜旁路和大腦膜移植物有關(guān)。有關(guān)從顱內(nèi)胚細胞腫瘤培養(yǎng)的細胞系的報導不多，但已從神經(jīng)器官外的胚細胞腫瘤得到幾個細胞系。已從大鼠腫瘤中得到體外連續(xù)細胞系。已證明這些細胞系在原始多潛能細胞分化研究中有很大價值。
在人類醫(yī)藥中，能引發(fā)并調(diào)節(jié)造血機能的藥物是很重要的(McCune et al.，1988，Science 2411632)。各種疾病和免疫功能紊亂，包括惡性腫瘤，似乎都與淋巴-造血系統(tǒng)的破壞有關(guān)。其中許多紊亂通過用始祖細胞再建造血系統(tǒng)得以緩解或治愈，當用這一方法啟動細胞分化時將會克服病人的缺陷。在人體中，目前使用的替代治療即是骨髓移值。除在治療白血病中使用骨髓移植外，該療法目前也常常用于治療其他腫瘤生成(Epstein and Slease，1985，Surg.Ann，17125)。但這種療法可因引入侵害性操作而造成疼痛(對于供體或受體兩者)，并可能使受體發(fā)生嚴重的合并癥，特別是當移植物對受體是異源的并出現(xiàn)移植物抗宿主疾病(GVHD)時。因此，GVHD的危險性限制了骨髓移植法對病人的使用，否則要引起致命疾病。骨髓移植法對病人的使用治療造血功能紊亂的一種可能更為令人鼓舞的替代方法是給病人使用任何一種或合用幾種集落刺激因子(Dexter，1987，J.Cell Soi.881)。
在血細胞生成過程中，少量自身更新干細胞產(chǎn)生特定的始祖細胞譜系，然后在特別激素的控制下分并化增殖由此產(chǎn)生成熟的循環(huán)血細胞。這些激素統(tǒng)稱為集落刺激因子(CSFs)(Metcalf，1985，Science 22916;Dexter，1987，J.Cell Sci.881;Golde and Gasson，1988，Scientific American，July62;Tabbara and Robinson，1991，Anti-Cancer Res.1181;Ogawa，1989，Environ.Health Presp.80199;Dexter;1989，Br.Med.Bull.45337)。隨著重組DNA技術(shù)的進展，目前已克隆并表達了許多這樣的CSF(Souza et al.，1986，Science 23261;Gough et al.，1984，Nature.309763;Yokota et al.，1984，Proc.Natl，Acad，Sci，USA，811070;Kawasaki et al.，1985，Science 230291)。現(xiàn)已可得到這些重組體CSF，并已開始對其治療潛力進行深入的研究。它們在醫(yī)學中的潛在應(yīng)用是廣泛的，包括用于輸血、骨髓移植、糾正免疫抑制性疾病、腫瘤治療、創(chuàng)傷愈合及激活免疫反應(yīng)等領(lǐng)域(Golde and Gasson，1988，Scientific American，July62)。除誘導造血始祖細胞的增殖和分化外，還顯示CSF能激活成熟血細胞的許多功能(Stanley et al.，1976，J.Exp.Med.143631;Schrader et al.，1981，Proc.Natl，Acad.Sci.USA.78323;Moore et al，1980，J.Immunol.1251302;Kurland et al.，1979，Proc，Natl.Acda，Sci.USA，762326;Handman and Burgess，1979;J.Immunol.1221134;Vadas et al.，1983，Blood 611232;Vadas et al.，1983，J.Immunol.130795)，包括影響成熟造血細胞的遷移(Weibart et al.，1986，J.Immunol.1373584)。
本發(fā)明涉及干細胞增殖因子(SCPF)，其在刺激包括造血干細胞在內(nèi)之各種干細胞群體生長中的應(yīng)用，以及鑒定由胚細胞腫瘤產(chǎn)生之其他生長因子或細胞激活素的方法。SCPF是一種以分子量32，000道爾頓之分泌形式或37，000道爾頓之膜結(jié)合形式表達的新的自泌生長因子。SCPF刺激產(chǎn)生該因子之胚細胞腫瘤細胞系及CD34+人骨髓干細胞的增殖和生長。
本發(fā)明部分地基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)胚細胞腫瘤細胞系751向培養(yǎng)基中釋放自泌生長因子。產(chǎn)生抗純化的32KDa蛋白質(zhì)的多克隆兔抗體(SAM.1)可識別32KDa分泌型產(chǎn)物及37KDa細胞結(jié)合蛋白質(zhì)。該抗體亦可識別人骨髓中的細胞群體，而與不到2.6%的正常(粘著耗竭的)骨髓細胞反應(yīng)。該SCPF骨髓細胞群體共表達干細胞標志物CD34。如在下文所述的工作實施例中所顯示的，SCPF不同于任何已知的骨髓集落刺激因子(CSF)，因為對GM-CSF、G-CSF、M-CSF和IL-3特異的抗體均不能抑制SCPF的生物學活性。另外，SCPF也不同于C-Kit致癌基因產(chǎn)物SCF的配基，因為抗SCPF抗體并不能中和SCF功能。
在借助實施例對本發(fā)明所作的描述中，胚細胞腫瘤是從病人體內(nèi)分離的，SCPF被鑒定為由該腫瘤細胞產(chǎn)生的自泌生長因子，并鑒定了該因子的生物化學及生物學性質(zhì)。有關(guān)該新的蛋白質(zhì)的廣泛應(yīng)用也包括于本文所描述的本發(fā)明之范圍內(nèi)。


圖1顯示根據(jù)流動細胞計數(shù)法確定的表型特征。用針對抗原標志物的抗體著染751-胚細胞系，其中所說的抗原標志物是對非神經(jīng)-外胚層細胞(抗PAP，抗HCG)，和神經(jīng)器官胚細胞(抗細胞角蛋白(anti-cytokeratin)、vimentin、NSE、GFAP和NFP)之細胞骨架結(jié)構(gòu)特異性的。使用抗HLAI類作為對照。示于方框中的染色圖形指示該細胞系為能夠分化成神經(jīng)或膠質(zhì)譜系細胞的初級神經(jīng)-外胚層細胞。
圖2顯示跟蹤[35S]蛋氨酸代謝標記的751胚細胞腫瘤上清液的SDS-PAGE凝膠所作的放射自顯影及Ambis掃描圖。上清液是在35S-脈沖-751-GC-原始胚細胞體外生長24小時后收集的。從原發(fā)性皮下腫瘤中分離751-T2-nu/nu小鼠傳代細胞。從肝轉(zhuǎn)換瘤中分離751-Met nu/nu小鼠傳代細胞。Ambis掃描針對32KDa蛋白質(zhì)，并顯示32KDa蛋白質(zhì)在分泌量上不同于只在組織培養(yǎng)中傳代的小鼠腫瘤、轉(zhuǎn)移腫瘤及原始胚細胞系。
圖3顯示使用SAM.1抗體所作的37KDa凝膠純化蛋白(SCPF)的Western印跡分析。(A)對顯示37KDa蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠的考馬斯蘭染色;(B)圖3A中的凝膠的Western印跡。
圖4顯示抗體對腫瘤生長的抑制作用。用SAM.1抗體(抗SCPF)抑制軟瓊脂膠(甲基纖維素)中的腫瘤細胞集落形成。條形圖顯示集落(絕對數(shù))抑制作用為抗體濃度之函數(shù)。NRS是以1∶20稀釋的正常兔血清。下面的圖顯示用亞甲基蘭染色的真實集落。
圖5顯示抗體對腫瘤生長的抑制作用。該圖顯示SAM.1抗體對腫瘤生長的抑制作用為氚標記之胸苷摻入(以測定DNA復制)的函數(shù)。將細胞以10，000個細胞/小井的數(shù)量加入96小井的微量滴定板中，并向各小井內(nèi)再加入不同稀釋度的抗血清。各稀釋度均設(shè)三份。培養(yǎng)48小時后用3H-胸苷(IU/井)標記細胞并繼續(xù)培養(yǎng)12小時，此后收獲細胞并使用閃爍計數(shù)器測定放射性同位素的結(jié)合。數(shù)據(jù)表明，胚細胞751和真正原始骨髓細胞系(BO-BM.1)的增殖作用受到了抗體的抑制，但A251成神經(jīng)細胞瘤細胞系則未受抑制。
圖6顯示對根據(jù)克隆生成活性CD34表達分離的人骨髓胚細胞所作的流動細胞計數(shù)分析結(jié)果。
圖7顯示CD34+細胞在長期體外培養(yǎng)中的復制情況在體外培養(yǎng)之前使用純化的SCPF誘導CD34+細胞。
圖8顯示正常人骨髓細胞在對SCPF反應(yīng)中的增殖作用氚標記的胸苷摻入檢測法。
圖9顯示粘附耗竭的人骨髓細胞(9A)及用SAM.1(抗-SCPF)抗體染色的臍帶血細胞(9B)的流動細胞計數(shù)分析。黑線代表FITC羊抗兔對照，蘭線代表羊抗小鼠FITC對照。I類HLC(綠線)用作陽性對照。
圖10顯示人臍帶血細胞群體的雙染色(SAM.1和CD34)分析結(jié)果。
圖11顯示SAM.1結(jié)合于通過免疫磁性小珠分離的CD34+細胞的單色和雙色流動細胞計數(shù)分析。(1a)羊抗兔FITC對照;(1b)用SMA.1抗體染色的CD34+細胞;(1c)用I類HLA鼠單克隆抗體染色的CD34+細胞;(2a)羊抗小鼠PE對照;(2b)用抗CD34抗體染色的CD34+細胞;(2c)羊抗小鼠FITC對照;(3b)用SAM.1(FITC)和抗CD34單克隆抗體(PE)雙染色的CD34+細胞。
圖12顯示用流動細胞計數(shù)分析法比較單用SAM.1和抗CD34及兩者合用的結(jié)合效率。
圖13顯示使用SCPF刺激的CD34+細胞的長期體外生長情況。
圖14顯示對使用SCPFGate C的長期培養(yǎng)中擴充的CD34+細胞所作的流動細胞計數(shù)分析結(jié)果(3種顏色)。
圖15顯示對使用SCPFGate B的長期培養(yǎng)中擴充的CD34+細胞所作的流動細胞計數(shù)分析結(jié)果。
圖16顯示SCPF的骨髓克隆產(chǎn)生活性。(A)單獨CSF混合物(100U/ml GM-CSF，100U/ml IL-3，1U/ml EPO)的BFU活性;(B)不同濃度之SCPF的BFU活性;(C)與100ng/ml SCPF混合之CSF的BFU活性。數(shù)據(jù)表明，SCPF可單獨誘導BFU活性(B)，并且也可與CSF混合物產(chǎn)生協(xié)同作用(C)。
圖17顯示SCPF的骨髓細胞克隆生成活性。(A)單用CSF混合物(100U/ml GM-CSF，100U/ml IL-3，1U/ml EPO)的CFU-GM活性;(B)不同濃度之SCPF的CFU-GM活性;(C)100ng/ml SCPF混合之CSF的CFU-GM活性。數(shù)據(jù)表明SCPF能夠單獨誘導CFU-GM活性(B)，而且還與CSF混合物產(chǎn)生協(xié)同作用(C)。
圖18顯示SCPF的骨髓細胞克隆生成活性。(A)單用CSF混合物(100U/ml GM-CSF，100U/ml IL-3，1U/ml EPO)的CFU-GEMM活性;(B)不同濃度之SCPF的CFU-GEMM活性;(C)與100ng/ml SCPF混合之CSF的CFU-GEMM活性。數(shù)據(jù)表明單用SCPF不能誘導CFU-GEMM活性(B)，但可與CSF混合物產(chǎn)生協(xié)同作用(C)。
本發(fā)明涉及干細胞增殖因子(SCPF)，用常規(guī)或重組DNA技術(shù)生產(chǎn)SCPF的方法，使用SCPF的方法，以及鑒定并分離從相似衍生的胚細胞腫瘤細胞系中得到的SCPF家族之其他成員的方法。
SCPF是由胚細胞腫瘤細胞系751按膜結(jié)合及分泌形式表達新的自泌生長因子。膜形式的SCPF也可在小部分CD34+人骨髓細胞的細胞表面上表達。另外，SCPF刺激CD34+骨髓干細胞的增殖，表明其可用于需要加速造血細胞生長的條件，即用于供骨髓移植或體內(nèi)治療調(diào)節(jié)造血功能之干細胞的培養(yǎng)物中。用抗體除去751腫瘤細胞培養(yǎng)物中的SCPF可導致腫瘤細胞集落形成減少，此現(xiàn)象提示SCPF參予支持腫瘤細胞增殖，因而這種對SCPF活性的抑制作用可用于治療某些腫瘤。這一點可借助體內(nèi)實驗得以證明，其中聯(lián)合注射抗SCPF抗體和751細胞后可降低該細胞系的腫瘤生成。此外，SCPF的膜結(jié)合形式的SCPF也可作為利用抗SCPF抗體鑒定和分離多潛能骨髓干細胞小群體的細胞表面標志。
SCPF或其片段及其衍生物在調(diào)節(jié)造血功能及治療某些胚細胞腫瘤中可具有廣泛的潛在應(yīng)用。
在本發(fā)明的實踐中，可在培養(yǎng)物中產(chǎn)生其他胚細胞腫瘤細胞系。這些腫瘤細胞可以是細胞激活素的來源，在特殊情況下對造血系統(tǒng)的細胞，而在一般情況下對各種不同組織類型之胚細胞或干細胞都具有生長增強活性。
下文只是為描述之目的而不是以限制方式更詳細地討論本發(fā)明。為清楚起見，主要就特別SCPF及胚細胞腫瘤細胞系來描述本發(fā)明。但其原理也同樣適用于得自其他胚細胞腫瘤細胞系的其他自泌因子。
神經(jīng)-外胚層胚細胞系據(jù)信中樞神經(jīng)系統(tǒng)的胚細胞腫瘤是胚胎發(fā)生中神經(jīng)嵴內(nèi)原始細胞在其遷移到其他組織部位時形成的產(chǎn)物。這樣的腫瘤細胞可產(chǎn)生多種作用于神經(jīng)系統(tǒng)外組織的細胞激活素(Bhandar，1988，Med，Hypoth，27291)。因此，由胚細胞腫瘤產(chǎn)生的細胞系可以是早期作用性生長因子的來源，它影響包括造血系統(tǒng)細胞在內(nèi)之各種類型細胞的增殖。
本發(fā)明用于詳細描述的一個例子，是由得自診斷為沿腦室腔腹支流有多發(fā)性皮下腫塊之病人體內(nèi)外科切除胚細胞腫瘤產(chǎn)生的長期細胞系751。培養(yǎng)的細胞是非粘附性的，并在體外表現(xiàn)有極短的(7-8小時)倍增時間。經(jīng)將培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)移到BNX小鼠體內(nèi)，小鼠在接種102個細胞后7天內(nèi)即產(chǎn)生了可見的皮下腫瘤，而大多數(shù)異種腫瘤在小鼠模型體內(nèi)則需經(jīng)過2-3個月，這一事實也可進一步證實其迅速生長動力學。
使用抗特異性細胞決定基的抗體進行流動細胞計數(shù)分析，表明751細胞系代表了在經(jīng)過適當刺激后可進一步分化為神經(jīng)或膠質(zhì)細胞譜系的原始腦神經(jīng)-外胚層細胞系。因此可見，其為具有生長和分化性質(zhì)的原始多潛能細胞系。751細胞并不表達包括CD34在內(nèi)的任何一種已知的白細胞表面標志物。此外，已使用對一組致癌基因序列特異的分子探針檢測了致癌基因c-myc和c-fms的mRNA。因為已顯示c-fms是巨噬細胞集落刺激因子的受體，所以751細胞可能以某種方式與骨髓的始祖細胞相關(guān)。
干細胞增殖因子由實施例中所述之751細胞系產(chǎn)生的干細胞增殖因子以兩種形式存在，即分子量約32KDa的分泌形式，和分子量為37KDa的膜結(jié)合形式。經(jīng)鑒定多個SCPF異型的P.I.在大約7.0至8.0范圍內(nèi)。
使用32KDa SCPF在兔體內(nèi)產(chǎn)生多克隆抗血清。使用定名為SAM.1的特異性抗體以便于對751細胞產(chǎn)生的主要分泌蛋白質(zhì)進行生物化學特性鑒定。因為該抗體可在Western免疫印跡實驗中與751全細胞溶胞產(chǎn)物中的37KDa蛋白質(zhì)反應(yīng)，故首先顯示它是對SCPF蛋白質(zhì)特異性的。這一發(fā)現(xiàn)證明，該有用蛋白質(zhì)可以32KDa分子量的分泌形式和37KDa分子量的膜形式存在，后者可包括固定于細胞上的跨膜成分。因此，上述蛋白質(zhì)可作為可溶性分子和相互作用的細胞間的細胞表面蛋白質(zhì)發(fā)揮其功能。
為了闡明該蛋白質(zhì)(下文稱為干細胞增殖因子，SCPF)的生物學活性，在不同濃度兔抗血清存在下，用集落抑制試驗估測751細胞的集落形成能力。結(jié)果清楚地證明抗體可抑制腫瘤細胞集落形成，進而表明該分泌蛋白質(zhì)是一種能促進751細胞生長的自泌生長因子。再者，抗體的增殖抑制效應(yīng)是對其中成神經(jīng)細胞瘤細胞系的生長不受抑制的胚細胞或干細胞系特異的。
純化SCPF并試驗其刺激人骨髓細胞增殖的能力。在克隆形成實驗中顯示SCPF誘導了母細胞的生長，進而通過流動細胞計數(shù)法顯示其可表達CD34標志物及I類HLA抗原。當同樣的細胞在不存在SCPF下，作為長期Gordon培養(yǎng)物生長并在重組體GM-CSF存在下試驗再鋪敷效力時，該細胞即產(chǎn)生粒細胞、單核細胞及混合表型的集落。因此，SCPF能夠誘導CD34+骨髓細胞群體的復制，并在對繼后集落刺激因子之刺激的反應(yīng)中保持分化能力。
當抗SCPF抗體與人骨髓細胞反應(yīng)時，細胞的小部分(但可測出的)顯示為陽性染色。這些細胞也可表達CD34蛋白質(zhì)，已報導該蛋白質(zhì)是由造血干細胞表達的標志物。然而，產(chǎn)生SCPF的751胚細胞腫瘤對于CD34表達顯示陰性，并且抗SCPF和抗CD34抗體在與純化的CD34+細胞結(jié)合中彼此并不發(fā)生競爭性抑制，這些發(fā)現(xiàn)證明SAM.1抗體不針對CD34標志物而是針對膜結(jié)合形式的SCPF的。SAM.1抗體不與各種非人動物的任何蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，因此該抗體不與得自小鼠、牛及羊骨髓的細胞反應(yīng)。
為了進一步確定SCPF的生物學特性，在純化的異種SCPF存在下制成CD34+細胞的長期培養(yǎng)物。與對重組體IL-3或IL-6反應(yīng)中迅速擴充的培養(yǎng)物不同，接受SCPF的培養(yǎng)物經(jīng)受了一個細胞死亡的起始期，而產(chǎn)生其后能在對SCPF反應(yīng)中增殖的殘留的CD34+細胞群體。與生長于IL-3或IL-6中的培養(yǎng)物完全不同，用SCPF處理的細胞形態(tài)學上似乎更為均勻。然而，用SCPF處理的培養(yǎng)物根據(jù)細胞表面標志物的表達產(chǎn)生兩種細胞群體。雖然兩個群體均表達CD34，但一個并不表達CD38和HLA-DR，而另一個只以低水平表達這兩種標志物。因此，總的說來SCPF是一種誘導CD34+骨髓細胞增殖而不引起分化的自泌生長因子，同時這些細胞保留了它們對其他分化信號反應(yīng)的能力。因為除去SCPF可導致CD34+細胞存活性的迅速降低，所以可知該因子并不誘導培養(yǎng)細胞的惡性轉(zhuǎn)化。
另外，當與其他集落刺激因子結(jié)合使用時，SCPF能夠增強對骨髓細胞的刺激作用。然而，SCPF不同于任何已知的造血生長因子，因為對人GM-CSF、G-CSF、M-CSF和IL-3特異的抗體不能中和SCPF的生物學活性。此外，抗SCPF抗體并不抑制最近鑒定的干細胞因子(SCF)的功能，后者已被證明為由C-Kit致癌基因編碼之受體的配基(Yokota et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.811070，williams et al.，1990，Cell 63167;Zeebo et al.，1990，Cell 63195。
SCPF編碼序列的分離可從產(chǎn)生SCPF的細胞來源得到用于制備cDNA的信使RNA(mRNA)，而SCPF的基因組序列則可從任何細胞來源得到。例如，可利用751-NA、751-LIV或751-LN細胞作為編碼SCPF之序列的來源和/或制備cDNA或基因組文庫。可使用含SCPF編碼序列的基因工程化微生物或細胞系作為用于該目的之DNA的方便來源。
可從使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生的DNA片段制備cDNA或基因組文庫?？墒褂猛从诨诘米约兓鞍踪|(zhì)氨基酸序列信息的部分SCPF序列的核苷酸探針篩選上述文庫來鑒定編碼SCPF的片段。另外，可使用抗體探針篩選用表達克隆方法產(chǎn)生的文庫如λgtll(Young and Davis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.801194-1198)。雖然可以利用部分編碼序列進行克隆和表達，但最好還是利用全長克隆，即那些含有整個SCPF編碼區(qū)的序列。最后，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分離DNA，產(chǎn)生適當?shù)南拗菩云?，?gòu)建克隆和文庫，以及篩選重組體的技術(shù)，如參見Maniatis et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y中描述的技術(shù)。
不管選用什么方法來鑒定和克隆SCPF編碼序列，都可利用表達克隆方法來大大減少篩選的工作量。最近，有報導克隆和表達抗體基因的一步驟方法(McCafferty et al.，1990，Nature 348552-554;Winter and Milstein，1991，Nature 349293-299)。基于這一技術(shù)，可將SCPF基因在相鄰于入或fd等噬菌體的衣殼蛋白基因的位點處克隆到載體中。攜帶SCPF基因的噬菌體在其表面上表達融合蛋白質(zhì)，從而可使用含有SCPF特異性抗體的柱選擇并分離具有結(jié)合活性的噬菌體顆粒。也可使用市售的其中利用λ-Zap-bluescript的表達克隆系統(tǒng)(Stratagene，La Jolla，CA)進行SCPF cDNA文庫的克隆，和抗體篩選?？衫盟矔r基因表達系統(tǒng)鑒定正確的SCPF基因。例如，可使用cos細胞系統(tǒng)(如參Gerard & Gluzman，1986，Mol.Cell Biol.6(12)4570-4577)。
由于核苷酸編碼序列的簡便性，在本發(fā)明克隆和表達SCPF的實踐中，可使用任何已知SCPF基因的編碼類似氨基酸序列的其他DNA序列。這類改變包括不同核苷酸殘基的缺失、加入或取代而產(chǎn)生編碼相同或功能上等同基因產(chǎn)物之序列?；虍a(chǎn)物可在序列內(nèi)包含氨基酸殘基的缺失、加入或取代，導致沉默改變而得以產(chǎn)生生物活性產(chǎn)物。可基于有關(guān)殘基在極性，電荷，溶解度、疏水性、親水性和/或兩歧性等性質(zhì)的相似性而作出這些氨基酸的取代作用。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸的精氨酸;具有相似親水性值之不帶電荷極性頭部基因的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸?？山柚酆厦告湻磻?yīng)，使用寡核苷酸序列增加特有基因序列的拷貝數(shù)。這一方法比使用簡并寡核苷酸得到的探針更具特異性。
此外，在本發(fā)明的實踐中也可使用包括結(jié)構(gòu)修飾但基本上未改變所編碼SCPF蛋白質(zhì)生物學性質(zhì)的其他DNA序列。這些修飾包括(但不只限于)SCPF中氨基酸殘基的加入、缺失或取代，以造成附加的加工位點和/或除去糖基化位點。例如，在某些蛋白質(zhì)中除去N-連接的糖基化位點可減少某些特別適用于酵母表達系統(tǒng)的被表達產(chǎn)物上的糖基化作用。
為了表達生物學活性SCPF，可將編碼SCPF的核苷酸序列或其功能等同核苷酸序列插入適當?shù)谋磉_載體即含為轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯已插入編碼序列所需之結(jié)構(gòu)元件的載體中?？蓪?jīng)修飾的SCPF編碼序列的變體進行基因工程處理，以提高被表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)生量、純度或得率。例如，可對融合蛋白或含有SCPF及異源蛋白質(zhì)之可裂解融合蛋白的表達進行工程化處理。可用親和層析法，很容易地分離出這樣的融合蛋白質(zhì)，如將其固定在對異源蛋白特異的層析柱上。若在SCPF部分和異源蛋白間造成一個裂解位點，即可用適當?shù)拿富蚩善茐牧呀馕稽c的試劑處理后從層析柱上釋放出SCPF蛋白質(zhì)(參見Booth et al.，1988，Immunol.Lett.1965-70;Gardella et al.，1990，J.Biol.Chem.26515854-15859)。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法構(gòu)建含有SCPF編碼序列和適當轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)，及體內(nèi)重組/基因技術(shù)(如參見Maniatis et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory NY中描述的技術(shù))。
可利用各種宿主-表達載體系統(tǒng)表達SCPF編碼序列。這些系統(tǒng)包括(但不只限于)微生物，如用含有SCPF編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒型質(zhì)粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌;用含有SCPF編碼序列的重組體酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母;用含SCPF編碼序列的重組體病毒表達載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染或用重組體質(zhì)粒表達載體(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng);用含有SCPF編碼序列的重組體病毒表達載體(如桿狀病毒)轉(zhuǎn)染的昆蟲細胞系統(tǒng)或用含有SCPF編碼序列的重組體病毒表達載體(如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒)轉(zhuǎn)染的動物細胞系統(tǒng)，或為穩(wěn)定表達目的而進行工程化處理的轉(zhuǎn)化的動物細胞系統(tǒng)。因為尚未完全證實SCPF含有碳水化合物，故可既使用細菌表達系統(tǒng)又使用提供轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)譯后修飾的表達系統(tǒng)，如哺乳動物、昆蟲、酵母或植物表達系統(tǒng)。
依據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，可在表達載體中使用很多適當?shù)霓D(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯元件之任何一種，包括結(jié)構(gòu)和可誘導性啟動子、轉(zhuǎn)錄增強子元件及轉(zhuǎn)錄終止子等(參見Bitter et al.，1987，Methods in Enzymology 153516-544)。例如，當在細菌系統(tǒng)中克隆時，可使用λ噬菌體的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合啟動子)等可誘導性啟動子。當在哺乳動物細胞系統(tǒng)中克隆時，可使用得自哺乳動物基因組的啟動子(如金屬硫因啟動子)或得自哺乳動物病毒的啟動子(如反轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復序列;腺病毒晚期啟動子;牛痘病毒7.5K啟動子)。以重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生的啟動子也可使用來提供被插入之SCPF編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
在細菌系統(tǒng)中，根據(jù)被表達之SCPF的需要許多表達載體可供選擇。例如，當需生產(chǎn)大量SCPF時，可使用能指導高水平表達易于純化的融合蛋白產(chǎn)物的載體。最好是那些經(jīng)基因工程處理而含有裂解位點以有助于回收SCPF的載體。這樣的載體包括(但不只限于)大腸桿菌表達載體PUR278(Ruther et al.，1983，EMBO J.21791)(其中SCPF編碼序列可被連接到其讀碼內(nèi)帶有l(wèi)ac Z編碼區(qū)的載體中，從而得以產(chǎn)生雜合SCPF-lac Z蛋白質(zhì))及PIN載體(Inouye & Inouye，1985，Nucleic Acids Res.133101-3109;Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.2645503-5509)等。
在酵母中，可選用許多含有色含結(jié)構(gòu)或可誘導性啟動子的載體。有關(guān)綜述可參見Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，1988，Ed.Ausubel et al.，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，Ch.13;Grant et al.，1987，Expression and Secretion Vectors，for Yeast，Methods in Enzynology，Eds.Wu & Grolssman，31987，Acad，press，N.Y.，Vol.153，pp.516-544;Glover，1986，DNA Cloning，Vol.Ⅱ，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3;Bitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast，Method in Enzymology，Eds.Berger & Kimmel，Acad.press，N.Y.，Vol.152，pp.673-684;The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982，Eds.Strathern et al.，Cold Spring Harbor Press，Vols.Ⅰand Ⅱ。可使用結(jié)構(gòu)酵母啟動子，如ADH或LEU2，或GAL等可誘導性啟動子(Cloning in Yeast，Ch.3，R.Rothstein In，DNA Cloning，Vol.11，A Practical Approach，Ed.DM Glover，1986，IRL Press，Wash.，D.C.)。此外能啟動外源DNA序列整合入酵母染色體的載體也可用。
在使用植物表達載體的情況下，可用任何一種啟動子驅(qū)動SCPF編碼序列的表達。例如，可使用CaMV的35S RNA和19S RNA啟動子這類病毒啟動子(Brisson et al.，1984，Nature 310511-514)，或TMV的衣殼蛋白質(zhì)啟動子(Takamatsu et al.，1987，EMBO J.6307-311);另外，也可使用RUBISCO的小亞單位這類植物啟動子(Coruzzi et al.，1984，EMBO J.31671-1680;Broglie et al，1984，Science 224838-843)，或大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B這類熱休克啟動子(Gurley et al.，1986，Mol.Cell.Biol.6559-565)?？墒褂肨i質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒、植物病毒載體及直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等方法將這些構(gòu)建體導入植物細胞中。有關(guān)這些技術(shù)的綜述可參見Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section Ⅷ，.421-463;Grierson & Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。
一個用于表達SCPF的可代用的表達系統(tǒng)為昆蟲體系，在這樣的系統(tǒng)中，使用Autographa Californica核多角體病毒(AcNPV)作為載體來表達外來基因。病毒生長于Spodoptera frugiperda細胞中?？蓪CPF編碼序列克隆到病毒的非必需區(qū)域中(例如多角體基因)，并使之處于AcNPV啟動子的控制之下(例如多角體啟動子)。成功地插入SCPF編碼序列將導致多角體基因失活并產(chǎn)生非閉合的重組體病毒(即缺少由多角體基因編碼之蛋白質(zhì)衣殼的病毒)。然后用這些重組體病毒感染在其中插入基因的被表達的Spodoptera frugiperda細胞(如參見Smith et al.，1983，J.Virol.46584;Smith，US Patent No.4，215，051)。
真核系統(tǒng)且更好是哺乳動物表達系統(tǒng)允許被表達哺乳動物蛋白質(zhì)得以適當?shù)霓D(zhuǎn)譯后修飾?？墒褂镁哂羞m當加工初級轉(zhuǎn)錄本、糖基化、磷酸化及利于分泌基因產(chǎn)物之細胞機制的真核細胞作為表達SCPF的宿主細胞。其中優(yōu)選哺乳動物細胞系。這樣的宿主細胞系可包括(但不只限于)CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、-293及WI38。
可對利用重組體病毒或病毒元件指導表達的哺乳動物細胞進行基因工程化處理。例如，當使用腺病毒表達載體時，可將SCPF編碼序列連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯控制復合體中，如晚期啟動子和三聯(lián)前導序列中，然后可通過體外或體內(nèi)重組將嵌合基因插入腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)域插入(如E1或E3區(qū)域)將產(chǎn)生存活的并能夠在被感染宿主內(nèi)表達SCPF蛋白質(zhì)的重組病毒(參見Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA813655-3659)。另外，也可使用牛痘病毒7.5K啟動子(參見Mackett et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA797415-7419;Mackett et al.，1984，J.Virol.49857-864;Panicali et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA794927-4931)。其中特別感興趣的是基于牛乳頭狀瘤病毒的載體(其具有作為染色體外元件復制的能力)(Sarver.et al.，1981，Mol.Cell.Biol.1486)。在該DNA進入小鼠細胞后不久，每個細胞內(nèi)的質(zhì)粒即可復制出大約100至200個拷貝。被插入之cDNA的轉(zhuǎn)錄不需要將質(zhì)粒整合到宿主染色體內(nèi)，從而可產(chǎn)生高水平的表達?？稍谫|(zhì)粒內(nèi)接入可選擇性標志如neo基因，以使這些載體能用來穩(wěn)定表達。另外，可對反轉(zhuǎn)錄病毒基因組進行修飾，以將其用作能將SCPF基因?qū)胨拗骷毎麅?nèi)并用于指導表達的載體(Cone & Mulligan，1984，Proc.Natl.Acad.Aci.USA816349-6353)。也可使用可誘導性啟動子實現(xiàn)高水平表達，這些啟動子包括(但不只限于)金屬硫因IIA啟動子和熱休克啟動子。
為長期以高產(chǎn)率生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，最好使用穩(wěn)定的表達系統(tǒng)。
與其使用含有病毒復制原點的表達載體，不如適當表達控制元件(如啟動子、增強子、序列，轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷化位點等)及可選擇標志控制的SCPF cDNA轉(zhuǎn)化宿主細胞。重組質(zhì)粒中的可選擇標志賦予選擇抗性，并使細胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到它們的染色體中，同時生長成能被依次克隆并擴充成細胞系的焦點。例如，可在引入外來DNA后，使工程化細胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基中。可使用多種選擇系統(tǒng)，它們包括(但不只限于)可分別在tk，hgprt或aprt細胞中使用的單純瘡疹病毒胸苷激素(Wigler，et al.，1977，Cell 11223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)及腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy，et al.，1980，Cell 22817)基因。另外，可使用抗代謝物抗性作為dhfr選擇的基礎(chǔ)，它賦予對氨甲蝶呤抗性(Wigler，et al.，1980，Natl.Acad.Sci.USA773567;O′Hare，et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527)、作為對gpt的選擇基礎(chǔ)，它賦予抗霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)、作為對neo的選擇基礎(chǔ)，它賦予抗氨葡糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin et al.，1981，J.Mol.Biol.1501)以及作為對hygro的選擇基礎(chǔ)，它賦予抗潮霉素抗性(Santerre，et al.，1984，Gene 30147)基因。近年，已有人描述過其他可選擇性基因，即可使細胞利用吲哚以取代色氨酸的trpB，使細胞利用組氨醇代替組氨酸的HisD(Hartman & Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA858047)以及賦予抗鳥氨酸脫羧酶抑制物，2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸(DFMO)抗性的ODC基因(McConlogue L.，1987，In;Current Communication in Melecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory ed.)。
SCPF的生產(chǎn)本發(fā)明涉及膜結(jié)合和分泌形式的SCPF。SCPF是由人胚細胞瘤細胞素751天然分泌的。可從連續(xù)細胞系的條件培養(yǎng)基中分離SCPF，并可使用各種蛋白質(zhì)純化方法純化成均一產(chǎn)物。另外，可使用重組DNA技術(shù)或化學合成方法產(chǎn)生SCPF。
SCPF的純化可從分泌SCPF的細胞培養(yǎng)物上清液純化SCPF，即從胚細胞瘤細胞系或基因工程化重組宿主細胞表達系統(tǒng)中純化SCPF。在一特定實施方案中(參見下文實施例)，收集751細胞系的條件培養(yǎng)基并用SDS制備性凝膠電泳法純化SCPF。也可使用抗SCPF抗體以免疫親和法純化SCPF。此外，還可使用等電聚焦法純化SCPF。
從細胞的粗培養(yǎng)基中純化SCPF的方法也可適用于純化已克隆并表達的產(chǎn)物。此外，當以基因工程改造了SCPF編碼序列以使之編碼可裂解的融合蛋白質(zhì)時，可使用親和純化技術(shù)很容易地純化SCPF。例如，可在SCPF的羧基末端和麥芽糖結(jié)合蛋白之間以基因工程技術(shù)造成一個蛋白酶因子Xa裂解識別序列。可使用與直鏈淀粉(其上面結(jié)合了麥芽糖結(jié)合蛋白)結(jié)合的柱很容易地純化所得到的融合蛋白質(zhì)。然后用含麥芽糖的緩沖液從柱上洗脫SCPF融合蛋白質(zhì)，再用因子Xa處理之。使裂解的SCPF通過第二個直鏈淀粉柱以除去麥芽糖結(jié)合蛋白(New England Biclals，Beverly，MA)而得以進一步純化。使用本發(fā)明的這一技術(shù)，可在SCPF序列和第二個肽或具有可用于純化的結(jié)合伙伴的蛋白質(zhì)(如任何可制備免疫親和柱的抗原)之間對任何裂解位點或酶裂解底物進行基因工程處理。
分離本發(fā)明SCPF的方法包括適用于分離蛋白質(zhì)物質(zhì)的普通方法，如包括用常見的蛋白質(zhì)沉淀劑處理含SCPF的樣品，然后是離子交換層析、親和層析及超濾等分級分離技術(shù)(可合用幾種方法)。如可按照美國專利4，885，236和4，882，268號中所述的方法從細胞懸液中純化SCPF。純化本發(fā)明多肽的其他方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如參見Current Protocols in Immunology，Coligan，et al.，eds.1992，列為本文作為參考文獻)。
可在適當條件下對含多級分的SCPF進行SDS-PAGE分離，并回收含SCPF活性或相當于SCPF分子量的凝膠片。按照Laemmli等人所述方法(Nature，227680，1970)進行SDS-PAGE。應(yīng)明確的是在適當范圍內(nèi)的條件改變也包括在該純化方法內(nèi)。
分離得自SDS-PAGE的含SCPF部分，并按O′Farrell(J.Biol.Chem.2504007，1975)的方法進一步作兩徑向凝膠電泳。第一徑向是按常規(guī)方法使用寬范圍的兩性電解質(zhì)進行等電聚焦電泳，以在凝膠上分辨出pI值在大約3.8至8.0的蛋白質(zhì)。依據(jù)所需蛋白質(zhì)的不同pI值以不同量加入PH2-11的兩性電解質(zhì)溶液。如果期望在窄PH范圍內(nèi)廣泛提高分辨率，可按2∶1的比例將窄范圍的兩性電解質(zhì)加到寬范圍兩性電解質(zhì)中。優(yōu)選使用分離pI約為5至9特別是約為7至8之蛋白質(zhì)的兩性電解質(zhì)來分辨SCPF和其相應(yīng)的異型。第二徑向凝膠一般是以10-20%丙烯酰胺凝膠使用，但亦可使用任何一種常規(guī)的板凝膠。
可用標準方法如考馬斯蘭和銀染色法檢測由兩徑向凝膠電泳分辨的蛋白質(zhì)。另外，可將凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到印跡轉(zhuǎn)移膜上，并用India墨水或膠質(zhì)金著染，或用Westem吸印法檢測之。優(yōu)選使用本發(fā)明的抗體以Western吸印法檢測本發(fā)明的SCPF。
也可對含多級分的SCPF進行反相HPLC，并用例如乙腈洗脫之。所得到的基本上純的SCPF可用來進行N末端氨基酸序列測定。在真空下干燥溶液并重新溶解在小體積乙腈(95%)+TFA(0.08%)中。然后將濃縮的樣品引入接有苯硫乙內(nèi)酰脲(PTH)分析儀的序列測定儀中。
可用生物檢測法檢驗凝膠純化之細胞激活素，如本發(fā)明SCPF可用生物檢測法檢測其刺激(和/或抑制)指示物細胞系增殖的生物學活性。例如，可用ML-1或KG-1a細胞檢驗SCPF活性。
化學合成方法也可基于其氨基酸序列，以固相化學合成技術(shù)全部或部分地產(chǎn)生SCPF分子(見Creighton，1983，Proteins Structures and Molecular Principles，W.H.Freeman and Co.NY，pp.50-60;Stewart and Young，1984，Peptide Synthesis，2nd.ed.，Pierce Chemical Co.)。這一方法也特別適用于產(chǎn)生與其一個或多個生物學活性區(qū)域相對應(yīng)的SCPF片段。
抗SCPF抗體的生產(chǎn)生產(chǎn)可識別SCPF或相關(guān)蛋白質(zhì)之多克隆及單克隆抗體也包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可用本領(lǐng)域已知的各種方法生產(chǎn)抗SCPF抗原決定基的多克隆抗體。為生產(chǎn)抗體，可注射SCPF蛋白或SCPF肽免疫包括(但不只限于)兔、侖鼠、小鼠、大鼠等多種宿主動物。可根據(jù)不同種的宿主動物，使用各種佐劑如包括(但不只限于)弗氏(完全或不完全佐劑)佐劑、氫氧化鉛等礦物質(zhì)凝膠、溶血卵磷脂等表示活性物質(zhì)、普盧蘭尼聚醇、多聚陰離子、肽、油乳劑、戚孔鑰血蘭蛋白、二硝基苯酚，以及BCG(bacille Calmette-Guerin)和Corynebacterium barvum這類適用于人的佐劑來提高免疫學反應(yīng)。
在本發(fā)明的一個特定實施方案中，用純化的SCPF免疫以產(chǎn)生SCPF特異性抗體。證明其中一個這樣的抗血清(SAM.1)含有可與SCPF產(chǎn)生特異性反應(yīng)，從而抑制其以自分泌方式刺激751細胞生長之活性的抗體(參見下文)。
可使用由培養(yǎng)的連續(xù)細胞系生產(chǎn)抗體分子的任何一種技術(shù)制備抗SCPF抗原決定基的單克隆抗體。所說的技術(shù)包括(但不只限于)最初由Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495-497)描述的雜交瘤技術(shù)，以及更新的人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor et al.，1983，Immunology Today 472;Cote et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.802026-2030)以及EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Theragy，Alan R.Liss，Inc.pp77-96)?？墒褂猛ㄟ^切接有適當抗原特異性之小鼠抗體分子的基因同來自人抗體分子的基因而發(fā)展的生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)(參見Morrison et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-6855;Neuberger et al.，1984，Nature，312604-608;Takeda et al.，1985，Nature 314452-454)。另外，用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(US Patent 4，946，778)也可適用于產(chǎn)生單鏈抗體。
可用已知技術(shù)產(chǎn)生含有分子之結(jié)合位點的抗體片段。例如，這些片段包括(但不只限于)可用胃蛋白酶消化抗體分子所產(chǎn)生的F(ab′)2片段，以及經(jīng)還原F(ab′)2片段的二硫橋鍵所產(chǎn)生的Fab片段。
發(fā)現(xiàn)抗SCPF抗體可用于定量和定性測定成熟、前體及亞成分形式的膜結(jié)合或分泌的SCPF，并可用于親和純化SCPF蛋白質(zhì)、闡明SCPF生物合成、代謝及功能，以及篩選編碼免疫原抗原決定基之基因序列的SCPF表達文庫。也可將抗SCPF抗體用作胚細胞或其他腫瘤的治療劑。
SCPF的應(yīng)用SCPF的功能活性和靶細胞特異性可提供廣泛體外或體內(nèi)應(yīng)用?？稍诒景l(fā)明的實踐和方法中單獨使用或與其他生物學活性生長因子、抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合使用表現(xiàn)有生長刺激活性的，包括SCPF或其片段或衍生物的任何化合物。SCPF、SCPF相關(guān)分子及其組合物可特別用于提高包括(但不只限于)造血干細胞在內(nèi)之胚細胞/干細胞的增殖能力。
目前在造血干細胞中穩(wěn)定地整合外源基因的主要障礙是已知的細胞激活素不能在沒有分化的情況下刺激這些細胞增殖。已顯示SCPF能夠誘導純化的CD34′細胞進入細胞周期并在長期培養(yǎng)中增殖(見下文)?？墒褂肧CPF對干細胞進行基因操作，以便用于包括(但不限于)對鐮狀細胞性貧血等血液病進行基因治療。
由于發(fā)現(xiàn)SCPF是一種由神經(jīng)-外胚層來源的細胞素產(chǎn)生的自分泌生長因子，并且它也可作用于造血譜系的細胞，故提示SCPF可能是一種對不同組織來源的原始胚/干細胞特異的細胞激活素。已表明干細胞群體存在于包括腦、肝及皮膚在內(nèi)的多種器官和組織中，此外，還顯示頭發(fā)脫失與頭發(fā)濾泡細胞周圍缺乏干細胞增殖有關(guān)。因此，SCPF可用作治療那些需要干細胞群體生長的病理癥狀而不管它們的組織來源如何，這樣的病理癥狀包括(但不只限于)頭發(fā)脫失。
此外，可在受體結(jié)合試驗中使用標記的SCPF或SCPF相關(guān)分子，或使用抗SCPF受體本身的抗體檢測表達SCPF受體的細胞?？筛鶕?jù)SCPF受體的存在和密度區(qū)分細胞，進而提供了一種預測這些細胞對SCPF生物學活性之反應(yīng)性的方法。
鑒定來自胚細胞之細胞激活素的方法本發(fā)明闡明了鑒定和分離對各種胚/干細胞具有生物學活性之生長因子或細胞激活素的新方法?？蓮耐饪撇牧系玫饺魏我环N胚細胞腫瘤并制備為實踐本發(fā)明所需的體外培養(yǎng)物?？苫诒磉_某些標志物或?qū)δ承┥L因子的反應(yīng)性來選擇細胞系，并可維持粘附和非粘附細胞群體?？墒褂每垢鞣N細胞表面和內(nèi)部細胞骨架成分(包括白細胞抗原和中間絲)的抗體，以流動細胞計數(shù)法確定已建立之細胞系的組織譜系特征。另外，可使用分子探針檢驗c-myc、c-fms、c-ras、c-myb、c-fos、c-sro、c-orb、c-neu、c-ros、c-sis等致癌基因的表達。
為了鑒定由已建立的細胞系產(chǎn)生的新的細胞激活素，可從代謝上標記細胞并用SDS-PAGE法分析所分泌的蛋白質(zhì)。另外，可將培養(yǎng)物上清液加到已知在生物試驗中對特定細胞激活素發(fā)生反應(yīng)的、用作指示物的各種類型細胞內(nèi)，以直接分析之。在用SDS-PAGE方法和/或根據(jù)生物學活性鑒定了主要蛋白質(zhì)后，可用SDS制備性凝膠、離子交換層析及等電聚焦凝膠(參見下文所述)等純化該蛋白質(zhì)。可用SDS-PAGE進一步證實蛋白質(zhì)的純度，用蛋白質(zhì)檢定法定量，并用生物檢測法進一步證實其活性，并將其用作生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體的免疫原。
可以生物檢測進一步試驗經(jīng)提純的蛋白質(zhì)在刺激和/或抑制各不同組織類型之各種指示物細胞系增殖的能力。也可使用親和標記等方法，用放射標記的蛋白質(zhì)鑒定其細胞表面受體?？墒褂锰禺愋钥辜毎せ钏乜贵w鑒定并定量膜形式和分泌形式的細胞激活素，以研究它們的生物合成途徑，親和純化蛋白質(zhì)以及免疫篩選用于對編碼序列進行分子克隆(例如使用上文所述的方法和技術(shù))的表達文庫。
實施例1產(chǎn)生SCPF之751胚細胞瘤細胞系的傳代下述實驗表明751腫瘤細胞系代表了一個在生長和細胞表面標志表達上表現(xiàn)有非尋常特征的極原始神經(jīng)-外胚層細胞系。該細胞系的生長是目前為止未敘述的一種或多種生長因子調(diào)節(jié)的。
材料和方法細胞培養(yǎng)物將751細胞系維持于添加了10%胎牛血清、∠-谷氨酰胺和抗生素(青霉素/鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)基中。使用錐蟲蘭排除法估測存活率及細胞濃度。將細胞濃度調(diào)到1×103個細胞/ml并接種于75cm組織培養(yǎng)瓶中，然后于含5%CO2的空氣環(huán)境下37℃保溫。
動物由Harlan Sprague Dawley Inc.，In得到三重免疫缺陷的by/mu/xid雌性小鼠(BNX小鼠)，被圈于無菌動物群體中。給小鼠喂以無菌Rodent Blox和酸化水a(chǎn)d libtium，并在長至7-9周齡時用于實驗。
體外細胞生長動力學按下述方法研究751細胞系的體外生長動力學。建立起始生長曲線研究確定最佳初始細胞濃度。由此得知起始生長曲線在每小井5×103、5×104和1×105個細胞。于7天內(nèi)每隔12小時進行細胞計數(shù)。所有細胞計數(shù)/樣品均抽一式三份。這些初步研究結(jié)果顯示，用于所有繼后生長曲線的最適細胞數(shù)為5×104個。然后將細胞鋪敷在12小井平板中，達到終濃度(2ml體積)為5×104細胞/小井。所有計數(shù)均以12小時間隔進行7天，并記錄百分存活率。所有細胞計數(shù)/樣品均重復三份。
體內(nèi)細胞生長動力學試驗該細胞系移植到BNX小鼠體內(nèi)的能力。為了檢測腫瘤生長速率，將按Log10體行系列稀釋的751-NA細胞系接種(0.1ml)BNA小鼠后肢皮下。每個稀釋度接種8只小鼠。每周兩次檢查被接種小鼠的腫瘤狀態(tài)。一旦腫瘤顯現(xiàn)后，即使用測徑器每兩天檢測腫瘤大小。通過測量兩個垂直的直徑確定腫瘤大小并將兩個值相乘以估計腫瘤面積。
流動細胞計數(shù)分析用對白細胞表示標記CD2、CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、CD10、CD14、CD19、CD20、CD33、CD34、Ⅰ類和Ⅱ類HLA特異的單克隆抗體篩選751細胞。這些抗體可從Becton Dickinson，CA得到。按下述方法(Griebel et al.，1988)進行流動細胞計數(shù)分析。離心(1，000rpm，10分鐘)751腫瘤細胞并以2×107的濃度重新懸浮于含有0.2%明膠、1mM迭氮鈉和2%正常兔血清的0.1M PBS中。將50μl細胞懸浮液加入含50μl適當單克隆抗體的96小井平底微量滴定板中，并于4℃下保溫30分鐘。然后用冰冷的PBS-明膠將細胞洗3次，并加入用PBS-明膠按1/75稀釋的100μl FITC標記的F(ab′)2羊抗小鼠免疫球蛋白(重和輕鏈特異性的)(Cooper Biomedical，Malvern，PA)于4℃下繼續(xù)保溫30分鐘。通過2毫微尼龍單絲篩預過濾以除去所有樣品中的細胞聚集體，然后立即進行FACS分析(Small Parts Inc.，Miami，F(xiàn)L)。也設(shè)置適當?shù)膶φ战M以檢出非特異性標記。在這些對照組中，骨髓細胞單獨與FITC標記的F(ab′)2反應(yīng)或與異型適配的對無關(guān)抗原特異的單克隆抗體反應(yīng)。使用Becton Dickinson Fac-Scan流動細胞計數(shù)器分析FITC標記的751腫瘤細胞。收集從20，000個細胞得到的數(shù)據(jù)以分析單克隆抗體反應(yīng)性型式。使用前方位角光散射(FALS)對90%光散射(LI900)的兩個參數(shù)分析消除FALS對熒光的印跡，并作為熒光對細胞數(shù)的直方圖給出。這些數(shù)據(jù)也作為對給定之表型標志物陽性的細胞百分數(shù)給出。
下列抗各種抗原的抗體均由市場購得抗細胞角蛋白、抗NF200、抗NF160、抗NF68(Sigma，St.Louis，MO)、抗Vimetin(Boeringer Mannheim)、抗GFAP和抗NSE(Dakopatts，Glostrup，Denmark)。FITC連接的第二抗體試劑購自Sigma。
結(jié)果1989年，19歲的白人婦女向其當?shù)蒯t(yī)生主訴頭痛和眼花。經(jīng)CT掃描診斷她長有大的超細胞實體瘤。對腫瘤作了部分外科切除并放入腦室內(nèi)膜(VP)支路以代之。手術(shù)后給予總劑量為5000cGY的局部放射治療。因控制了殘留的腫瘤，看上去她健康狀況良好，直到一年后她再次主訴頭痛。還發(fā)現(xiàn)她有沿VP旁路生長的多發(fā)性皮下腫塊。身體檢查發(fā)現(xiàn)接近其旁路的顱骨右側(cè)有一個腫塊，沿旁路管道的胸壁上有兩個腫塊。頭部CT掃描揭示有局部復發(fā)并在其旁路附近有軟組織腫塊。另外，還發(fā)現(xiàn)她的腹部有代謝沉積物。吸出顱骨上的損傷組織，從該部分得到之細胞的細胞學特征與胚細胞腫瘤一致。1990年2月，為進一步確定細胞組織學，再次切除一個胸壁腫塊。對腫瘤的組織學檢查發(fā)現(xiàn)，是與原來于1989年活體組織檢查得到的小的原始細胞凸出群體相似的非胚胎細胞瘤性混合胚細胞腫瘤。
751細胞系的來源在1990年2月進行外科手術(shù)時，將一小部分胸壁腫瘤送到實驗室去進行細胞分離并使之在細胞培養(yǎng)中體外生長。將腫瘤分割為大約3mm的幾部分。在37℃下用凡爾生-胰蛋白酶將切碎的腫瘤有限消化10分鐘。酶處理后，沉降除去未被消化的組織，收集上清液，離心，并收獲細胞沉淀餅。將細胞沉淀餅重新懸浮并培養(yǎng)于生長培養(yǎng)基中。
每天檢查初級培養(yǎng)物，且每周換一次培養(yǎng)基。原始細胞培養(yǎng)物含有可與塑料皿粘附和不粘附的兩種細胞。繼續(xù)培養(yǎng)兩個月后，形狀不同細胞類型的數(shù)目減少到只有兩個限定的作為共培養(yǎng)物復制的群體，一個是作為粘附細胞，另一個則作為非粘附細胞生長。約16周時觀察該胚細胞系的培養(yǎng)物，可見非粘附細胞生長超過粘附細胞群體，成為用有限稀釋法克隆的優(yōu)勢細胞類型并被定名為751-NA。已通過多細胞群體傳代，將751-NA的體外培養(yǎng)物以穩(wěn)定的形式維持于上述生長培養(yǎng)基中。為了用751-NA細胞系制備小鼠腫瘤模型，將細胞注入beige，nude，x相聯(lián)免疫缺陷(BNX)小鼠的皮下組織，并使之產(chǎn)生組織學上與原始病人腫瘤相似的胚細胞腫瘤。無菌除去BNX小鼠的皮下腫瘤，用凡爾生-胰蛋白酶處理(見上述參考文獻)，并于體外培養(yǎng)中重建一新的非粘附細胞系;并稱之為751-MU。用取自肝和引流淋巴結(jié)的代謝沉積物建立另外兩種細胞系，分別稱為751-LIV和751-LN。
751細胞系的特征檢查已建立之751細胞系的生長動力學和表型特征。用生長曲線分析法檢查細胞體外生長并顯示出獨特生長曲線，很少或沒有對數(shù)生長期，但發(fā)現(xiàn)開始時呈對數(shù)生長，經(jīng)過一個短的靜止期后存活率急劇降低。在7-8個小時的對數(shù)期內(nèi)計算倍增時間，來圖解顯示生長速率。
使用BNX小鼠模型估計細胞系的體內(nèi)生長特征。為確定細胞在注入小鼠體內(nèi)后的生長速率，將經(jīng)過一系列對數(shù)稀釋率的各種751細胞系接種到動物后肢的皮下組織內(nèi)。每星期兩次檢查小鼠并測量腫瘤的兩個垂直直徑的大小。發(fā)現(xiàn)在接種后20天時由小到只含100個細胞的接種物而長成明顯的腫瘤。接種1×102個細胞即可在僅僅7天內(nèi)而不是如大多數(shù)文獻報導的小鼠腫瘤模型那樣在2-3個月內(nèi)產(chǎn)生腫瘤。另外，多數(shù)報導接種少于5×102個細胞并未長成腫瘤。
根據(jù)使用抗神經(jīng)-外胚層胚細胞、神經(jīng)細胞譜系及膠質(zhì)細胞譜系之特異性細胞決定基的多克隆和單克隆抗體，對細胞所作的流動細胞計數(shù)分析來確定該細胞群體(751-NA，751-LIV，751-LN)的來源。使用下列抗體進行這一研究使用胎盤堿性磷酸酶(PAP)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)作為檢測非神經(jīng)元細胞之胚細胞的標志物;用細胞角蛋白和Vimentin作為神經(jīng)-外胚層來源之胚細胞的標志物;用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)作為膠質(zhì)細胞譜系的標志物;用神經(jīng)特異性烯醇酶(NSE)和神經(jīng)絲蛋白(NFP)-68，150和200作為神經(jīng)元譜系細胞的標志物。結(jié)果表明，該細胞群體(751-NA，751-MU，751-LN)代表了能在適當條件下形成神經(jīng)元或膠質(zhì)譜系細胞的原始腦胚細胞(見圖1)。體外尚未培養(yǎng)出表現(xiàn)有這種表型的人來源的其他細胞系。
進行實驗研究，以確定751細胞系是否可表達任何已知的包括HPCA-1(CD34)在內(nèi)的白細胞標志。對751胚細胞瘤所作的表達CD45，CD19，CD20，CD3，CD4，CD8，CD2，CD5，CD7，CD10，CD14，CD71和CD34的FACS分析結(jié)果表明，初原始細胞系缺少包括CD34標志物在內(nèi)的所有白細胞標志。
751細胞系的致癌基因表達已在許多細胞培養(yǎng)物系統(tǒng)中研究了原始致癌基因在細胞的惡性表型表達(體外和體內(nèi))中的作用。使用針對許多不同致癌基因的DNA探針進行Northern分析。這些分析顯示，751細胞含有豐富的致癌基因c-myc的mRNA以及c-fms致癌基因受體。這一點是特別重要的，因為c-fms致癌基因可作為巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)的受體。雖然已描述了腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞上的M-CSF受體，但其存在于神經(jīng)來源的原始細胞上卻未見報導。然而，其可見于骨髓中的先祖細胞上并且是參予單核細胞/巨噬細胞之譜系特異性分化的生長因子之一。該受體的表達即顯示了M-CSF在原始胚細胞之增殖和分化中的作用。
實施例2衍生于751細胞系的干細胞增殖因子下述實施例證明SCPF當被分泌時分子量為32KDa，當細胞結(jié)合時分子量為37KDa。對純化之蛋白質(zhì)所作雙向凝膠電泳表明存在多種PI在7.0至8.0之間的蛋白質(zhì)異型。
材料和方法放射標記與聚丙烯酰胺凝膠電泳751-腫瘤細胞生長于30ml培養(yǎng)瓶內(nèi)的含10%胎牛血清和抗生素(青霉素/鏈霉素)的Dulbecco氏基本培養(yǎng)基(DMEM)中，達到106細胞/m的細胞密度。一旦達到所需細胞密度后，將細胞洗滌除去生長培養(yǎng)基并在添加含有蛋氨酸和2%[35S]蛋氨酸(Amersham，IL)之25%DMEM的75%無蛋氨酸DMEM中再次培養(yǎng)并保溫。每24小時收集一次上清液，離心除去非粘附細胞，并于-20℃下保存之。然后將35S標記的上清液加至樣品緩沖液(Tris-Hcl，2-巰基乙醇，10%甘油，2%SDS及0.001%溴酚蘭)中并于100℃加熱5分鐘。然后將樣品上樣于SDS-PAGE凝膠上并按前述方法電泳。電泳后，在TCA(10%，W/V)，冰醋酸(10%，V/V)和甲醇(30%，V/V)中固定凝膠。固定后將凝膠放在Fluoro-hance″(Research Products Inc.，Prospect IL)中繼續(xù)浸漬30分鐘。取出凝膠，放在纖維紙(預浸濕的)上并于真空下加熱(60℃)干燥。干燥后，使凝膠暴露于高速X射線場(Kodak X-omat AR)并于-70℃下儲存24-48小時，然后進行放射自顯影并分析之。
在電泳緩沖液中溶解751細胞系的細胞溶胞產(chǎn)物、純化的蛋白質(zhì)及上清液，并使用Laemmeli的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)(1970)在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分析。除另外指出者外，均于變性條件下完成電泳。在各實驗中，均對分子量標志物(Bio Rad Laboratories)進行平行電泳并用考馬斯蘭染色。
SCPF的GEL純化培養(yǎng)后48小時從751-NA細胞培養(yǎng)物中收獲無血清上清液。使用Savant濃縮器將該上清液濃縮20倍，然后分析之。將濃縮的樣品加到12%制備性SDS-PAGE上。SDS膠電泳后用0.3M CuCl3對凝膠進行陰性染色。從凝膠中除去有用的蛋白帶，切成小片和放入含200μl洗脫緩沖液(0.25mM Tris-甘氨酸，PH8.3)的透析袋(12-14，000截留分子量)內(nèi)。然后于4℃下以100V將樣品電洗脫18小時。電洗脫后加反向電流30-40秒鐘，移出透析袋，收獲樣品并透析過夜。用SDS-PAGE法檢查所有沖洗制劑的純度，然后即可用作免疫原或用于細胞增殖試驗中。
抗SCPF抗體的制備免疫前給New Zealand白兔抽血，并用該免疫前血液確定基線。用含有Ribi佐劑的7μg純化之SCPF多肽經(jīng)皮下給兔免疫。初次注射后兩周，再次給兔注射含有Ribi佐劑的多肽。該兔最少接受5次免疫原加Ribi佐劑皮下接種。每次接種時均給兔抽血，并用Western印跡法檢驗血清中是否存在可與32KDa蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體。將所有含高濃度對32KDa蛋白質(zhì)特異性的抗體的血清分為若干等份并于-70℃下儲存。
Western免疫吸印在電泳緩沖液中制備751-NA腫瘤細胞系的溶胞產(chǎn)物并使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(Laemmeli，1970)解析蛋白質(zhì)。按照Towbin等人(1979)所述的技術(shù)，使用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印跡裝置將存在于凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在電印跡緩沖液(25mM)Tris，(192mM)甘氨酸和(5%V/V)甲醇中PH8.3條件下平衡凝膠。并也在該緩沖液中平衡硝酸纖維素膜。平衡后，將硝酸纖維素膜放在鉑陽極上面的濾紙上，然后在頂上鋪敷凝膠接著預浸漬濾紙。安好陰極后，于25V將樣品吸印/電泳35-40分鐘。轉(zhuǎn)移后，在含有明膠和吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS-凝膠-吐溫)中將膜/印跡洗4次。將印跡與預先用PBS-吐溫稀釋的兔多克隆抗體一起保溫過夜。保溫后，在PBS-凝膠-吐溫中洗印跡4次，再與過氧化物酶標記的羊抗兔抗血清(Sigma，St.Louis，Mo)保溫1小時，然后在PBS-吐溫中洗兩次并在PBS中洗兩次。加入底物(0.05%(W/V)4-氯-1-萘酚和30%H2O2)并在暗處室溫下將印跡保溫60分鐘。顯現(xiàn)的深蘭色帶表明陽性反應(yīng)。
克隆生成試驗751腫瘤細胞系能夠在含有添加了10%FBS之DMEM的甲基纖維素中形成集落(＞128個細胞/集落)。向1.0ml甲基纖維素中加入103個細胞，還向其中加入不同稀釋度的體積為100μl的抗32KDa蛋白質(zhì)的多克隆兔抗體。充分混合樣品并鋪敷于20mm Petri平皿中，然后在含5%CO2的大氣環(huán)境下于37℃接種。培養(yǎng)后48小時，使用倒置光學顯微鏡計數(shù)集落數(shù)。
對各種集落刺激因子特異的抗體購自Genzyme(Boston，MA)。
長期培養(yǎng)物(Gordon型培養(yǎng)物)為了在體外培養(yǎng)物中長期生長人造血干細胞，需要由粘附細胞群體提供可溶性和細胞接觸依賴性因子。在含有無防腐劑肝素的培養(yǎng)基中收集人骨髓抽出物并稀釋到長期培養(yǎng)基中，使之在25℃m2組織培養(yǎng)瓶中的終體積為8ml并含有2×107個有核細胞(Gordon et al.，1987，Exp.Hematol，15772)。生長培養(yǎng)基由添加了肌醇(40mg/ml)，葉酸(10mg/ml)，氫化可的松(10-6M)、2-巰基乙醇(2×10-4M)和馬血清與FBS之1∶1混合物(血清終濃度為25%)的α-MEM組成。為了有利于附著，將培養(yǎng)物置于37℃下。4天后，收集培養(yǎng)基和非粘附細胞，通過Ficoll/Hypaque離心以除去粒細胞和紅細胞，并將低密度部分移回培養(yǎng)瓶內(nèi)，然后，每隔一周用新鮮培養(yǎng)基半量置換生長培養(yǎng)基和非粘附細胞，直到形成會合的粘附單層。
從長期培養(yǎng)物中除去培養(yǎng)基和非粘附細胞并加入2ml新鮮培養(yǎng)基。然后以2000拉德照射培養(yǎng)瓶以清除粘附層內(nèi)的造血細胞。照射后，除去培養(yǎng)基并換成8ml含純化之細胞群體的新鮮培養(yǎng)基，以確定它們是否可在培養(yǎng)物中再構(gòu)成和引發(fā)骨髓細胞生成。作為對照，單用培養(yǎng)基重新配制某些長期培養(yǎng)物，以證明照射是以除去所有的造血先祖細胞(陰性對照)。另外，用正常骨髓細胞重新構(gòu)成某些長期培養(yǎng)物(陽性對照)。重新配制后，每周收集半量培養(yǎng)基和非粘附細胞，計數(shù)并鋪敷在含有生長因子的甲基纖維素培養(yǎng)基中。此外，在一定時間取出一個培養(yǎng)瓶并經(jīng)胰蛋白酶處理粘附細胞得到造血細胞集落分析中使用的單細胞懸液。
體外先祖細胞檢測法下述檢測法為用于檢測細胞CFU活性的標準方法。
設(shè)計前集落形式單位(Pre-CFU)檢測法以檢測人骨髓中的早期造血先祖細胞(Smith et al.，1991，Blood，772122)。將分離的細胞與rIL-1α(100U/ml)和rIL-3(50ng/ml)一起保溫，培養(yǎng)7天后收集并計數(shù)。在0.36%瓊脂糖中鋪敷1×105個細胞及1000U/ml重組體GM-CSF，并于保溫14天后記錄細胞集落數(shù)(750個細胞)。
為了檢測骨髓單核細胞/紅髓樣先祖細胞(CFU-GEMM)和紅髓樣系列的先祖細胞(BFU-E)，而使用結(jié)合的CFU-GEMM/BFU-E檢測法(Aeh et al.，1981，Blood 58309)。簡單地說，將1×105個純化的干細胞鋪敷在培養(yǎng)基總體積為1.0ml，含有添加了5×10-5M2-巰基乙醇、30%FBS、100U/ml人rIL-3和1.0U/ml Epo及0.9%甲基纖維素之Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基的35mm直徑平皿中。將培養(yǎng)物置于含5%CO2和10%空氣氧的濕潤大氣環(huán)境中于37℃下保溫14天。使用倒置顯微鏡計數(shù)細胞集落(＞50個細胞)。
還檢測了由CFU-GM代表的早期造血先祖細胞(Iscove et al.，1971，Blood 371)。簡單地說，將1×105個純化的干細胞鋪敷在含有總體積為1.0ml，添加了2%FBS、0.6%L-谷氨酰胺、0.9%甲基纖維素和100U/ml人重組rIL-3之α-MEM培養(yǎng)基的35mm直徑平皿中。按上述作CFU-GEMM檢測中所述的方法保溫培養(yǎng)物并使用倒置顯微鏡計數(shù)細胞集落。
結(jié)果SCPF的生物化學特性為了顯現(xiàn)由751細胞系分泌的蛋白質(zhì)，使用[35S]蛋氨酸進行脈沖追蹤實驗。在無蛋氨酸培養(yǎng)基中將細胞標記12小時，然后將其置于含有蛋氨酸的冷生物培養(yǎng)基中。然后對35S標記的上清液進行SDS-PAGE分離。發(fā)現(xiàn)一個由751腫瘤細胞分泌的主蛋白帶，顯示計算的表觀分子量(用回歸分析法)為32KDa。另外發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的最大分泌發(fā)生在培養(yǎng)后的24-36小時之間(圖2)。
用SDS-PAGE法分辨分泌多肽以分離該蛋白質(zhì)，并根據(jù)相對于分子量標志物的適移率鑒定出32KDa多肽。一旦被鑒定后，即用電吸印法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，切斷相當于32KDa蛋白質(zhì)的區(qū)域并溶解于二甲基亞砜(DMSO)中。將此蛋白質(zhì)接種到兔體內(nèi)，為產(chǎn)生的多克隆抗體傳代。
使用Western免疫吸印技術(shù)試驗抗751-LN總細胞溶胞產(chǎn)物的抗體的特異性。在該系統(tǒng)中，使用Bil-Rad半干轉(zhuǎn)移裝置將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后進行改良的比色ELISA分析。深蘭色帶的出現(xiàn)指示陽性帶反應(yīng)。這些檢測法顯示出可與表觀分子量(根據(jù)回歸分析結(jié)果計算的)為37KDa的單一蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)的多克隆抗體(圖3)。這一結(jié)果與分泌性蛋白質(zhì)的分子量(32KDa)結(jié)合考慮，揭示(1)存在將分泌性蛋白質(zhì)輸送到細胞表面的信號序列;(2)分子上有使蛋白質(zhì)固定于膜上的跨膜成分;以及(3)該蛋白質(zhì)有兩種形式，一種是膜結(jié)合形式的(37KDa)，另一種是細胞外可溶形式的(32KDa)。兩種分子形式均可作為“生長因子”，且其中膜結(jié)合形式的蛋白質(zhì)還在正常胚細胞發(fā)育期間參予細胞-細胞相互作用。
SCPF對胚細胞瘤細胞系的自泌生長調(diào)節(jié)作用使用抗32KDa蛋白質(zhì)的多克隆抗體，在甲基纖維素中進行集落抑制試驗。在前述實驗中，751細胞在甲基纖維素中48小時內(nèi)形成多于50個細胞的集落。如果32KDa蛋白質(zhì)是調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長的自分泌因子，阻斷蛋白質(zhì)與其細胞受體的結(jié)合應(yīng)能降低細胞復制和集落的生長。使用系列稀釋的兔多克隆抗32KDa抗體，將751-NA，751-MU和751-LN腫瘤細胞混入含有各不同稀釋度血清的甲基纖維素中，于37℃下保溫48小時，然后計數(shù)新形成的集落。就其相互關(guān)系來說，抗體的1/20稀釋液抑制98%的集落形成。這一抑制作用顯示為抗體濃度依賴性的，同時當血清稀釋度為1/120時出現(xiàn)明顯的抑制作用(＞25%)。1/20稀釋的正常兔血清并不阻斷集落形成(圖4)。此外，用3H胸苷攝入檢測法試驗抗37KDa抗體阻止細胞增殖的能力(圖5)。該圖顯示抗體事實上確實可抑制細胞增殖，并且這一抑制作用是對胚/干細胞特異的，因為只有751-Mu Met和BO Bm，I細胞受到了抑制。A251成神經(jīng)細胞瘤細胞系則沒有受到抑制。
SCPF與人骨髓細胞群體的相互作用下文所述的實驗結(jié)果表明，抗SCPF抗體(SAM.1)可與骨髓細胞的一個小群體發(fā)生特異性地反應(yīng)，并且該細胞群體看來落入CD34+分隔區(qū)內(nèi)。最后，抗SCPF抗體可識別不同于CD34蛋白質(zhì)的標志物，并且可能在描述干細胞群體中是很重要的。
鑒于751細胞的原始性質(zhì)，而且它看來是受自分泌生長因子(SCPF)調(diào)節(jié)的，所以設(shè)計下述實驗以確定純化的天然蛋白質(zhì)是否可與骨髓細胞相互作用。使用(1)骨髓-甲基纖維素克隆生成檢測法，(2)3H-胸苷摻入法，以及(3)流勸細胞計數(shù)法分析這一相互作用。圖3顯不了用考馬斯蘭染色的SDS-PAGE凝膠，以及使用這些檢測法中所用之純化天然37KDa蛋白質(zhì)的SAM.1多克隆抗體得到的Western印跡。凝膠上存在一條以37KDa遷移的單一帶(圖3A)。當與SAM.1抗體反應(yīng)后該凝膠的硝酸纖維素印跡揭示出在同一位置上的帶(圖3B)。當在克隆生成檢測法中使用不同濃度純化之SCPF時，沒有觀察到有限定形態(tài)學的集落。
表1干細胞增殖因子的人骨髓克隆生成活性刺激劑 GM G M 胚細胞 總計r人GM-CSF 50u/ml 26/31 70/59 11/15 - 107/10510u/ml 14/20 52/41 6/5 - 72/661u/ml 5/3 6/1 1/0 12/4751條件培養(yǎng)基(×10濃度) - - - 9/7751-SCPF(天然)100μg/ml - - - 16/15/19751-SCPF(天然)10μg/ml - - - 11/13/9751-SCPF(天然)1μg/ml - - - 6/8/7對照-單加培養(yǎng)基 - ︱ - - ︱檢測法-克隆生成(甲基纖維素)-體外1×104個非粘附細胞/小井-14天檢測法然而，在這些檢測試驗中觀察到在很松散的細胞簇內(nèi)存在胚細胞樣細胞。從克隆生成試驗中除去這些胚細胞樣細胞-置入有或沒有基質(zhì)飼養(yǎng)層的懸浮培養(yǎng)物中并使用SCPF擴充之。于培養(yǎng)后96小時收獲沒有基質(zhì)飼養(yǎng)細胞的懸浮液，使用單克隆抗體HPCA-1(抗CD34)作為陰性對照的異型對照組及作為陽性對照的W6/32(抗人Ⅰ類HLA)單克隆抗體進行流動細胞計數(shù)分析。圖6顯示這些細胞的流動細胞計數(shù)分析結(jié)果。可見所有細胞均著染了W6/32抗Ⅰ類HLA，而且有很高百分比例的細胞還與抗CD34反應(yīng)，由此表明并不是所有細胞都是CE34+。這一實驗結(jié)果可能是由于1)在擴充懸浮培養(yǎng)物前以克隆生成檢測中去掉了非CD34+細胞，或者(2)在懸浮培養(yǎng)時細胞發(fā)生分化。但這一事實表明SCPF蛋白可與CD34+表型的細胞相互作用。置于有基質(zhì)飼養(yǎng)層之長期培養(yǎng)物中的細胞(圖7)在Gordon培養(yǎng)條件下分析其連續(xù)生長情況。
圖7顯示這些細胞在SCPF不存在下在長期Cordon培養(yǎng)物中發(fā)生增殖。可見基質(zhì)細胞對于兩種可溶性因子及細胞一細胞相互接觸以保持良好的生長狀態(tài)和存活率是很重要的。僅給基質(zhì)條件培養(yǎng)基的細胞不增殖或存活。在72小時從Gordon培養(yǎng)物中除去細胞，并于重組體GM-CSF存在下試驗其復制效率(表2)。
表2SCPF刺激的骨髓細胞的復制效率以人重組體CM-CSF的反應(yīng)克隆類型(形態(tài)學)處理/培養(yǎng)物 濃度(u/ml) 總計G GM MGordon培養(yǎng)物人r-GM-CSF 100 29 36 11 7650 23 41 9 73
養(yǎng)物進行傳代。另一方面，SCPF處理的培養(yǎng)物的細胞存活性則迅速降低，以致到第7天時只有10-15%細胞存活。然而，該殘留的CD34+細胞群體現(xiàn)已成為SCPF反應(yīng)性的，并已在培養(yǎng)物中增殖達12周。對照培養(yǎng)物(沒有生長因子)維持了3周后最終死亡。接受IL-3或IL-6的細胞是呈現(xiàn)混合形態(tài)的并包含粘附和非粘附細胞。細胞離心制劑顯示該培養(yǎng)物中包含許多成熟的粒細胞及成熟的胚細胞樣細胞。這些IL-3和IL-6處理的細胞在連續(xù)培養(yǎng)中維持達16周。SCPF處理的細胞大小更為均勻，在外觀上都是單核的和胚細胞樣的，并且是非粘附的。根據(jù)劑量反應(yīng)實驗，可知SCPF的最適濃度在50ng/ml至10ng/ml之間。
培養(yǎng)后12周時，用流動細胞計數(shù)法檢測SCPF處理的CD34+細胞是否有CD34、CD38及DR/Ⅱ類HLA表達。圖14和15所示數(shù)據(jù)說明，根據(jù)大小，SCPF擴充的CD34+細胞由兩個形態(tài)學群體組成。圖14(C區(qū)域)顯示有CD34+、CD38-和DR-表型的小細胞群體。大的群體(圖15，B區(qū)域)是CD34+，CD3810W和DR10W。因此可見，SCPF能在體外培養(yǎng)物中誘導CD34+細胞增殖，同時保持其CD34+表型，即可使CD34+細胞增殖而不發(fā)生分化。還于培養(yǎng)后8周時試驗SCPF擴充之CD34+細胞和IL-3擴充之CD34+細胞的復制效率(表3)。
25 14 27 8 465 4 19 2 251 - 11 2 13只加培養(yǎng)基 1 2 1 4看來，在集落檢測中誘導，然后在Gordon培養(yǎng)物中擴充的細胞能夠?qū)M-CSF反應(yīng)，并形成粒細胞(G)、單核細胞(M)及混合的GM細胞的集落，從而表明它們能夠經(jīng)受譜系分化而成為骨髓樣細胞。在3H胸苷摻入試驗中檢測到的骨髓細胞的增殖還表明，SCPF誘導了骨髓來源之細胞增殖(圖8)。
從上述實驗證實，SCPF可與骨髓細胞的群體相互作用，因為已產(chǎn)生了抗SCPF的多克隆兔抗體(SAM.1)，并且SCPF是細胞結(jié)合形成的，故進行骨髓細胞的流動細胞計數(shù)分析以確定與SCPF相互作用之骨髓細胞的表型性質(zhì)。使用粘附耗竭的人骨髓細胞，并以人臍帶血作為新的造血干細胞的來源，試驗SAM.1識別人骨髓細胞的能力。圖9顯示SAM.1可與骨髓(2.5%)和臍帶血(1.96%)內(nèi)的很小細胞群體結(jié)合。在限定這一細胞群體的嘗試中，使用抗CD34藻紅蛋白(PE)標記的抗體和SAM.1熒光素異硫氰酸酯(FITC)系統(tǒng)進行雙色FACS分析(圖10)。根據(jù)這些實驗的結(jié)果及以前的發(fā)現(xiàn)，可知751細胞并不表達CD34，因而SAM.1不是針對CD34標志物本身的，顯然SAM.1能識別共表達CD34標志物和SCPF的細胞群體。
顯示CD34+和SCPF+的細胞群體代表了1.65%總的被檢細胞群體(圖10)。還用流動細胞計數(shù)法檢測了SAM.1識別小鼠、牛及羊骨髓內(nèi)細胞群體的能力。所有這些例子中，SAM.1不能識別任何一個來自這些非人的骨髓的有意義的細胞群體。
使用抗SCPF抗體對純化的CD34+細胞進行流動細胞計數(shù)研究。使用與抗CD34單克隆抗體偶聯(lián)的免疫磁性小球從正常人骨髓中分離出了CD34+群體并儲存于液氮以備流動細胞計數(shù)用(Kessler et al.，1987，Blood 70321)。基于單和雙色分析，可知SAM.1能識別CD34選擇的細胞群體(圖11)。此外，SAM.1和抗CD34之間沒有競爭性作用(圖12)。在這些實驗中，CD34+細胞或單與SAM.1或與SAM.1/抗CD34的混合物一起保溫。從圖12中可以看出，抗CD34并不干擾SAM.1與這些細胞結(jié)合的能力。重復這些實驗，但改為將CD34+細胞單與抗CD34或與SAM.1/抗CD34的混合物一起保溫。如圖12A所示，SAM.1不干擾抗CD34抗體的結(jié)合。這一結(jié)果再次表明，SAM.1抗體可識別不同的細胞表面抗原。
使用SCPF建立CD34+細胞的長期培養(yǎng)物在外加純化之天然SCPF的情況下引發(fā)CD34+細胞的長期培養(yǎng)物。還包括不加任何外源生長因子的培養(yǎng)物，以及加有100U/ml白介素3(IL-3)和100U/ml白介素6(IL-6)的培養(yǎng)物。將純化的CD34+細胞以200，000細胞/ml的濃度加入24小井平板的各小井內(nèi)，并加入適當?shù)纳L因子。加入不同濃度(1ng/ml至10ng/ml)的純化的SCPF。每隔3天換培養(yǎng)基并加入外源生長因子。每天檢查所有培養(yǎng)物以估計細胞的存活性和生長狀態(tài)。
這些研究的結(jié)果總結(jié)于圖13中。接受IL-3或IL-6的培養(yǎng)物迅速擴增，且?guī)缀醪淮嬖诓换罴毎降?天，對所需培表3對干細胞增殖因子和人重組體IL-3有反應(yīng)性之CD34+細胞的復制效率細胞φ處理r-IL-3 r-GM-CSF100§ 50 25 5 100 50 25 5CD34+擴充的 r-IL-3 12↑ 7 1 0 9 6 3 -(8周)CD34+擴充的 SCPF 162 109 92 41 145 114 62 31(8周)CD34+擴充的 IL-6 18 11 6 - 15 12 4 -(8周)↑所記錄的集落數(shù)φ103個細胞/小井§單位/ml這些數(shù)據(jù)再次提示在IL-3存在下增殖的細胞復制效率很差(使用重組體IL-3和GM-CSF)。另一方面，于IL-3和GM-CSF存在下，SCPF處理的CD34+細胞則有很好的復制效率，由此再次表明了SCPF擴充之細胞的原始性質(zhì)。因為CD34+細胞于去掉SCPF后4-5天內(nèi)即死亡，可見SCPF并不能于CD34+細胞施加任何惡性表型。
就該生長因子與骨髓干細胞作為初級信號相互作用的能力所進行的研究表明，SCPF能夠誘導BFU和CFU-GM集落(圖16和17)。SCPF看來并不能誘導CFU-GEMM。然而，該因子能夠提高集落刺激因子混合物(GM-CSF，IL-3和EPO)的活性，從而顯著增加對BFU(圖16A和C)、CFU-GM(圖17A和C)及CFU-GEMM(圖18A和C)集落的CSF活性。
SCPF誘導CD34+細胞進入細胞周期下述實驗分析SCPF和IL-3誘導純化CD34+骨髓細胞復制的能力。結(jié)果證明，當單獨給予SCPF和IL-3時，兩者均可刺激細胞進入細胞周期。當將兩種細胞激活素結(jié)合加到培養(yǎng)的細胞內(nèi)時，可對增加Gα期細胞的百分比產(chǎn)生加合作用(表4)。
表4用流動細胞計數(shù)法和Propidium Iodine法檢測的SCPF對CD34+細胞進入細胞周期的誘導作用
$100μ/ml r Hu-IL-3§100ng/mlSCPF抗體抑制研究下述研究工作旨在檢驗人GM-CSF、G-CSF、M-CSF和IL-3特異性多克隆抗體在甲基纖維素骨髓集落檢測法中中和SCPF誘導的胚細胞集落形成上的應(yīng)用(表5)。
表5特異性抗體對SCPF集落形成活性的抑制作用SCPF/胚細胞集落數(shù)細胞 抗體 處理100ng/ml 50ng/ml 25ng/mlBM2+ 24 16 8抗GM-CSFN/A - 23 14 9BM + 21 13 6抗G-CSFN/A - 19 14 4BM + 26 14 5抗M-SCFN/A - 19 16 7BM + 19 11 5抗IL-3N/A - 17 10 5BM + 8 2 0SAM.1N/A - 26 15 8單用IL IL-3(20ng GM(20 GM(20ng-3(20 /ml)+SCF ng/ml) /ml)+SCFng/ml) (25ng/ml) 單用 (25ng/ml)BM + 24φ59 31 92SAM.1M/A - 22 63 33 86a使用1×104個細胞進行克隆生成檢測b所觀察到的總集落數(shù)數(shù)據(jù)表明這些多克隆抗體均不能中和由SCPF誘導的胚細胞集落，而SAM.1則能夠中和它們的誘導作用。然而，SAM.1抗體卻不能抑制GM-CSF和IL-3的人干細胞因子(SCF)增強效應(yīng)。這表明SCPF不同于已知的CSF，因為SAM.1抗體并不抑制SCF的功能，SCPF在功能上看來不同于SCF。
兩向凝膠電泳化學試劑，丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺，尿素，過硫酸銨、N，N，N，N-四甲基乙二胺和AG501-Xg分析純混合的柱床樹脂均購自BiO-Rad(Rockville Centre，NY)。Pharmalyte pH3-10和Biolyte pH3-10兩性電解質(zhì)和分子量標準品(Mr20，100，胰蛋白酶抑制劑，大豆;24，000，胰蛋白酶原;29，000，碳酸酐酶;36，000，甘油醛-3-磷酸脫氫酶;45，000，白蛋白，卵;66，000，白蛋白，牛;97，400，磷酸化酶B;116，000，β-半乳糖苷酶)均購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo)。BCA蛋白質(zhì)檢測試劑購自Pierce(Rockford，IL)。所有其他化學試劑均為分析純并分別購自Fisher Scientific或Sigma Chemical Co.。
第一徑向。在內(nèi)徑為0.3cm底部封有石臘的11cm玻璃試管中制備等電聚焦凝膠(IEF)(O′Farrell，J.Biol.Chem.，2504009，1975)。分兩步驟制備含有4%丙烯酰胺，9M尿素，2%Nonidet P-40和2%兩性電解質(zhì)的試管凝膠。首先，混合下列成分并于AG501-X8樹脂存在下(45mg/ml混合物)輕輕攪拌約10分鐘，這些成份為2.5ml丙烯酰胺儲備溶液(38%(W/V)丙烯酰胺和于水中的2%(W/V)N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺)，5.0ml10%(W/V)Nonidet P-40(加在水中)，13.75g尿素和3.75ml水。然后通過玻璃棉塞過濾該丙烯酰胺混合物以除去樹脂。第二步，將4.23ml丙烯酰胺混合物和5%PH3-10兩性電解質(zhì)(50%Pharmalytes和50%Biolytes)，適當體積的溶解的蛋白質(zhì)樣品及去離子水(加至總體積4，98ml)相混合以制得用于各蛋白質(zhì)的凝膠。除氣約2分鐘后，加入5.0μl新制備的10%(W/V)過硫酸銨和3.5μlN，N，N，N-四甲基乙二胺。凝膠迅速成型(0.76ml凝膠混合物/管)，用去離子水復蓋，并使之聚合3小時。所有蛋白質(zhì)均以13，000×g離心3分鐘，然后加到凝膠混合物中。
將試管放入下方小室(陽極)含0.01M磷酸且上方小室(陰極)含脫過氣的0.02M氫氧化鈉的Bio-Rad 155型凝膠電泳槽內(nèi)。使用350V恒定電壓于室溫等電聚焦18小時。等電聚焦完成后，連接充滿空氣的注射器/裝到試管基底端的橡膠管并稍微加壓以自玻璃試管內(nèi)輕輕擠出凝膠。使用表面電極(Bio-Rad)檢測IEF pH梯度。然后在5.0ml平衡緩沖液(2.3%十二烷基磺酸鈉，5%β-巰基乙醇和10%(V/V)甘油加于0.062M Tris-Hcl中，PH6.8)將凝膠輕輕攪動10分鐘，或在乙醇/干冰浴中很快冷凍并儲存于-70℃下備用。
第二徑向。按照Laemmli所述的方法，在加有4%丙烯酰胺堆積膠的10%凝膠(厚1.5mm，長14.5cm)上以板SDS-PAGE法分離樣品。將包埋在1%瓊脂糖(溶于平衡緩沖液中)中的第一徑向IEF凝膠和分子量標準品使用1%瓊脂糖(溶在0.125M Tris-Hcl中PH6.8)連接到堆積膠上。使用100mA/凝膠的恒定電流于室溫(20-25℃)下進行電泳，直到染料跑完凝膠的大約100%長度。
固定和染色在甲醇/乙酸/水(40/10/50)中固定第二徑向板凝膠內(nèi)的分離的蛋白質(zhì)。按標準技術(shù)用考馬斯蘭染色固定的凝膠，或按下述改良方法進行銀染色。染色前，在3次更換的20%乙醇中將固定的凝膠最少洗1小時。按標準方法(Merril，et al.，Methods Ezymol.，104441，1984)進行染色。在恒定輕輕攪拌下使凝膠著染30-45分鐘。然后在兩次更換的20%乙醇中將已染色的凝膠洗總共20分鐘后，進行顯色。將凝膠放入乙醇/乙酸/水(20/10/70)中終止顯色。使凝膠在Kodak Rapid Fixer(膠片強度)中放置2-5分鐘以除去本底染色。然后用3次更換的水將凝膠洗總共30分鐘，再在Kodak海波清洗劑中洗5分鐘以除去凝膠中的固定劑。在3次更換的20%乙醇中洗最少1小時，以從凝膠中除去海波清洗劑。最后，于室溫下在兩片Bio Gel Wrap(Bio Design，Inc.，Carmel，NY)之間包裹各凝膠以干燥已染色的凝膠。
染色凝膠的照片按照制造高的說明書用Kodak電泳復制膠片制取銀染色凝膠的直接印制品。該膠片顯現(xiàn)出見于凝膠中之蛋白質(zhì)的永久記錄，并可借助光源盒顯現(xiàn)出越過幾個凝膠的蛋白質(zhì)圖形的光學匹配。在少數(shù)的情況下，使用Kodak Ektapan4×5英寸膠片對凝膠照像并印到16×20英寸Orthofilm上。所得到的印制品顯示蛋白質(zhì)斑點為印在干凈的膠片上的大黑點。這些印制品的大版面易于檢查，并因直接在印制品上得到蛋白質(zhì)圖形差別的精確記錄而引人注目。
SCPF活性的生物檢測法以增殖檢測法，由CD34+細胞系(ML-1)使用[3H]-甲基胸苷([3H]Tdr)摻入來檢測從SDS-PAGE凝膠(1-D或2-D)洗脫的蛋白質(zhì)中是否存在SCPF(該方法是由我們實驗室建立的)。另外，也可用其他CD34+細胞如KG-1a CD34+細胞(ATCC CCL 246.1)檢測試驗制劑的SCPF活性。
簡單地說，在每小井100μl體積含有10%FBS和L-谷氨酰胺的Iscovas改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基中將1×108個ML-1細胞接種于園底96小井微量滴定板的小井內(nèi)。將2倍系列稀釋的假定的SCPF蛋白質(zhì)制劑加入(100μl/小井)一式三個小井內(nèi)。然后在含5%CO2(在空氣中)的濕大氣環(huán)境下于37℃將培養(yǎng)物保溫48小時。保溫后，用1μCi[3H]Tdr/小井將培養(yǎng)物標記時間為培養(yǎng)的最后16-18小時。用液閃計數(shù)法定量放射性同位素摻入量。表6和7分別顯示了使用KG-1a和ML1細胞進行生物分析所得到的[3H]胸苷摻入量。試驗自SDS-PAGE，37KDa蛋白質(zhì)分離的2倍稀釋的假定SCPF(見上文)，[3H]胸苷摻入的試驗結(jié)果顯示制劑中存在SCPF生物活性(與對照組比較)。
使用SDS-PAGE上鑒定的37KDa蛋白質(zhì)中分離的制劑進行2-D凝膠電泳。用考馬斯蘭染色后，在2-D凝膠上鑒定出多個SCPF異型。將凝膠切成小塊并移出8個含蛋白質(zhì)的凝膠片。按前述方法從這8片凝膠中洗脫蛋白質(zhì)。在各凝膠片中洗脫的蛋白質(zhì)上進行生物分析。[3H]胸苷的摻入與見于4號凝膠片中的異型制得的蛋白質(zhì)制劑相關(guān)(表8，CPM中所示的數(shù)據(jù))。在4號凝膠片中鑒定的SCPF異型用表面電極分析測得代表PH7.0至8.0之間的蛋白質(zhì)。該級分中的生物活性證明了如在生物檢測中對細胞激活素進行兩倍稀釋所看到的經(jīng)曲稀釋效應(yīng)。
使用SAM.1抗體進行Western印跡分析，以進一步證實表8中鑒定的生物活性數(shù)據(jù)。將按上述方法跑兩徑向凝膠(PH梯度凝膠和繼后的分子量凝膠)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素或PVDF濾膜上，并使用作為第一抗體的SAM.1和作為第二抗體的堿性磷酸酶共軛的羊抗兔LgG(輕和重鏈)(BioRad)按標準雜交技術(shù)進行雜交。數(shù)據(jù)表明，抗體與PH范圍為7.0-8.0(此范圍與表現(xiàn)有SCPF生物活性的蛋白質(zhì)相符)的蛋白質(zhì)強烈反應(yīng)。
可使用SAM.1或其他SCPF特異性抗體以標準的免疫親和技術(shù)(Current Protocols in Immunology，Chapter8，Coligen，et al.，eds.，1992)將從2-D凝膠上不連續(xù)斑點得到的SCPF進行純化為均質(zhì)形式。從免疫親和基質(zhì)上洗脫SCPF，然后按上述方法進行等電聚焦，但最好在一個較窄的PH范圍(PH6-8)內(nèi)進行。然后可根據(jù)上述生物學檢測試驗將凝膠中分離的蛋白質(zhì)進行SCPF生物活性篩選。
表6SCPF生物學檢測KG-1a細胞μg/ml SCPF(37KDa制劑)-三份樣品的平均值1 0.5 0.250 0.125 0.063CPM 120,196 118,351 73,472 41,700 39,748S.D.(+/-) 36,890 13,105 13,060 7,733 1,2810.031 0.016 0.008 0.004 0.002 對照CPM 39,052 40,874 40,586 40,530 41,852 44,884S.D.(+/-) 5,019 3,308 3,350 3,175 2,392 7,499
表7SCPF生物學檢測ML-1細胞μg/ml SCPF(37KDa制劑)-三份樣品的平均值1 0.5 0.250 0.125 0.063CPM 115,151 99,383 90,586 89,309 49,462S.D.(+/-) 7,737 7,332 2,702 4,593 1,6590.031 0.016 0.008 0.004 0.002 對照CPM 54,680 53,180 50,606 54,161 53,432 48,020S.D.(+/-) 5,099 4,107 1,101 1,799 1,076 4,120表8CEL級部(1-D)-對ML細胞系的SCPF生物學檢測回收之蛋白質(zhì)的稀釋度-三份樣品的平均值CPM 1:3 1:6 1:12 1:24 1:48 1:96 1:192 對照組*片1-CPM 4115 1501 6177 4891 5934 4191 4377 0片2-CPM 6853 3568 5837 5216 5306 5976 5493片3-CPM 229 4358 3427 4310 3625 5012 1313片4-CPM 13454 9386 8631 8214 8722 1600 0片5-CPM 0 884 6936 0 0 0 2353片6-CPM 1302 0 3251 1817 948 636 0片7-CPM 0 0 0 0 2606 4480 3587片8-CPM 5209 0 0 1209 0 4650 2162＊ 對照組平均CPM-45，020±4，120(S.D.)
檢測與其他生長因子的協(xié)同作用以分離自人尸體脊椎體的骨髓中免疫選擇ML-1 CD34+細胞。接觸細胞激活素前和后用CD34-PE、CD38-FITC和Cr-PerCP著染免疫選擇的CD34+細胞，在1.0ml加或不加各種細胞激活素(單一或合并的)的Dulbecco氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)2×105個CD34+細胞(見表9和10)。培養(yǎng)前和培養(yǎng)后6天計數(shù)細胞。然后用SCPF抗體，SAM.1著染細胞并進行FACS分析。根據(jù)側(cè)散射和PE熒光記錄光柵中通過的CD34+細胞。根據(jù)向前的光散射來鑒定兩個不同大小的CD34+細胞群體(大的和小的)。分析這些細胞的CD38和Dr表達。表9和10中分別給出大和小CD34+細胞群體的數(shù)據(jù)。
這些結(jié)果顯示SCPF和IL-3當單獨使用時能夠刺激細胞進入細胞周期。SCPF和IL-3結(jié)合則具有加成效果，并可能對于增加大CD34+細胞及小CD34+細胞的總數(shù)有協(xié)同作用。
細胞系的寄存物產(chǎn)生SCPF的751細胞系已寄存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD);并給予了下列登記號細胞系751-NA-15;登記號CRL 10092本發(fā)明并不只限已敘述的特定實施方案限定的范圍，這些實施方案旨在舉例說明本發(fā)明的個別方面，而任何功能上等同的細胞系、DNA構(gòu)建體或因子均包括于本發(fā)明范圍內(nèi)。事實上，除了本文所揭示并描述的內(nèi)容外，根據(jù)上面所作描述和附圖，對本發(fā)明所作的各種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。這些修改將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求之范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.包含有下述特性之多肽的干細胞增殖因子(a)刺激人骨髓干細胞的增殖；(b)結(jié)合能抑制(a)之干細胞增殖作用的SAM.1抗體；以及(c)在結(jié)合和中和IL-3、GM-CSF、G-CSF或M-CSF的抗體存在下刺激人骨髓干細胞的增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的干細胞增殖因子，其中多肽是用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定分子量為32千道爾頓的可溶性多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的干細胞增殖因子，其中多肽含有跨膜區(qū)并且用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測得其分子量為37千道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的干細胞增殖因子，其中人骨髓干細胞表達CD34。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的干細胞增殖因子，其由胚細胞瘤細胞系產(chǎn)生。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的干細胞增殖因子，其中胚細胞瘤細胞系是神經(jīng)-外胚層來源的。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的干細胞增殖因子，其中胚細胞瘤細胞系是751-NA-15，寄存在ATCC寄存登記號為CRL 10092。
8.與權(quán)利要求1的干細胞增殖因子免疫特異結(jié)合的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的抗體，其為單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的抗體，該抗體中和干細胞增殖因子的生物學活性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的抗體，其為單克隆抗體。
12.產(chǎn)生權(quán)利要求1之干細胞增殖因子的方法，該方法包括(a)以指導基因表達之調(diào)節(jié)性核苷酸序列的操作控制下，培養(yǎng)含有編碼權(quán)利要求1之干細胞增殖因子的核苷酸序列的細胞，從而由該培養(yǎng)的細胞表達生物學活性干細胞增殖因子;以及(b)從培養(yǎng)物中回收生物學活性干細胞增殖因子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中培養(yǎng)的細胞是胚細胞瘤細胞系。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中胚細胞瘤細胞系是神經(jīng)-外胚層來源的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中胚細胞瘤細胞系是在ATCC的保藏登記號為CRL 10092的751-NA-15細胞系。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中培養(yǎng)的細胞是用處于調(diào)節(jié)性核苷酸序列的操作控制下編碼干細胞增殖因子的重組DNA載體轉(zhuǎn)化的基因工程宿主細胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中宿主細胞是原核細胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中宿主細胞是真核細胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中重組載體還包含編碼可選擇性標志的核苷酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中干細胞增殖因子是從培養(yǎng)基中回收的。
21.刺激人骨髓干細胞增殖的方法，該方法包括使骨髓細胞與權(quán)利要求1的干細胞增殖因子接觸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中骨髓干細胞是CD34+。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，是在培養(yǎng)物中實際操作。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，是在體內(nèi)實際操作。
25.抑制由權(quán)利要求1的干細胞增殖因子刺激的腫瘤細胞增殖的方法，包括將腫瘤細胞與能結(jié)合和中和干細胞增殖因子的抗體或抗體片段接觸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，是在培養(yǎng)物中實際操作。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，是在體內(nèi)實際操作。
28.生產(chǎn)衍生于胚細胞瘤細胞系的細胞激活素的方法，所說的細胞激活素刺激人干細胞的增殖，該方法包括(a)培養(yǎng)含有編碼細胞激活素之核苷酸序列的細胞，所說的編碼序列處于指導基因表達之調(diào)節(jié)性核苷酸序列的操作控制下，以便由培養(yǎng)的細胞表達生物學活性細胞激活素;以及(b)從培養(yǎng)物中回收生物學活性細胞激活素。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中培養(yǎng)的細胞是胚細胞瘤細胞系。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中培養(yǎng)的細胞是用處于調(diào)節(jié)性核苷酸序列的操作控制下編碼細胞激活素的重組DNA載體轉(zhuǎn)化的基因工程化細胞。
31.包括有下列特性之多肽的干細胞增殖因子(a)刺激人干細胞的增殖;以及(b)在結(jié)合并中和權(quán)利要求1之干細胞增殖因子、IL-3、GM-CSF、G-CSF或M-CSF的活性的抗體存在下，刺激人干細胞的增殖。
32.分離的編碼權(quán)利要求1之干細胞增殖因子的多核苷酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA，cDNA或RNA。
34.包含權(quán)利要求32之多核苷酸序列的生物學功能表達載體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的載體，其中載體是質(zhì)粒。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的載體，其中載體是病毒。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的載體，其中病毒是RNH病毒。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的載體，其中病毒是反轉(zhuǎn)錄病毒。
39.用權(quán)利要求34的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的宿主細胞，其中宿主是原核細胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求39的宿主細胞，其中宿主是真核細胞。
42.檢測被檢對象體內(nèi)與干細胞增殖因子相關(guān)之疾病的方法，該方法包括使權(quán)利要求8的抗體與懷疑患有干細胞增殖因子相關(guān)疾病之被檢對象的樣品接觸，并檢測抗體的結(jié)合。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中疾病選自白血病、再生障礙性貧血、神經(jīng)元病變、嚴重的復合免疫缺乏癥及脾功能亢進這一組疾病。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中檢測是體內(nèi)檢測。
45.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中檢測是體外檢測。
46.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中抗體是有可檢標記的。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中可檢測標志選自放射性同位素，熒光化合物，生物發(fā)光化合物，化學發(fā)光化合物及酶這一組物質(zhì)。
48.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中骨髓細胞進一步與細胞激活素接觸。
49.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中細胞激活素選自IL-3、IL-6和SCF這一組。
50.在ATCC的寄存登記號為CRL 10091的胚細胞瘤細胞系。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離自人胚細胞瘤細胞系的自分泌生長因子，具體是涉及干細胞增殖因子(SCPF)的生產(chǎn)，純化和應(yīng)用。本發(fā)明的蛋白質(zhì)以可溶性及細胞結(jié)合兩種形式存在，其可在少數(shù)人骨髓細胞的表面上檢測到并可刺激這些細胞的增殖。因此，SCPF可具有廣泛的應(yīng)用，包括(但不只限于)增加造血干細胞生長。此外，用抗體除去該蛋白質(zhì)可用于控制腫瘤細胞生長。
文檔編號C07K16/22GK1081715SQ9310521
公開日1994年2月9日 申請日期1993年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月6日
發(fā)明者M·J·P·羅曼, C·E·巴格威爾, P·D·羅曼 申請人:佛羅里達大學研究基金會有限公司