食品中鉛對人體的生物利用率及毒性的聯(lián)合評價模型的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種食品中鉛對人體的生物利用率及毒性的聯(lián)合評價模型。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及人類采礦、冶煉等活動的加劇，大量的鉛排放到環(huán)境中，致使農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中鉛污染。人類主要通過膳食和呼吸途徑攝入鉛，而長期攝入被鉛污染的食品會引起人體的鉛中毒。食品安全性評價是預(yù)防人體鉛中毒的重要保障。目前大多數(shù)評價方法基于食品中鉛的含量間接計算食品攝入鉛對人體的生物效應(yīng)，該方法并不能真實反映食品攝入鉛的生物效應(yīng)。另外常規(guī)的動物體內(nèi)試驗耗時長、成本高、種屬差異較大，限制了其數(shù)據(jù)在人體的外推性。因此建立相對操作方法簡單、經(jīng)濟(jì)有效地評價食品中鉛對人體生物利用率及毒性的方法已成為研究熱點。
[0003]小腸是人體攝入食品中鉛后吸收的主要部位。食品中鉛在小腸中的吸收是決定其人體生物利用的關(guān)鍵因素。Caco-2單層細(xì)胞模型，即人結(jié)腸癌細(xì)胞模型，是目前被廣泛應(yīng)用于研究外源物質(zhì)在人體吸收特征的代表性體外細(xì)胞模型之一。但該模型存在缺陷，尤其是缺乏分泌黏液的功能。另外，該模型也缺乏鉛向體內(nèi)器官的轉(zhuǎn)運和蓄積過程的評價，從而與鉛在人體內(nèi)的吸收過程存在差異，導(dǎo)致實驗結(jié)果與鉛的實際生物利用率存在差異。
[0004]基于以上原因，本發(fā)明利用通過在Caco-2細(xì)胞中加入具有分泌黏液的能力的HT29-MTX細(xì)胞，共培養(yǎng)形成腸黏膜上皮細(xì)胞層，并聯(lián)合QSG7701肝細(xì)胞建立人源性聯(lián)合細(xì)胞模型同時評價食品中鉛對人體的生物利用率及毒性的方法。該模型接近真實的人體生理環(huán)境，能夠很好地模擬鉛在人體的生物學(xué)行為，此評價方法可以更方便、更準(zhǔn)確地評價食品中鉛的生物利用率及毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種人食品中鉛對人體的生物利用率及毒性的聯(lián)合評價模型。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0007]食品中鉛對人體的生物利用率及毒性的聯(lián)合評價模型，包括腸黏膜上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞以及由微孔膜分隔成頂側(cè)室和基底側(cè)室的容器，腸黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)在頂側(cè)室中，肝細(xì)胞培養(yǎng)在基底側(cè)室中。
[0008]所述頂側(cè)室為包含有微孔膜的TranswelI插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，基底側(cè)室為細(xì)胞培養(yǎng)板，Transwel I插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿安裝在細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中。
[0009]所述腸黏膜上皮細(xì)胞包括Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞，所述肝細(xì)胞為QSG7701肝細(xì)胞。
[0010]所述聯(lián)合評價模型的建立方法，包括如下步驟:
[0011](I)腸黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)
[0012]將Caco-2細(xì)胞與HT29-MTX細(xì)胞共培養(yǎng)于六孔板的Transwel I插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中，形成腸黏膜上皮細(xì)胞單層，
[0013](2)肝細(xì)胞培養(yǎng)
[0014]將QSG7701肝細(xì)胞培養(yǎng)在另一塊六孔培養(yǎng)板中，
[0015](3)聯(lián)合評價模型的建立
[0016]將載有Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞的Transwel I插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)QSG7701細(xì)胞的六孔板之上，即可。
[0017]所述步驟(I)具體為:
[0018]將Transwel I插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿放入六孔培養(yǎng)板中，Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞按9: I混合得到混合細(xì)胞懸液，將1.5ml密度為I X 15個/ml混合細(xì)胞懸液接種于Transwel I插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中，同時，在基底側(cè)室加入2mL含胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)液，其中胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為10%;再置于37°C、5%⑶2、相對濕度90%的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)18?21天，期間每天更換基底側(cè)室中的培養(yǎng)液，得到載有細(xì)胞跨膜電阻值大于等于250 Ω.cm2的腸黏膜上皮細(xì)胞的Transwel I插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿。
[0019]所述步驟(2)具體為:
[0020]取另一塊六孔培養(yǎng)板，每孔加入2ml細(xì)胞密度為1.5\105個/1^的0567701肝細(xì)胞液，采用含胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，其中胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為10%，然后置于37°C、5%⑶2、相對濕度90%的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3?5天，期間每天更換培養(yǎng)液，得載有QSG7701細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板。
[0021]—種利用所述聯(lián)合評價模型評價食品中鉛對人體的生物利用率及毒性的方法，包括如下步驟:
[0022](I)制備無菌食品待測液；
[0023](2)將無菌食品待測液加入到所述聯(lián)合評價模型的頂側(cè)室的腸黏膜上皮細(xì)胞上，將HBSS溶液作為轉(zhuǎn)運溶液加入到所述聯(lián)合評價模型的基底側(cè)室的肝細(xì)胞上，再將所述聯(lián)合評價模型放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0024](3)評價指標(biāo)
[0025]①.分別檢測腸黏膜上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和轉(zhuǎn)運溶液中的鉛含量，根據(jù)檢測結(jié)果評價待測食品中鉛對人體的生物利用率；
[0026]②.分別收集基底側(cè)室中肝細(xì)胞和轉(zhuǎn)運溶液樣品，檢測肝細(xì)胞和轉(zhuǎn)運溶液中乳酸脫氫酶活性，根據(jù)檢測結(jié)果評價待測定食品中鉛對肝細(xì)胞的毒性。
[0027]步驟(I)具體為:
[0028]取待測食品，磨碎，加入pHl.5的胃蛋白酶，在37°C恒溫水浴鍋中消化2h;然后加入PH5.0的胰酶和膽汁消化液，在37°C恒溫水浴鍋中消化2h;用固體NaHCO3調(diào)節(jié)消化液pH值為7.0?7.2，離心，收取上清液，上清液經(jīng)0.22μπι無菌濾膜過濾，獲取無菌食品待測液。
[0029]步驟(2)所述聯(lián)合細(xì)胞模型放入37°C、5 % CO2、相對濕度90 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
[0030]步驟(3)具體為:
[0031]①分別收集腸黏膜上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和轉(zhuǎn)運溶液的樣品，各個樣品分別經(jīng)過體積比為的4:1硝酸-雙氧水消解，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)分別檢測各個樣品中鉛含量，并通過下式計算鉛的生物利用率:
[0032]鉛的生物利用率(%)=(腸黏膜上皮細(xì)胞鉛含量+肝細(xì)胞鉛含量+轉(zhuǎn)運溶液鉛含量)/食品中鉛含量X 100%
[0033]②分別收集基底側(cè)室中肝細(xì)胞和轉(zhuǎn)運溶液樣品，每孔肝細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液lOOyL，于4°C靜置15min后離心lOmin，收集細(xì)胞裂解液，采用乳酸脫氫酶試劑盒分別測定細(xì)胞裂解液和轉(zhuǎn)運溶液中的乳酸脫氫酶活性，根據(jù)乳酸脫氫酶漏出率評價待測定食品中鉛對人體的毒性，乳酸脫氫酶漏出率的計算式如下:
[0034]乳酸脫氫酶漏出率=轉(zhuǎn)運溶液中乳酸脫氫酶活性/(轉(zhuǎn)運溶液中乳酸脫氫酶活性+細(xì)胞裂解液中乳酸脫氫酶活性)X 100%。
[0035]與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具備的有益效果:
[0036]本發(fā)明提供的人源性聯(lián)合細(xì)胞模型提供了類似人體內(nèi)的復(fù)雜微環(huán)境，能夠很好地模擬鉛在人體的生物學(xué)行為，既可以評價人體對食品中鉛的吸收效率，又可以靈敏高效評價食品中鉛的毒性，該模型可以廣泛用于食品中鉛的食用安全性評價。
【附圖說明】
[OO37 ]圖1為本發(fā)明所述的聯(lián)合評價模型的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中，I為TranSwe 11插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，2為細(xì)胞培養(yǎng)板，3為微孔膜，4為Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞，5為QSG7701細(xì)胞。
[0038]圖2是水稻、芥菜中鉛對人體的生物利用率。
[0039]圖3是水稻、芥菜中鉛對肝細(xì)胞的乳酸脫氫酶漏出率的影響。
【具體實施方式】
[0040]實施例1
[0041]就本發(fā)明測稻米、芥菜中鉛對人體的生物利用率及毒性的事例說明
[0042]1.試驗材料
[0043]1.1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。
[0044]1.2主要試劑和藥品
[0045]DMEM高糖完全培養(yǎng)基、HBSS、胎牛血清購自Gibco公司，
[0046]胰蛋白酶、膽汁、胃蛋白酶購自Sigma公司，
[0047]乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)
[0048]其余試劑均為國產(chǎn)分析純，
[0049]所用緩沖液為HBSS溶液，pH7.2?7.35。
[0050]1.4主要器材和儀器
[0051 ] 六孔培養(yǎng)板(Costar，美國)，Transwe 11插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿(聚酯膜，孔徑0.4μηι，Corning,美國)、Millicell-ERS跨膜電阻儀、超純水系統(tǒng)(Millipore，美國)，C02培養(yǎng)箱(三洋，日本)，ICP-MS(PE Nex1N 300X，美國)，倒置相差顯微鏡(Leica，德國)，微波消解儀(CEM MARS6，美國)，SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司),ALLEGRAX-15R臺式冷凍離心機(jī)(Beckman,美國)，MLS-3070高壓滅菌鍋(三洋，日本)，F(xiàn)E20K酸度計(mettlertoledo，瑞士)。
[0052]2.試驗方法
[0053]2.1腸黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)
[0054]2.1.1 Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞接種培養(yǎng)
[0055]將Transwel I插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿放入六孔培養(yǎng)板中，Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞按9: I混合得到混合細(xì)胞懸液，將1.5ml密度為I X 15個/ml混合細(xì)胞懸液接種于Transwel I插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中，同時，在基底側(cè)室加入2mL含胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)液，其中胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為10%;再置于37°C、5%⑶2、相對濕度90%的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)18?21天，期間每天更換基底側(cè)室中的培養(yǎng)液，得到載有細(xì)胞跨膜電阻值大于等于250 Ω.cm2的腸黏膜上皮細(xì)胞的T