胞之間發(fā)生分離，此時用移液器吸走消化液，棄掉，細胞仍然貼在細胞瓶壁上，用全功能培養(yǎng)基重懸，按照1: 2的比例進行傳代，具體的，將一瓶的細胞消化后的細胞懸液，分成2份，I份在原瓶，另一份放入新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，然后2瓶分別補加全功能培養(yǎng)基，分別定容到5mL。獲得傳代腦組織細胞系。
[0043]4.細胞凍存
[0044]選取傳代培養(yǎng)的鯽魚腦組織細胞系中，處于指數(shù)生長期，且細胞密度達到90%以上的傳代培養(yǎng)腦細胞。一般，培養(yǎng)3天可達到指數(shù)生長期，細胞密度通過顯微鏡觀察其生長密度來判斷，覆蓋細胞培養(yǎng)瓶瓶底的90 %即細胞密度達到90 %。
[0045]然后再加入0.25%胰蛋白酶和0.02 % EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到貼壁細胞變圓，細胞之間發(fā)生分離，此時用移液器吸走消化液，棄掉。用含有1%二甲基亞砜的胎牛血清，重懸細胞，將細胞懸液加入無菌凍存管中大約每管lmL，放入程序降溫盒，并置于-80°C超低溫冰箱，過夜，于次日將細胞轉(zhuǎn)移到液氮罐長期保存。
[0046]以上即獲得本例的鯽魚腦組織細胞系，將“4.細胞凍存”保存于液氮罐中的無菌凍存管取出，用干冰冷鏈寄送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC N0.C2015159。
[0047]5.細胞復(fù)蘇
[0048]自液氮中取出保存的凍存管，迅速置于37°C水浴中融化，1500r/min離心5min，棄上清，并加入ImL上述1.1中配制的全功能培養(yǎng)基重懸細胞，接種到25cm2培養(yǎng)瓶中，放置于培養(yǎng)箱中28 ± 0.2°C培養(yǎng)，備用。
[0049 ] 二、鯽魚腦組織細胞系的生態(tài)學(xué)檢測
[0050] 1.細胞形態(tài)觀察
[0051 ]取細胞復(fù)蘇后，指數(shù)生長期的鯽魚腦組織細胞，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。結(jié)果如圖1所示，觀察顯示，細胞呈單層貼壁細胞，形態(tài)似上皮樣鋪路石狀的星形膠質(zhì)細胞，細胞之間存在接觸抑制。
[0052]2.細胞生長情況
[0053]采用MTT法測定細胞的生長曲線，取生長狀況良好的80代細胞，棄去培養(yǎng)基，用2mL緩沖液D-Hank ’ s液(PH= 7.0)，清洗細胞，清洗完后，加入0.25 %胰蛋白酶和0.02 %EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到貼壁細胞變圓，細胞之間發(fā)生分離，此時用移液器吸走消化液，棄掉。加入全功能培養(yǎng)基，制成單細胞懸浮液，采用活細胞計數(shù)板計數(shù)，以I X 14個/mL均勻接種細胞于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加細胞懸液200yL，分別培養(yǎng)在15、20、25、28°C的培養(yǎng)箱中，每個溫度組設(shè)5個復(fù)孔，共接種4塊培養(yǎng)板。分別在連續(xù)孵育24小時、48小時、72小時、96小時、120小時、148小時和172小時后，測試細胞的生長情況。測試方法為，向孔中加入20yL濃度為0.5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng);快速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，棄去上清液，每孔加入150yL的二甲基亞砜(縮寫DMS0)，振蕩lOmin，使MTT藍紫色結(jié)晶完全溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm處檢測各孔的吸光值，S卩OD值，并以未接種細胞只加培養(yǎng)基孔的吸光值為空白對照調(diào)零，取5孔平均值。實驗重復(fù)3次，以培養(yǎng)“時間”為橫軸，“吸光值”為縱軸繪制細胞生長曲線。
[0054]測試結(jié)果如圖2所示，可見，本例的鯽魚腦組織細胞系在28°C培養(yǎng)條件下生長狀態(tài)最好，細胞在貼壁生長后，第I天生長較慢，第2天生長開始加快，進入對數(shù)生長期，持續(xù)3天左右進入平臺期。
[0055]3.細胞類型鑒定
[0056]取80代鯽魚腦組織細胞系，以IX 105/cm2密度接種于預(yù)先放置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，其中放置有全功能培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，棄掉全功能培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，然后加入4%的多聚甲醛固定15min，再用PBS沖洗，滴加2.5yL—抗，4°C孵育24h，PBS洗滌3次，再滴加2.5yL 二抗，25°C避光作用30min，PBS洗滌3次，然后采用熒光顯微鏡觀察。本例采用的熒光顯微鏡為Zeiss AX1 OBSERVER Al倒置熒光顯微鏡。本例中，一抗由Rabbit ant1-GFAP[ERP1034Y]ab68428溶于200yL的濃度為 1%的BSA制成，其中Rabbit anti_GFAP[ERP1034Y]ab68428購自abeam公司，BSA購自GIBCO公司。二抗為羊抗兔FITC-1gGjij自Sigma公司。
[0057]觀察結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示，有綠色熒光的表達，表明本例的鯽魚腦組織細胞系為星形膠質(zhì)細胞。
[0058]4.細胞周期分析
[0059]采用第80代的鯽魚腦組織細胞系進行細胞周期研究，將細胞轉(zhuǎn)至6孔板中，其中含有全功能培養(yǎng)基，培養(yǎng)約36h左右，此時細胞處于指數(shù)生長期，形成70 %?80 %的匯合層。棄去培養(yǎng)基，用2mL緩沖液D-Hank ’ s液(PH= 7.0)，清洗細胞，清洗完后，加入0.25 %胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到貼壁細胞變圓，細胞之間發(fā)生分離，此時用移液器吸走消化液，棄掉。加入全功能培養(yǎng)基，制成單細胞懸浮液;室溫下1000r/min離心5min，收集沉淀，用PBS洗2次，1000r/min離心5min，收集沉淀。先用20?50μ1/ηι1的杜氏磷酸鹽緩沖液(縮寫D-PBS)將細胞沉淀充分打散成單個細胞，用4°C預(yù)冷的70 %冰乙醇ImL重懸，4°C過夜，采用Cytomics FC 500Beckman Coulter型號的流式細胞儀進行細胞周期檢測。
[0060]檢測結(jié)果如圖4所示，可見，本例的鯽魚腦組織細胞系核型正常，為二倍體。測試結(jié)果顯示，鯽魚腦組織細胞系在Gl期的DNA含量占51.36%，在S期的DNA含量占32.62%，G2期為12.38%，G2/G1為1.91，表明鯽魚腦組織細胞系增殖活力旺盛，且為正常的二倍體細胞。
[0061]三、外源基因在鯽魚腦組織細胞系中的表達
[0062]采用L0NZA4D電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染方法，取80代鯽魚腦細胞星形膠質(zhì)細胞系，以IX 1 Vcm2密度接種于96孔板中，待細胞生長36h后，即貼壁穩(wěn)定生長，采用3中的傳代方法，在原細胞生長孔，將細胞消化制成細胞懸液，然后吸出放于L0NZA4D電轉(zhuǎn)儀專用電轉(zhuǎn)板條內(nèi)，每個孔對應(yīng)相應(yīng)的電轉(zhuǎn)板條孔，根據(jù)SE Cell Line 4D-Nucleofector X Kit)說明書，配置電轉(zhuǎn)液，試劑盒中soulut1n 16.4yL與supplement 3.6yL混合，制成電轉(zhuǎn)混合液，即每孔用量，將此混合液加入電轉(zhuǎn)板條中一個孔的細胞懸液中，每孔加入0.1yg GFP質(zhì)粒，采用EN-150電轉(zhuǎn)程序進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染完成后，將細胞懸液放入96孔板中，置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2?3天，然后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。
[0063]結(jié)果如圖5所示，可見，有30%的細胞表達較強的綠色熒光，說明外源基因可以在鯽魚腦組織細胞系中穩(wěn)定高效表達。
[0064]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本申請所作的進一步詳細說明，不能認定本申請的具體實施只局限于這些說明。對于本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本申請的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種鯽魚腦組織細胞系，其特征在于:所述鯽魚腦組織細胞系為鯽魚腦組織中分離的鯽魚腦組織細胞，所述鯽魚腦組織細胞系的保藏號為CCTCC N0.C2015159。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯽魚腦組織細胞系，其特征在于:所述鯽魚腦組織細胞為上皮樣的星形膠質(zhì)細胞。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鯽魚腦組織細胞系，其特征在于:所述鯽魚腦組織細胞系能穩(wěn)定連續(xù)傳代至少80代。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的鯽魚腦組織細胞系在鯽魚病毒的培養(yǎng)和/或檢測中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的鯽魚腦組織細胞系作為研究水產(chǎn)動物病毒的宿主細胞的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的鯽魚腦組織細胞系在水產(chǎn)動物病毒的分離中的應(yīng)用。
【專利摘要】本申請公開了一種鯽魚腦組織細胞系及其應(yīng)用。本申請的鯽魚腦組織細胞系，為鯽魚腦組織中分離的鯽魚腦組織細胞，鯽魚腦組織細胞系的保藏號為CCTCC？No.C2015159。本申請的鯽魚腦組織細胞系，填補了鯽魚腦組織細胞系研究的空白，為感染鯽魚的病毒提供了一種新的研究工具，特別是為以鯽魚腦組織為靶器官的病毒的深入研究奠定了基礎(chǔ)。CCTCC No.C201515920150923
【IPC分類】C12R1/91, C12N5/071, C12Q1/70, C12N7/00
【公開號】CN105543162
【申請?zhí)枴緾N201510852727
【發(fā)明人】王津津, 賈鵬, 劉瑩, 于力, 何俊強, 鄭曉聰, 阮周曦, 秦智峰, 史秀杰, 蘭文升, 劉葒
【申請人】深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年11月27日