一種檢測hUCMSCs增殖能力及其臨床應(yīng)用價(jià)值的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)生物檢測領(lǐng)域，具體是一種適用于檢測hUCMSCs增殖能力，并W此 判定hUCMSCs是否具有臨床應(yīng)用價(jià)值的試劑盒和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚 層，是干細(xì)胞家族的重要成員。其中人廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUCMSCs)是存在于廝帶中的一種MSCs,引其具有取材方便，易于 采集和運(yùn)輸，生物學(xué)特性穩(wěn)定，免疫原性低，無異體排斥反應(yīng)，避免了倫理爭議，細(xì)胞數(shù)量多 等優(yōu)點(diǎn)。在干細(xì)胞治療領(lǐng)域的應(yīng)用中備受關(guān)注。研究人員發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs可誘導(dǎo)為多種功能 性組織細(xì)胞，可用于治療腦擁、脊髓損傷、老年癡呆、多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病、I型糖尿 病等疾病的治療。目前，hUCMSCs在臨床疾病治療中的應(yīng)用價(jià)值已被廣泛認(rèn)可，且已通過PAD 認(rèn)證。研究發(fā)現(xiàn)，早期hUCMSCs細(xì)胞生物學(xué)活性良好，臨床應(yīng)用價(jià)值高，晚期細(xì)胞增殖活性顯 著降低，臨床應(yīng)用價(jià)值明顯降低。參閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前尚沒有通過特定指標(biāo)衡量hUCMSCs的 可用性。
[0003] 小核仁RNA(small nucleolus RNAs，snoRNAs)是一類發(fā)現(xiàn)較早且位于核仁內(nèi)的小 非編碼RNA。snoRNAs對(duì)rRNA的化學(xué)修飾作用是其進(jìn)本功能。另外，有研究表明snoRNAs與一 些遺傳疾病W及腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)。
[0004] 研究發(fā)現(xiàn)，部分snoRNA對(duì)細(xì)胞的增殖具有調(diào)控作用，運(yùn)里，本發(fā)明人在前期工作發(fā) 現(xiàn)隨hUCMSCs代數(shù)增加、細(xì)胞增殖減慢，活性降低，snoRA7A的表達(dá)量呈下降趨勢，且在 hUCMSCs培養(yǎng)值第7代后，snoRNA呈顯著下降趨勢。而此后hUCMSCs生物學(xué)活性差，臨床應(yīng)用 價(jià)值低，不被選擇應(yīng)用于臨床治療。（參見文獻(xiàn)（l)Pacilli，A.，Ceccarelli，C.，Trere，D.，& Montanaro,L..SnoRNA USOlevels are regulated by cell proliferation and rRNA transcription.Int J Mol Sci,2013,14(7)：14923-14935.)〇
[0005] 目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)snoRA7A用于衡量hUCMSCs增殖能力W及評(píng)估hUCMSCs是否 具有臨床應(yīng)用價(jià)值的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的首要目的是解決上述技術(shù)問題和指標(biāo)問題，提出一種檢測hUCMSCs增殖 能力，判定其臨床應(yīng)用價(jià)值的小分子RNA(snoRNA)標(biāo)志物。
[0007] 為解決上述技術(shù)及指標(biāo)問題，本發(fā)明對(duì)多批次培養(yǎng)的不同代數(shù)hUCMSCs增殖能力 進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)在所有培養(yǎng)批次的hUCMSCs細(xì)胞中，隨hUCMSCs代數(shù)增加，snoRA7A表 達(dá)量呈下降趨勢，且第6代到第7代表達(dá)量下降明顯。
[000引本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測hUCMSCs增殖能力，判定其臨床應(yīng)用價(jià)值的小 分子 RNA(snoRNA)標(biāo)志物：snoRA7A。
[0009]所述的snoRA7A，GenBa址 accession numbe;r:AJ609430,具體序列如下：
[0010] GACCTCCTGGGATCGCATCTGGAGAGTGCCTAGTATTCTGCCAGCTTCGGAAAGGGAGGGAAAGCAAGCCTGGCAGA GGCACCCATTCCATTCCCAGCTTGCTCCGTAGCTGGCGATTGGAAGACACTCTGCGACAGTG(SEQ ID NO:1)〇 [00川本發(fā)明的第二方面，提供了上述標(biāo)志物snoRNA在制備hUCMSCs增殖能力檢測試劑 或試劑盒中的應(yīng)用。
[0012] 所述的檢測試劑或試劑盒檢測hUCMSCs內(nèi)snoRA7A的表達(dá)水平。
[0013] 所述的檢測試劑或試劑盒包括:對(duì)snoRA7A具有檢測特異性的探針、基因忍片，或 PCR引物。
[0014] 優(yōu)選的，所述的檢測試劑或試劑盒為采用Real-time RT-PCR(qPCR)方法檢測 snoRA7A表達(dá)量的試劑或試劑盒。
[0015] 優(yōu)選的，所述的對(duì)snoRA7A具有檢測特異性的PCR引物的核巧酸序列分別如SEQ ID ^:2、569 10^:3所示。
[0016] 本發(fā)明的第Ξ方面，提供一種檢測hUCMSCs增殖能力及其臨床應(yīng)用價(jià)值的試劑盒， 所述的試劑盒中包括用于檢測snoRA7A表達(dá)量的試劑。
[0017] 優(yōu)選的，所述的試劑為采用Real-time RT-PCR(qPCR)方法檢測snoRA7A表達(dá)量的 試劑。
[0018] 優(yōu)選的，所述的試劑盒中含有兩組引物，分別為：
[0019] snoRA7A的引物：
[0020] P1:CATTCCCAGCTTGCTCCGTA(SEQ ID N0:2)
[0021] P2:ACTGTCGCAGAGTGTCTTCC(SEQ ID N0:3)〇
[0022] GAPDH引物：
[0023] P1：CTTGGGCTACACTGAGGACC(SEQ ID NO:4)
[0024] P2:CATACCAGGAAATGAGCTTGAC(沈Q ID N0:5)
[0025] 本發(fā)明的第四方面，提供一種檢測hUCMSCs增殖能力及其臨床應(yīng)用價(jià)值的方法，通 過檢測hUCMSCs內(nèi)snoRA7A的表達(dá)水平鑒定hUCMSCs增殖能力，判定hUCMSCs臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0026] 本發(fā)明還提供了用于衡量hUCMSCs增殖能力及臨床可用性的snoRA7A表達(dá)量的參 考值 ACT-snoRA7A:
[0027] Δ Ct-snoRA7A = Ct-snoRA7A-Ct-GAP畑
[0028] 本發(fā)明通過檢測Δ Ct-snoRA7A的水平，用W鑒定hUCMSCs增殖能力，判定hUCMSCs 實(shí)際應(yīng)用價(jià)值:若Δ Ct-snoRA7A為8 W下則表示細(xì)胞活性高，臨床可用價(jià)值高。
[0029] 本發(fā)明的第五方面，提供檢測snoRA7A表達(dá)水平的試劑在制備hUCMSCs增殖能力檢 測試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明的第六方面，提供序列SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、N0.4、N0.5所示引物的 用途，用于制備hUCMSCs增殖能力檢測試劑或試劑盒。
[0031] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0032] 1、首次發(fā)現(xiàn)了對(duì)增殖能力具有較高鑒定價(jià)值的生物標(biāo)志物snoRA7A，通過細(xì)胞增 殖能力檢測試劑盒的研制和應(yīng)用，可W更便捷、更準(zhǔn)確評(píng)價(jià)hUCMSCs增殖能力及臨床可用 性；
[0033] 2、本發(fā)明將人廝帶間充質(zhì)干細(xì)中snoRA7A的表達(dá)量進(jìn)行了量化，通過多次檢測證 實(shí)了該檢測指標(biāo)可用于檢測細(xì)胞增殖能力從而判定其臨床應(yīng)用價(jià)值。該發(fā)現(xiàn)為huMSC體外 培養(yǎng)傳代過程中細(xì)胞增殖能力的檢測及其細(xì)胞臨床可用性評(píng)定提供了方便快捷的檢測方 法。
【附圖說明】
[0034] 圖1為不同代數(shù)hUCMSCs倍增時(shí)間。
[0035] 圖2為不同代數(shù)hUCMSCs中snoRA7 A表達(dá)量變化。
[0036] 圖3為不同代數(shù)hUCMSCs中snoRA7A的具體Δ CT值。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0038] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻(xiàn)方法制備。下列實(shí)施例中未注明具 體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室指南KNew ￥〇'4:〔〇1(1591'；[]1旨化1'13〇1'1^日13〇^1:〇巧？'633，1989)中所述的條件，或按照常規(guī)條件，或 按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] -、研究方法
[0041] 1.細(xì)胞倍增時(shí)間試驗(yàn)
[0042] ① T25培養(yǎng)瓶常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至細(xì)胞密度達(dá)80% ,0.25%膜酶消化為單胞，用含血清 培養(yǎng)基3ml中和膜酶作用，制成單細(xì)胞懸液。
[0043] ②取1 Ou 1放入細(xì)胞計(jì)數(shù)儀中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0044] ③取5 X 103個(gè)細(xì)胞于10cm2培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80 %后依照上述方法 消化為單細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)(細(xì)胞數(shù)為N)，同時(shí)記錄細(xì)胞培養(yǎng)總時(shí)間(T)。
[0045] ④化= N/(5X 103)計(jì)算得η(細(xì)胞增殖倍數(shù)）
[0046] ⑤倍增時(shí)間（t) = Τ/η
[0047] 2.使用miRcute miRNA Isolation KitmiRcute miRNA提取分離試劑盒提取富集 細(xì)胞內(nèi)20~200nt RNA。
[004引具體操作過程如下：
[0049] ①直接在培養(yǎng)板中加入裂解液MZ裂解細(xì)胞，每10cm2面積加1ml MZ。用取樣器抽打 幾次。
[0050] (注意:裂解液MZ的加入量根據(jù)培養(yǎng)瓶面積決定，不是由細(xì)胞數(shù)決定。如果加量不 足，可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染。另注：也可制備細(xì)胞懸液：離屯、2，100rpm( 400 X g) 5min取細(xì)胞，棄上清。加入1ml裂解液MZ，振蕩器振蕩或移液器吸打數(shù)次混勻。加裂解液MZ前 不要洗涂細(xì)胞，免降解m