一株延緩衰老的植物乳桿菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及新的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株 及其益生功能，尤其是用于清除自由基和延緩衰老的功能。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道菌群作為虛擬"器官"，影響著人體的發(fā)育生長、營養(yǎng)與健康，甚至其與代謝性 疾病(腸易激綜合癥，炎癥性腸病，心血管疾病，糖尿病，肥胖等)密切相關(guān)，腸道菌群與人體 健康乃至長壽的關(guān)聯(lián)性。
[0003] 湖南省瀏陽市高田村地理位置相對(duì)封閉，其村民不僅長壽，而且普遍沒有慢性疾 病。與此形成鮮明對(duì)比的是，周邊地區(qū)既無長壽現(xiàn)象，而且心血管疾病，慢性腸胃炎和癌癥 等疾病時(shí)有發(fā)生。
[0004] 乳酸菌可調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道菌群平衡，提高機(jī)體免疫力降低血清膽固醇，降血壓，抗 氧化抑制腫瘤發(fā)生等方面的特殊生理活性。長雙歧桿菌BBMN68分離自廣西巴馬長壽老人糞 便，其活菌液對(duì)便秘模型小鼠有潤腸通便作用，提高免疫力。唾液乳桿菌FDB86可以緩解二 甲肼對(duì)腸道菌群的不良影響，使腸道菌群趨近于正常狀態(tài)，對(duì)結(jié)腸癌大鼠腸道菌群變化的 調(diào)節(jié)作用。另外生物氧化是機(jī)體新陳代謝的重要生理過程，但此過程中會(huì)產(chǎn)生多種自由基， 自由基的累積，會(huì)照成體內(nèi)氧化損傷逐漸增多，導(dǎo)致老年慢性病發(fā)生，而清除過多的自由基 可以延緩衰老。
[0005] 目前為止，沒有報(bào)道來源于長壽老人腸道的植物乳桿菌物種的菌株，具有對(duì)自由 基的清除作用及延緩衰老的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 現(xiàn)在，本發(fā)明人鑒定了 一種新的植物乳桿菌ZDY03菌株，是一類厭氧，不產(chǎn)孢子的 革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀，在MRS瓊脂平板培養(yǎng)基中呈乳白色，圓形，光滑的菌落。植物 乳桿菌ZDY03可以在MRS肉湯培養(yǎng)基上生長，是革蘭氏陽性菌。
[0007] 植物乳桿菌ZDY03對(duì)0.4%H2〇2有較高的耐受能力，在8h后，Δ 〇D>0.9，具有極強(qiáng)的 耐受性，清除自由基(DPPH、羥基自由基、超氧陰離子等)的能力表現(xiàn)優(yōu)秀。
[0008] ZDY03還可以提高衰老小鼠的血清和肝臟中抗氧化酶活性，降低血清和肝臟中有 害代謝產(chǎn)物(如:丙二醛)的含量，延緩小鼠的衰老癥狀。
[0009] 菌株對(duì)模擬胃液和模擬腸液有較好的耐受性。
[0010] 本發(fā)明的植物乳桿菌ZDY03作為益生菌，不僅具有極強(qiáng)的清除自由基能力，且有良 好的耐膽鹽性，能緩解D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠的不良癥狀，延長自然衰老小鼠壽命，促進(jìn)宿主健 康。是一株性能優(yōu)良的菌種。因此具有很高的研究價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。
[00?1 ] 本發(fā)明植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株ZDY03，于2015年9月30日保 藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（中國武漢武漢大學(xué)），編號(hào):CCTCC NO:M 2015589。
[0012] 一種微生物菌劑，含有權(quán)利要求1所述植物乳桿菌菌株ZDY03。
[0013]包含所述的植物乳桿菌的乳制品、疏采制品及飲料制品。
[0014] -種組合物，包括所述的植物乳桿菌菌株，或通過所述的方法所獲得的微生物菌 劑，或通過所述的方法獲得的乳制品、蔬菜制品及飲料制品。
[0015] 所述的組合物是食品，保健品或護(hù)膚品。
[0016] 本發(fā)明所述植物乳桿菌可用于制作治療和預(yù)防腸道疾病的組合物成分，還可以用 于食品和飼料的添加劑。
【附圖說明】
[0017] 圖1植物乳桿菌ZDY03發(fā)酵上清液，菌株和酸奶對(duì)DPPH的清除能力 [0018]圖2植物乳桿菌ZDY03發(fā)酵上清液，菌株和酸奶對(duì)羥基自由基的清除能力 [0019]圖3植物乳桿菌ZDY03發(fā)酵上清液，菌株和酸奶對(duì)超氧陰離子的清除能力 [0020]圖4植物乳桿菌ZDY03發(fā)酵上清液，菌株和酸奶的總還原力評(píng)價(jià)
[0021]圖5植物乳桿菌ZDY03對(duì)模擬胃液的耐受性
[0022]圖6植物乳桿菌ZDY03對(duì)模擬腸液的耐受性
[0023]圖7植物乳桿菌ZDY03對(duì)腸上皮細(xì)胞HT-29的基因表達(dá)的影響
[0024]圖8植物乳桿菌ZDY03對(duì)D-半乳糖小鼠血清中抗氧化酶和丙二醛(MDA)的影響
[0025]圖9植物乳桿菌ZDY03對(duì)D-半乳糖小鼠肝臟中抗氧化酶和丙二醛(MDA)的影響
[0026]圖10植物乳桿菌ZDY03對(duì)D-半乳糖小鼠小腸基因表達(dá)的影響
[0027]圖11植物乳桿菌ZDY03對(duì)衰老小鼠壽命的影響
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下結(jié)合實(shí)例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而本發(fā)明的應(yīng) 用范圍不能以任何方式由這些實(shí)施例所限制。
[0029]實(shí)施例1:植物乳桿菌ZDY03的分離與鑒定
[0030]植物乳桿菌ZDY03是從健康長壽老人的糞便(取樣地:湖南省瀏陽市高田村）中分 離。取1 g奠便溶于1 OmLl0%蛋白胨溶液中，充分溶解，濾紙濾去殘?jiān)?，濾液用5000rmp離心 lOmin，棄去上清，收集沉淀，用lmLIO%蛋白胨水重懸。按1 %接種到MRS液體培養(yǎng)基中，過夜 培養(yǎng)。培養(yǎng)液采用10倍梯度稀釋，梯度稀釋為1〇<、1(^2、1(^ 3、1(^4、1(^5、1(^6、1(^7、1(^ 8和1〇 <，每個(gè)梯度取lmL分別均勻涂布于MRS肉湯的瓊脂平板上，37°C厭氧培養(yǎng)48h。挑取單菌落， 在平板上劃線分離，反復(fù)進(jìn)行純化培養(yǎng)，用革蘭氏染色法觀察菌落形態(tài)選出革蘭氏陽性菌。 將分離得到的菌株液體培養(yǎng)后，平板培養(yǎng)，用接種環(huán)挑取單一的菌落作為模板，進(jìn)行菌落 PCR。將陽性PCR產(chǎn)物送至公司測(cè)序。
[0031] 將所分離菌菌株的16S rRNA堿基序列分析測(cè)序堿基序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與數(shù) 據(jù)庫里的植物乳桿菌序列一致(該堿基序列見序列表），并保存于武漢市中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏號(hào)為CCTCC N0:M 2015589。
[0032] 本發(fā)明植物乳桿菌ZDY03菌株，是一類厭氧，不產(chǎn)孢子的革蘭氏陽性菌，菌體呈短 桿狀，在MRS瓊脂平板培養(yǎng)基中呈乳白色，圓形，光滑的菌落。植物乳桿菌ZDY03可以在MRS肉 湯培養(yǎng)基上生長，是革蘭氏陽性菌。
[0033]實(shí)施例2:菌株對(duì)氧脅迫的耐受性
[0034] 將新鮮培養(yǎng)的菌株以1%的比例接種到含0.4mmol/L H2〇2的MRS液體培養(yǎng)基中，37 °(3厭氧培養(yǎng)8h，分別測(cè)定Oh與8h的0D63Q，檢測(cè)菌株對(duì)H2〇2的耐受性。
[0035]結(jié)果表明：A〇D>0.9,具有極強(qiáng)的耐受性。
[0036]實(shí)施例3:菌株和發(fā)酵上清液清除DPPH自由基能力
[0037] 按照接種量為1%接入MRS培養(yǎng)基中，厭氧37°C培養(yǎng)18h，6000r/min離心10min，分 別收集發(fā)酵上清液和菌體。菌體用PBS(pH7.2)溶液洗滌2次，再用PBS溶液重懸至乳酸菌數(shù) 為109cf u/mL。發(fā)酵上清和重懸的菌體作為清除自由基試驗(yàn)的樣品。
[0038] 2mL樣品中加入2mL DPPH無水乙醇溶液（0.2mmo 1 /L)混合均勻，室溫避光反應(yīng) 30min，6000r/min離心10min，取上清液于517nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)i;空白組以等體積無水乙 醇代替DPPH無水乙醇溶液A。，對(duì)照組以等體積空白溶劑代替樣品溶液Aj，并以等體積蒸餾水 和乙醇混合液空白調(diào)零。清除率（％ ) = lOO-Ui-AcO/Aj X 100
[0039] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
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