專利名稱：表達(dá)巢蛋白的毛囊干細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及毛嚢干細(xì)胞及其用途。明確地說(shuō)，本發(fā)明涉及表達(dá)巢蛋白 (nestin)的毛嚢干細(xì)胞、分離該干細(xì)胞的方法以及使用該干細(xì)胞治療疾病或 障礙的方法。
背景技術(shù)：
盡管干細(xì)胞治療的重要性已得到公認(rèn)，但由于使用胚胎干細(xì)胞做這樣 的治療，對(duì)干細(xì)胞治療法一直存有爭(zhēng)議。另外，來(lái)源于諸如骨髓的干細(xì)胞 較難獲得。如果有一種易于獲得的成年干細(xì)胞，其能夠提供與那些更有爭(zhēng) 議的以及更不易獲得的干細(xì)胞同樣的好處，對(duì)這個(gè)領(lǐng)域?qū)⑹呛苡幸娴?。?發(fā)明通過(guò)發(fā)現(xiàn)來(lái)自哺乳動(dòng)物毛嚢的干細(xì)胞，討論了這一需求。涉及毛發(fā)的 一個(gè)簡(jiǎn)要背景為本發(fā)明中的毛嚢干細(xì)胞提供了基礎(chǔ)。毛發(fā)生長(zhǎng)是一種獨(dú)特的循環(huán)再生現(xiàn)象。在哺乳動(dòng)物的整個(gè)一生中，毛 嚢不斷重復(fù)著生長(zhǎng)(毛發(fā)生長(zhǎng)期)、衰退(過(guò)渡期)以及休眠(毛發(fā)生長(zhǎng)終期)的 循環(huán)。毛嚢干細(xì)胞的位置和功能是理解毛發(fā)生長(zhǎng)的生物學(xué)和病理學(xué)的關(guān)鍵 (Oshima, H.等，Cell (2001) 104: 233-245)。標(biāo)記滯留細(xì)胞是干細(xì)胞的特征之 一 ，有人發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞位于毛嚢的永久性上部(permanent upper portion),即 所謂毛嚢膨出區(qū)(bulge area)(Cotsarelis, G.等，Cell (1990) 61: 1329-1337)。Taylor， G.等(Cell (2000) 102: 451-461)最近報(bào)道，毛嚢膨出區(qū)干細(xì)胞很 可能是雙能性的(bipotent),因?yàn)樗鼈儾粌H可以使毛嚢發(fā)生，還可以使表皮 發(fā)生。其它實(shí)驗(yàn)(Oshima等，(前述))也提供新證據(jù)證明，成年小鼠觸須嚢的外根鞘上部包含多能干細(xì)胞，它們可分化成毛嚢基質(zhì)細(xì)胞、脂肪腺基底細(xì)
胞和表皮。最近，Toma，J. G.等(Nature Cell Biology (2001) 3:778-784)報(bào)道， 從哺乳動(dòng)物真皮分離到的，稱作皮膚衍生的前體(SKP)的成年多能干細(xì)胞， 能夠在培養(yǎng)中增殖并分化，產(chǎn)生神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì) 胞。但是，這些干細(xì)胞在皮膚中的精確定位及其功能尚不清楚。
從毛發(fā)中分離到與神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)的干細(xì)胞，對(duì)本領(lǐng)域?qū)⑹呛苡杏玫摹?本發(fā)明確立了毛囊干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的相關(guān)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及分離的毛嚢干細(xì)胞以及從所述細(xì)胞分化得到的細(xì)胞。優(yōu)選， 所述細(xì)胞是基于標(biāo)記(如巢蛋白)而分離得到的，更優(yōu)選，巢蛋白連接于綠色 熒光蛋白。
本發(fā)明的另 一方面涉及一種分離毛嚢干細(xì)胞的方法，包括提供來(lái)自哺 乳動(dòng)物的含有毛嚢的皮膚，以及從中分離毛囊干細(xì)胞。優(yōu)選，該皮膚是毛 發(fā)生長(zhǎng)終期的皮膚。
本發(fā)明的另 一方面，分離到的毛嚢干細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)以產(chǎn) 生分化的細(xì)胞。在優(yōu)選的'實(shí)施方案中，該培養(yǎng)基包括FBS、 BDNF、 PDGF 或CNTF。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，分化的細(xì)胞是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、 平滑肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。
本發(fā)明的另 一 方面'涉及 一 種治療疾病的方法，優(yōu)選神經(jīng)性疾病或退化 性疾病，包括將干細(xì)胞或由其分化來(lái)的細(xì)胞移植入表現(xiàn)該疾病的哺乳動(dòng)物。 所述細(xì)胞既可以是自體固有的也可以是異源的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 細(xì)胞是通過(guò)系統(tǒng)注射方式移植到哺乳動(dòng)物中的，在另一個(gè)方案中是通過(guò)直 接將所述細(xì)胞注射進(jìn)哺乳動(dòng)物的器官。優(yōu)選的器官或組織是腦、肝或心血 管組織。優(yōu)選疾病為阿爾茨海默氏病(Alzheimer's)、帕金森氏病(Parkinson's)、 與年齡相關(guān)的記憶力減退、毛發(fā)脫落、燒傷、皮膚老化以及皮膚置換(skin repkc6msnt)。
更具體地，本發(fā)明涉及如下方面
第1項(xiàng).分離的毛嚢干細(xì)胞。
第2項(xiàng).第1項(xiàng)的分離的毛嚢干細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)巢蛋白。 第3項(xiàng).分離第1項(xiàng)所述毛嚢干細(xì)胞的方法，包括從含有毛嚢的皮膚 分離毛嚢干細(xì)胞。第4項(xiàng).第3項(xiàng)的分離毛嚢干細(xì)胞的方法，其中的皮膚被切取；且分
離步驟進(jìn)一步包括從毛嚢中分離巢蛋白表達(dá)細(xì)胞，從而分離毛嚢干細(xì)胞。 第5項(xiàng).第3項(xiàng)的方法，其中的皮膚是毛發(fā)生長(zhǎng)終期的皮膚。 第6項(xiàng)，第3項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該毛嚢干細(xì)胞，
以便產(chǎn)生分化的細(xì)胞。
第7項(xiàng).第3項(xiàng)的方法，其中的培養(yǎng)基包含F(xiàn)BS、BDNF、PDGF或CNTF。 第8項(xiàng).第6項(xiàng)的方法，其中分化的細(xì)胞是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、
平滑肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。
第9項(xiàng).第4項(xiàng)的方法，其中的巢蛋白與綠色熒光蛋白相連。 第IO項(xiàng). 一種治療疾病的方法，包括將第1項(xiàng)的干細(xì)胞或由其分化所
得的細(xì)胞移植入表現(xiàn)該疾病的哺乳動(dòng)物中。
第ll項(xiàng).第10項(xiàng)的方法，其中的疾病是神經(jīng)性或退化性疾病。
第12項(xiàng).第IO項(xiàng)的方法，其中的移植步驟進(jìn)一步包括將干細(xì)胞通過(guò)
系統(tǒng)性注射方式注射到哺乳動(dòng)物中。
第13項(xiàng).第IO項(xiàng)的方法，其中的移植步驟進(jìn)一步包括直接將細(xì)胞注
入哺乳動(dòng)物的器官或組織中。
第14項(xiàng).第13項(xiàng)的方法，其中的器官或組織是腦、肝或心血管組織。 第15項(xiàng).第IO項(xiàng)的方法，其中的疾病選自阿爾茨海默氏病、帕金森
氏病、與年齡相關(guān)的記憶力減退、脫發(fā)、燒傷、皮膚老化以及皮膚替換。 第16項(xiàng).第10項(xiàng)的方法，其中的干細(xì)胞是自體細(xì)胞。 第17項(xiàng).第10項(xiàng)的方法，其中的干細(xì)胞是異源細(xì)胞。 第18項(xiàng).分化的細(xì)胞，其是從第1項(xiàng)的毛嚢干細(xì)胞分離得到的。 第19項(xiàng).第18項(xiàng)的分化細(xì)胞，它是在體外分化的。 第20項(xiàng).包含第1項(xiàng)所述分離的細(xì)胞的組合物在制備治療疾病的組合
物中的用途，所述疾病是可以通過(guò)在包含將所述細(xì)胞施用到表現(xiàn)該疾病的
受試者的方法中因產(chǎn)生分化的細(xì)胞而獲益的疾病。
第21項(xiàng).分離的毛嚢干細(xì)胞，其在生長(zhǎng)周期階段中的毛發(fā)生長(zhǎng)終期從
哺乳動(dòng)物永久性上部毛嚢緊靠脂肪腺下方的毛嚢膨出區(qū)獲得，并且所述細(xì)
胞表達(dá)巢蛋白，并且所述細(xì)胞當(dāng)培養(yǎng)在包含F(xiàn)BS、 BDNF、 PDGF或CNTF
的培養(yǎng)基中時(shí)，分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。 第22項(xiàng).通過(guò)培養(yǎng)第21項(xiàng)的細(xì)胞制備的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。第23項(xiàng).包含第21項(xiàng)所述的細(xì)胞的組合物在制備治療疾病的組合物 中的用途，所述疾病是可以通過(guò)在包含將所述細(xì)胞施用到表現(xiàn)該疾病的受 試者的方法中因產(chǎn)生分化的細(xì)胞而獲益的疾病。第24項(xiàng).包含第22項(xiàng)所述神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或脂將所述神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞移入所述受試者而 獲益的疾病。


圖la-d:在巢蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚的毛發(fā)生長(zhǎng)終期的毛嚢巢蛋白 -GFP表達(dá)細(xì)胞。皮膚樣品是從巢蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠背部皮膚切下來(lái)后， 馬上新鮮制備的。皮膚樣品從皮下組織切出后使真皮側(cè)朝上，用熒光顯微 鏡或共聚焦顯微鏡直接觀察。(a、 b和c)是熒光顯微鏡圖像。(d)是共聚焦顯 微鏡圖像。注意獨(dú)特的鐘型結(jié)構(gòu)以及毛嚢巢蛋白-GFP表達(dá)細(xì)胞(白箭頭)在 每一個(gè)毛嚢中的位置。毛嚢巢蛋白-GFP表達(dá)細(xì)胞嚴(yán)格定位在緊靠脂肪腺(圖 la,白色虛線畫(huà)出)的下方，與已定位的毛嚢干細(xì)胞相同，該區(qū)域被稱作毛 嚢膨出區(qū)。注意在毛嚢中的巢蛋白-GFP表達(dá)細(xì)胞，互相之間是通過(guò)表達(dá)巢 蛋白-GFP的神經(jīng)樣細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(灰箭頭)相連。放大倍數(shù)a 100X、 b和c 200X、 d 400X。圖2:毛嚢干細(xì)胞形成新生毛嚢。在毛發(fā)生長(zhǎng)終期的GFP表達(dá)型毛嚢 干細(xì)胞(白箭頭)。GFP毛嚢干細(xì)胞形成毛發(fā)生長(zhǎng)期早期的新毛嚢(灰箭頭)。 原物;改大400x。圖3a-g:共聚焦圖像顯示，新毛嚢從膨出區(qū)的巢蛋白-GFP表達(dá)細(xì)胞長(zhǎng) 出，并在毛發(fā)循環(huán)發(fā)育。毛發(fā)生長(zhǎng)期毛嚢通過(guò)脫發(fā)作用引入，脫發(fā)是通過(guò) 在6-7周齡C57B16巢蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠背部皮膚上用熱蠟造成，該小的樣品，顯示僅有膨出區(qū)巢蛋白-GFP細(xì)胞定位于該膨出區(qū)。(b)是脫發(fā)后第 2天的樣品。注意具有巢蛋白-GFP表達(dá)的新毛嚢芽剛剛直接從膨出區(qū)巢蛋 白-GFP干細(xì)胞形成。(c和d)是脫發(fā)后第4和第5天的樣品，顯示出毛發(fā)生 長(zhǎng)期早期的毛嚢。注意新毛嚢持續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)育，伴隨著巢蛋白-GFP的表達(dá)。 (e)是脫發(fā)后第8天的樣品，顯示出毛發(fā)生長(zhǎng)期中期的毛嚢。注意在外根鞘上部完全形成毛嚢并有巢蛋白-GFP表達(dá)，在毛嚢球部(bulb)無(wú)巢蛋白-GFP 表達(dá)。(f和g)是脫發(fā)后第19-20天的樣品，顯示過(guò)渡期的毛嚢。注意毛嚢已 經(jīng)退化并回復(fù)至毛發(fā)膨出狀態(tài)。共聚焦顯微鏡。放大倍數(shù)(a， b, c和d)400X， (e和f) 100X， (g)200x。圖4:通過(guò)免疫組化染色確定的，GFP、巢蛋白和角蛋白5/8和15在 毛嚢膨出區(qū)干細(xì)胞以及外根鞘細(xì)胞中的共定位。(a)是活組織的共聚焦圖像， 顯示出表達(dá)巢蛋白-GFPd的毛嚢膨出區(qū)干細(xì)胞(灰箭頭)，其形成了新毛嚢(白 箭頭)。(b)是石蠟包埋的組織切片，用巢蛋白抗體(1:100)進(jìn)行免疫組化染色， 其展現(xiàn)了巢蛋白表達(dá)的準(zhǔn)確模式，如同(a)中的巢蛋白-GFP表達(dá)?；壹^指 示巢蛋白陽(yáng)性毛嚢膨出區(qū)干細(xì)胞。白箭頭指示新形成的巢蛋白陽(yáng)性毛嚢。(c) 和(d)是巢蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚毛嚢的兩個(gè)系列縱向石蠟切片，用GFP mAb( 1:1 OO)和角蛋白-15 mAb( 1:1 OO)進(jìn)行雙免疫組化染色。GFP用色素原固 紅檢測(cè)，角蛋白-15用色素原DAB檢測(cè)。注意巢蛋白-GFP和角蛋白-15在 膨出區(qū)毛嚢干細(xì)胞中的定位。(e, f和g)是巢蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚毛嚢 的系列橫向石蠟切片，分別用GFPmAb(e， 1:100)、角蛋白5/8 mAb(f, 1:100) 和巢蛋白mAb(g， 1:100)進(jìn)行免疫組化染色。注意GFP、角蛋白5/8和巢蛋 白在毛嚢外根鞘細(xì)胞中的共定位。放大倍數(shù)400x。圖5:毛嚢中表達(dá)巢蛋白-GFP的干細(xì)胞和毛嚢間的神經(jīng)樣細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。 來(lái)自巢蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚的毛發(fā)生長(zhǎng)終期毛嚢，顯示表達(dá)GFP的干 細(xì)胞。注意毛嚢膨出區(qū)中正處在脂肪腺下方的干細(xì)胞的獨(dú)特結(jié)構(gòu)(白箭頭)。 這些嚢與表達(dá)GFP的神經(jīng)樣細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)(灰箭頭)相連。原物放大100x。圖6:從毛嚢分離的巢蛋白-GFP表達(dá)細(xì)胞在體外產(chǎn)生多種細(xì)胞類型。 (a)從毛嚢的表達(dá)巢蛋白-GFP的細(xì)胞中生長(zhǎng)出來(lái)的神經(jīng)球。(b)在包被的板子 上鋪板兩天后，神經(jīng)球附著于表面；細(xì)胞開(kāi)始遷移并失去其GFP熒光。(c) 鋪板一周后，細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)神經(jīng)元的標(biāo)記(3-微管蛋白(纖維樣結(jié)構(gòu))；有些細(xì) 胞仍表達(dá)低水平的GFP(相對(duì)圓的亮點(diǎn))。(d)鋪板兩周后，GABA陽(yáng)性神經(jīng)元 細(xì)胞很明顯。(e)鋪板一周后，細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記GFAP; — 些細(xì)胞仍表達(dá)低水平的GFP。實(shí)施本發(fā)明的模式在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的毛嚢干細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)毛嚢細(xì)胞表達(dá)中
樞神經(jīng)祖細(xì)胞(progenitor)的一種標(biāo)記，如巢蛋白。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方 面，這些毛嚢細(xì)胞是基于該標(biāo)記(巢蛋白)的表達(dá)來(lái)分離的。
巢蛋白是一種中間絲(intermediate filament),它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細(xì)胞 的標(biāo)記。具體地，帶有在巢蛋白調(diào)控序列控制下的綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn) 基因小鼠已經(jīng)產(chǎn)生，且已用于觀察CNS干細(xì)胞的自我更新和多能性。雖然 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，巢蛋白可以與一種檢測(cè)劑如綠色熒光蛋白相結(jié)合
的試劑，可用于分離毛嚢干細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以在體外或在原位進(jìn)行測(cè) 定，并測(cè)試帶有標(biāo)記的結(jié)合配對(duì)物、抗體或結(jié)合核酸。在毛嚢干細(xì)胞附著 于固相支持物的實(shí)施方案中，測(cè)定可以使用其它類型的信號(hào)分子，其中非 結(jié)合的信號(hào)分子可以與結(jié)合于所述細(xì)胞的信號(hào)分子分離開(kāi)來(lái)。舉例來(lái)說(shuō)， 信號(hào)分子可以用放射性同位素(例如121I mI 35S 32P "C或311)、光散射標(biāo)記 (Genicon Sciences Corporation, San Diego， CA;美國(guó)專利6,214,560)、酶或蛋 白標(biāo)記(如GFP或過(guò)氧化物酶)、或另外的發(fā)色標(biāo)記或染料(例如德克薩斯紅) 來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。另外，F(xiàn)ACS或其它細(xì)胞分揀機(jī)制也可用于分離細(xì)胞。
毛嚢干細(xì)胞的位置根據(jù)毛發(fā)循環(huán)而變化。在巢蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的 毛發(fā)生長(zhǎng)期早期，表達(dá)巢蛋白的細(xì)胞位于毛嚢的永久性上部，在毛嚢膨出 區(qū)中緊靠脂肪腺的下方，即毛嚢干細(xì)胞所在之處。毛嚢膨出區(qū)的巢蛋白表 達(dá)細(xì)胞相對(duì)較小、為橢圓形，并圍繞在毛發(fā)桿周圍，利用短樹(shù)突使它們彼 此相連。圖3顯示巢蛋白表達(dá)細(xì)胞在毛嚢中的定位是依賴毛發(fā)循環(huán)的。在 毛發(fā)生長(zhǎng)終期(實(shí)施例1和圖l)和毛發(fā)生長(zhǎng)期早期，GFP陽(yáng)性細(xì)胞即巢蛋白 -表達(dá)細(xì)胞主要位于毛嚢膨出區(qū)。在圖2中，表達(dá)GFP的毛嚢干細(xì)胞可見(jiàn)于 毛發(fā)生長(zhǎng)終期和毛發(fā)生長(zhǎng)期早期。由于來(lái)自毛發(fā)生長(zhǎng)終期的毛嚢干細(xì)胞看 起來(lái)是最初級(jí)并且是局部化的，它們優(yōu)選用于收獲，但可以從毛發(fā)循環(huán)的 任何時(shí)期收獲細(xì)胞。
在毛發(fā)生長(zhǎng)期的中期和晚期，GFP表達(dá)細(xì)胞位于外根鞘上部及毛嚢膨 出區(qū)，不在毛發(fā)基質(zhì)球中。這些觀察結(jié)果表明巢蛋白表達(dá)細(xì)胞形成外根鞘， 這與觀察到的毛嚢干細(xì)胞行為一致。免疫組化染色結(jié)果顯示，巢蛋白、GFP、 角蛋白5/8和角蛋白15共定位在毛嚢膨出區(qū)細(xì)胞、外根鞘細(xì)胞和脂肪腺的 基底細(xì)胞，如實(shí)施例3和圖4所示。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明，毛嚢膨出區(qū)的巢蛋白-GFP表達(dá)細(xì)胞是毛囊干細(xì)胞。受巢蛋白驅(qū)動(dòng)的GFP還發(fā)現(xiàn)在嚢間神 經(jīng)樣網(wǎng)絡(luò)中高表達(dá)，如圖5所示。巢蛋白在神經(jīng)干細(xì)胞、毛嚢干細(xì)胞和毛 嚢間神經(jīng)樣網(wǎng)絡(luò)中的共同表達(dá)，表明了它們的共同來(lái)源。實(shí)施例6展示了 巢蛋白-GFP干細(xì)胞向神經(jīng)球的轉(zhuǎn)變，如本領(lǐng)域內(nèi)已知，后者在適宜條件下 可分化成神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及可能的其它細(xì)胞類型。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種分離毛嚢干細(xì)胞的方法，包括從哺乳動(dòng) 物提供或切取皮膚以及分離毛嚢干細(xì)胞。優(yōu)選從皮膚分離巢蛋白表達(dá)細(xì)胞， 從而分離毛嚢干細(xì)胞。皮膚樣品可從毛發(fā)循環(huán)的任何時(shí)期獲得。優(yōu)選皮膚 樣品從毛發(fā)生長(zhǎng)終期獲得，因?yàn)閾?jù)信毛嚢干細(xì)胞優(yōu)選定位在這一階段，因 此容易收獲。盡管與這一理論無(wú)關(guān)，在毛發(fā)生長(zhǎng)終期階段收獲細(xì)胞還能使 獲得的細(xì)胞處于其最原始狀態(tài)。但如上面所討論的，巢蛋白表達(dá)細(xì)胞還發(fā) 現(xiàn)存在于毛發(fā)生長(zhǎng)期、毛發(fā)生長(zhǎng)期中期和毛發(fā)生長(zhǎng)期后期。這些細(xì)胞可以 利用切取的皮膚以及如優(yōu)選實(shí)施方案中的分離方法來(lái)分離，Y旦其它分離方 法也可以考慮。例如，細(xì)胞可以從受試對(duì)象原位獲得。
已發(fā)現(xiàn)這些分離的毛嚢干細(xì)胞是多能性的或具有多潛能。因此，本發(fā) 明的再一個(gè)方面涉及一種分化毛嚢干細(xì)胞的方法，毛嚢干細(xì)胞可在各種引 導(dǎo)分化的選定條件下培養(yǎng)，并產(chǎn)生分化的細(xì)胞如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、 平滑肌細(xì)胞或角質(zhì)細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，還有其它細(xì)胞。產(chǎn)生神經(jīng)元的培養(yǎng)基 可包括PDGF或CNTF。用于星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基包括如GFAP。另外， 用于平滑肌組織的培養(yǎng)基包括如FBS。下面參考中所述的分化細(xì)胞的條件 及本領(lǐng)域所教授的那些條件，也可用于本發(fā)明分化細(xì)胞的方法中。
移植可按本領(lǐng)域內(nèi)所知的任何方式來(lái)完成。在一個(gè)實(shí)施方案中，毛嚢 干細(xì)胞或由其分化所得的細(xì)胞經(jīng)系統(tǒng)注射方式進(jìn)入受試對(duì)象體內(nèi)。在另一 方面，毛嚢干細(xì)胞或由其分化所得的細(xì)胞，直接注入受試對(duì)象的器官或組 織中。優(yōu)選該器官或組織是腦、肝或與心血管系統(tǒng)相關(guān)的器官或肌肉，如 心臟。另外，在將被移植的合成支持物上附著或生長(zhǎng)的細(xì)胞或組織也要予 以考慮。毛囊干細(xì)胞或由其分化的細(xì)胞可以異源移^t入與獲得所述細(xì)胞的 對(duì)象不同的受試對(duì)象中。然而，由于毛嚢干細(xì)胞的易用性(accessibility)，在 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以從將要治療的受試對(duì)象獲得，而且如 果需要，可以使其生長(zhǎng)以提供分化細(xì)胞，然后將這些干細(xì)胞或經(jīng)分化的細(xì)胞用于自體移植。也可以考慮使用毛囊干細(xì)胞庫(kù)，因?yàn)楸景l(fā)明中的干細(xì)胞是非常原始的(primitive)，因此在移植時(shí)宿主將不太可能排斥這些細(xì)胞。很多報(bào)道(Mezey， E.等，Science (2000) 290: 1779-1782; Brazdton, T. R.等, Science (2000) 290: 1775-1779; Jiang, Y.等，Nature (2002) 418: 41-49; Krause, D. S.等,Cell (2001) 105: 369-377; Lagasse, E.等，Nat. Med. (2000) 6: 1229-1234;Petersen, B. E.等，Science (1999) 284: 1168-1170; Sata, M.等，Nat. Med. (2002) 8: 403-409; Shimizu， K.等,Nat. Med. (2001) 7: 738-741; Jackson, K. A.等，J. Clin. Invest.(2001) 107: 1395-1402;和Orlic. D.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001)98 : 10344-10349)已顯示了來(lái)源于各種組織包括骨髓、皮膚 和腦等的成年干細(xì)胞的可塑性。Mezey等(前述)顯示了移植的成年骨髓細(xì)胞(前述)，將標(biāo)記的成年小鼠骨髓細(xì)胞注射到經(jīng)過(guò)致死性輻射處理的正常成年 小鼠體內(nèi)，接下來(lái)觀察到了來(lái)自供體的細(xì)胞在腦中表達(dá)神經(jīng)元蛋白。Jiang 等(前述)報(bào)道，與稱為成年多能祖細(xì)胞或MAPC的間質(zhì)干細(xì)胞共純化的細(xì) 胞，其注入早期胚囊后可生成即使不是全部，也是大多數(shù)的體細(xì)胞，當(dāng)其 注入小鼠后，可分化成為造血譜系以及肝、肺和腸的上皮組織。Krause等(前 述)顯示成年骨髓細(xì)胞可分化成肝、肺、胃腸道、以及皮膚的上皮細(xì)胞。 Lagasse等(前述)報(bào)道成熟骨髓細(xì)胞注入FAH(-A)小鼠，即一種I型酪氨酸血 癥模型動(dòng)物以后，恢復(fù)了該小鼠肝的生化功能。Petersen等(前述)證明注射成年骨髓細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)樵偕母渭?xì)胞。Sata 等(前述)證明骨髓細(xì)胞衍生出大多數(shù)參與小鼠動(dòng)脈重建(remodeling)的平滑 肌細(xì)胞(SMC)。 Shimizu等(前述)使表達(dá)P-半乳糖苷酶的細(xì)胞經(jīng)骨髓移植進(jìn)入 接受了主動(dòng)脈異體移植(allograft)的個(gè)體中，結(jié)果證明內(nèi)膜細(xì)胞包括骨髓來(lái) 源的那些。Jackson等(前述)發(fā)現(xiàn)富集的造血干細(xì)胞分化成為心肌細(xì)胞和內(nèi) 皮細(xì)胞，并在小鼠中負(fù)責(zé)形成功能性組織。Orlic等(前述)報(bào)道，在出現(xiàn)急性心肌梗塞時(shí)，細(xì)胞因子介導(dǎo)的骨髓細(xì) 胞移位可導(dǎo)致顯著程度的心肌再生。然而，Terada， N.等，Nature (2002) 416: 542-545證明小鼠骨髄細(xì)胞在含 有白細(xì)胞介素-3的體外培養(yǎng)中可自發(fā)地與胚胎干細(xì)胞融合。此外，自發(fā)融 合的骨髓細(xì)胞接下來(lái)可以采用受體細(xì)胞的表型，這可解釋為分化。另外， 最近Wagers, A. J.等，Science, (Sep 5,2002)[印刷出版前已經(jīng)有電子版的公開(kāi)]10未能證明骨髓干細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成其它細(xì)胞類型。盡管這些結(jié)果提出了對(duì) 成年干細(xì)胞可塑性的擔(dān)心，但表達(dá)巢蛋白的毛嚢干細(xì)胞顯示出更原始的分 化并維持了其多能性。因此，期望毛嚢干細(xì)胞能提供與上述文獻(xiàn)中報(bào)道的干細(xì)胞相似的結(jié)果， 并因此與本領(lǐng)域就胚胎、骨髓、腦和皮膚等其它來(lái)源的干細(xì)胞所知的一樣， 可用于治療各種疾病和情況。如此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種治療 疾病的方法，優(yōu)選神經(jīng)性疾病或退化性疾病，該方法包括將分離到的毛嚢 干細(xì)胞移植入表現(xiàn)該疾病的哺乳動(dòng)物中。預(yù)計(jì)，經(jīng)注射或移植的本發(fā)明毛囊干細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下能分化成 在腦中表達(dá)神經(jīng)元蛋白的細(xì)胞，或與上述文獻(xiàn)中描述的體細(xì)胞類型，造血 組織，心肌細(xì)胞，內(nèi)皮組織，心Mi且織，肝、肺、腸、胃腸管道的上皮組 織，平滑肌組織，皮膚，肝組織，動(dòng)脈和心血管組織相關(guān)的細(xì)胞。在一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方案中，毛嚢干細(xì)胞或由其分化來(lái)的細(xì)胞，用于治療與這些器官 和/或組織相關(guān)的疾病或障礙的方法中。預(yù)計(jì)，毛嚢干細(xì)胞一旦移植后，能在體內(nèi)分化并修復(fù)或再生諸如肝組 織、腦組織、心血管組織等組織。另一方面，毛嚢干細(xì)胞在體外分化，且 分化的細(xì)胞同樣可用于治療疾病如神經(jīng)疾病或退化疾病。在一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，毛嚢千細(xì)胞或由其分化的細(xì)胞用于治療選自下組的疾病阿爾茨海默氏病，帕金森氏病和與年齡相關(guān)的記憶力減退。另外，毛嚢干細(xì)胞 或由其分化的細(xì)胞可用于治療脫發(fā)或皮膚替換，或治療諸如燒傷或皮膚老 化等與表皮相關(guān)的情況。此外，可用毛嚢干細(xì)胞或由其分化的細(xì)胞治療的 疾病或障礙還涉及心血管疾病或肝病。對(duì)其它疾病的治療如下詳述。另外，本發(fā)明考慮利用表達(dá)系統(tǒng)來(lái)研究和治療下文詳述的疾病。本發(fā) 明還考慮利用干細(xì)胞在體外測(cè)定毛嚢干細(xì)胞的各種分化潛能。另外，對(duì)于上面所述的具體疾病和障礙來(lái)說(shuō)，可以考慮將本發(fā)明的毛 嚢干細(xì)胞或由其分化的細(xì)胞用于干細(xì)胞治療，以便治療細(xì)胞增生和/或分化 疾病、與骨代謝相關(guān)的疾病、心血管疾病、包括內(nèi)皮細(xì)胞疾病、肝疾病、 或腦疾病，優(yōu)選腦或肝疾病，更詳細(xì)的描述如下。細(xì)月包增生和/或分化疾病的實(shí)例包括癌癥(cancer),例如癌(carcinoma)、 肉瘤、轉(zhuǎn)移性疾病或造血性瘤形成疾病、例如白血病。轉(zhuǎn)移性腫瘤可發(fā)生于多種原發(fā)性腫瘤類型，包括但不限于前列腺、結(jié)腸、肺、乳腺和肝來(lái)源 的那些。
本文術(shù)語(yǔ)"癌癥(cancer)"(可與術(shù)語(yǔ)"增生性"和"致瘤性"交換使用)是指 有自主生長(zhǎng)能力的細(xì)胞，即以細(xì)胞的迅速增殖為特征的非正常狀態(tài)。癌癥 的疾病狀況可以是病理性的，即表現(xiàn)或形成疾病狀態(tài)，例如，惡性肺瘤生 長(zhǎng)；或可以是非病理性的，即偏離了正常狀態(tài)而又不與疾病狀態(tài)相關(guān)，例 如，與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞增殖。該術(shù)語(yǔ)包括所有類型的癌癥生長(zhǎng)或致癌 過(guò)程、轉(zhuǎn)移性組織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，而不考慮組織病理學(xué) 類型或入侵時(shí)期。術(shù)語(yǔ)"癌癥"包括各種器官系統(tǒng)的惡病質(zhì)，例如影響肺、 乳房、曱狀腺、淋巴、胃腸和泌尿生殖道的那些，還包括惡性腺癌如大多 數(shù)結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌和/或睪丸腫瘤，非小細(xì)胞肺癌、小腸癌和 食道癌。術(shù)語(yǔ)"癌(carcinoma)"為本領(lǐng)域認(rèn)可，是指上皮或內(nèi)分泌組織的惡 病質(zhì)，包括呼吸系統(tǒng)癌、胃腸系統(tǒng)癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌、睪丸癌、乳房癌、 前列腺癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌和黑色素瘤。典型的癌包^r那些由宮頸、肺、前 列腺、乳房、頭部和頸部、結(jié)腸和卵巢的組織形成的癌。術(shù)語(yǔ)"癌"也包 括肉瘤，例如包括由癌組織和肉瘤樣組織組成的惡性腫瘤。"腺癌"是指從 腺體組織衍生的癌或其中鐘瘤細(xì)胞形成可辨認(rèn)的腺體結(jié)構(gòu)的癌。術(shù)語(yǔ)"肉 瘤"為本領(lǐng)域認(rèn)可，是指間葉細(xì)胞衍生的惡性腫瘤。
本發(fā)明的毛嚢干細(xì)胞或由其衍生的分化細(xì)胞可用于治療各種增生性疾 病。這些疾病包〗舌造血性瘤形成疾病。本文術(shù)i吾"造血性瘤形成疾病"包 括與造血來(lái)源的增生性/瘤形成性細(xì)胞，例如從髓細(xì)胞、淋巴或紅細(xì)胞譜系、 或其前體細(xì)胞生成的細(xì)胞相關(guān)的疾病。優(yōu)選所述疾病起因于低分化急性白
血病、如幼紅細(xì)胞白血病和急性原始巨核細(xì)胞白血病。骨骨泉疾病的其它實(shí) 例包括，但不限于急性前髓細(xì)胞白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML) 以及慢性骨髓性白血病(CML)(綜述于Vaickus, L.(1991) Crit Rev. in Oncol. lHemotol. 11: 267-297);淋巴惡病質(zhì)包括，^旦不限于急性'淋巴母細(xì)胞白血病 (ALL)，其中包括B-譜系A(chǔ)LL和T-譜系A(chǔ)LL，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、 前淋巴細(xì)胞白血病(PLL)、毛細(xì)胞(hairy cdl)白血病(HLL)以及Waldenstrom's 巨球蛋白血癥(WM)。其它形式的淋巴惡病質(zhì)包括，但不限于非-Hodgkin淋 巴瘤及其變體、外周T細(xì)胞淋巴瘤、成熟T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)、大顆粒淋巴細(xì)胞白血病(LGF)、 Hodgkin's疾病和 Reed-Stemberg疾病。本發(fā)明的毛嚢干細(xì)胞或由其分化所得細(xì)胞，可用于治療與骨代謝相關(guān) 的疾病。"骨代謝"是指骨骼結(jié)構(gòu)的形成或退化中的直接或間接作用，如骨 形成、骨吸收等，它們能最終影響血清中鈣和磷酸鹽的濃度。該術(shù)語(yǔ)還包 括骨骼細(xì)胞如破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活動(dòng)，其導(dǎo)致骨骼形成和退化。例如， 本發(fā)明中的毛嚢干細(xì)胞或由其分化所得細(xì)胞，可用于治療骨吸收性破骨細(xì) 胞的不同活性，如刺激單核細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞分化成為破骨細(xì)胞。因此， 本發(fā)明中的毛嚢干細(xì)胞或由其分化所得細(xì)胞，可以用于產(chǎn)生可影響骨骼形 成和退化的骨骼細(xì)胞，并因此可用于治療骨骼疾病。此類疾病的實(shí)例包括， 但不限于，骨質(zhì)疏松、骨營(yíng)養(yǎng)不良、骨軟化癥、佝僂病、嚢性纖維性骨炎、 腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良、骨硬化、抗驚厥治療、骨質(zhì)減少、骨纖維不全發(fā)生、次 級(jí)曱狀腺功能尤進(jìn)、曱狀腺功能減退、曱狀腺功能亢進(jìn)、硬化、阻塞性黃 疸、藥物誘導(dǎo)性新陳代謝、骨髓癌、慢性腎病、佝僂病、肉狀瘤病、糖皮 質(zhì)激素拮抗、吸收障礙綜合癥、脂肪瀉、熱帶口炎性腹瀉、先天血鈣過(guò)多 以及牛奶熱。本文中，與心臟有關(guān)的疾病或"心血管疾病"包括，影響心血管系統(tǒng)， 例如心臟、血管、和/或血液的疾病或障礙。心血管疾病可由動(dòng)脈壓力不平 衡、心臟功能不良、或血管閉塞(如血栓引起)造成。心血管疾病包括，但不 限于諸如動(dòng)脈硬化、缺血再灌注損傷、再狹窄、動(dòng)脈炎、脈管壁重塑、心 室重塑、快速心室起博、冠狀微栓、心動(dòng)過(guò)速、心搏徐緩、壓力過(guò)載、大 動(dòng)脈彎曲、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎、脈管心臟病、閥門疾病、心房纖維性顫動(dòng)、長(zhǎng)-QT 綜合征、充血性心力衰竭、竇結(jié)官能疾病、心絞痛、心衰、高血壓、心房 纖維性顫動(dòng)、心房樸動(dòng)、心肌病、例如擴(kuò)張性心力/L病或特發(fā)性心力幾病、心 肌梗塞、冠狀動(dòng)脈疾病、冠狀動(dòng)脈痙攣、缺血性疾病、心律不齊、以及心 血管發(fā)育疾病(例如動(dòng)脈畸形、動(dòng)靜脈漏管、雷諾綜合癥、神經(jīng)源性胸廓出 口綜合癥、灼痛/反射交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、血管瘤、動(dòng)脈瘤、海綿狀血管瘤、 大動(dòng)脈閥狹窄、房間隔缺損、房室管、大動(dòng)脈收縮、埃布施泰因異常、左 心發(fā)育不全綜合癥、大動(dòng)脈弓斷裂、二尖瓣脫垂、動(dòng)脈導(dǎo)管、開(kāi)放性卵圓 孔、局部異常肺靜脈回流、肺動(dòng)脈瓣閉鎖伴隨心室隔膜缺陷、肺動(dòng)脈瓣閉 鎖不伴隨心室隔膜缺陷、持續(xù)性胎循環(huán)、肺部閥門狹窄、單心室、全部異常肺靜脈回流、大血管變換、三尖瓣閉鎖、動(dòng)脈干、心室隔膜缺陷)。心血 管疾病或障礙也包括內(nèi)皮細(xì)胞疾病。
本文中，"內(nèi)皮細(xì)胞疾病"包括以異常的、失控的、或不必要的內(nèi)皮細(xì)
胞活性為特征的疾病，例如增生、遷移、血管發(fā)生、或血管形成；或細(xì)胞 表面粘附分子或血管發(fā)生相關(guān)基因，例如TIE-2,FLT和FLK的異常表達(dá)。 內(nèi)皮細(xì)胞疾病包括肺瘤發(fā)生、肺瘤轉(zhuǎn)移、牛皮癬、4唐尿病性4見(jiàn)網(wǎng)膜病、子 宮內(nèi)膜異位、格雷夫斯病、缺血性疾病(例如，動(dòng)脈粥樣硬化)，以及'隄性炎 癥(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)。
.可以用這里描述的方法治療的疾病包括，但不限于此，與肝部纖維化 組織累積相關(guān)的疾病，例如因細(xì)胞外基質(zhì)的生成和降解失衡并伴隨著現(xiàn)有 纖維的萎縮和濃縮而產(chǎn)生的疾病。這里描述的方法可以用于治療由多種因 素引起的肝細(xì)胞壞死或損傷，所述因素包括擾亂內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過(guò)程，如炎 癥過(guò)程，由毒性損傷或變化了的肝血流量引起的組織損傷，以及感染(例如， 細(xì)菌性的、病毒性的和寄生性的)。例如，所述方法可用于治療肝臟損傷， 如門靜脈高壓或肝纖維化。
此外，所述方法可以應(yīng)用于治療由先天性新陳代謝錯(cuò)誤導(dǎo)致的肝臟纖 維化，例如，由貯積病如戈謝病(脂質(zhì)異常)或肝糖元貯積病、AI-抗胰蛋白 酶缺乏引起的纖維化；調(diào)控外源物質(zhì)積聚(如貯存)的疾病，如，血色素沉著 病(鐵超載綜合征)和銅貯積病(威爾遜病)；由毒性代謝物(如，酪氨酸血癥、 果糖血癥和半乳糖血癥)積聚和過(guò)氧化物體疾病(如，澤爾韋格綜合征)引起 的疾病。此外，這里描述的方法可用于與多種化學(xué)品或藥物服用有關(guān)的肝 臟損傷的治療，如氨曱蝶呤、異煙肼、酚丁、曱基多巴、氯丙嗪、甲苯磺 丁脲或酒精，或表現(xiàn)肝臟顯性的血管疾病，如或者肝內(nèi)或者肝外的膽汁流 阻塞或由例如慢性心力衰竭、靜脈閉塞病、門靜脈血栓癥或巴-吉綜合征引 起的肝循環(huán)改變。
疾病，諸如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞； 腦水腫、顱內(nèi)壓升高和形成氙、以及腦積水；畸形和發(fā)育疾病如神經(jīng)管缺 陷、前腦異常、后窩異常、以及脊髓空洞癥和脊髓積水；圍產(chǎn)期腦損傷； 腦血管疾病如那些涉及缺氧、局部缺血、以及梗塞、包括血壓過(guò)低、低灌 注和低流速狀態(tài)-球形腦局部缺血和焦點(diǎn)腦局部缺血-來(lái)自局部供血疾病的梗塞、顱內(nèi)出血、包括腦內(nèi)(實(shí)質(zhì)內(nèi))出血、蛛網(wǎng)膜下出血和漿果樣動(dòng)脈瘤破 裂、以及脈管畸形、高血壓腦血管疾病、包括腔隙梗塞、裂隙出血、以及 高血壓腦??；感染如急性腦膜炎、包括急性化膿性(細(xì)菌)腦膜炎和急性無(wú)菌 性(病毒)腦膜炎、急性焦點(diǎn)化膿性感染、包括腦膿胂、硬膜下積膿癥、以及 硬膜外膿腫、慢性細(xì)菌腦膜腦炎、包括肺結(jié)核和分支桿菌、神經(jīng)梅毒、以
及神經(jīng)疏螺旋體病(萊姆病)、病毒性腦膜腦炎、包括節(jié)肢動(dòng)物來(lái)源(Arbo) 的病毒腦炎、I型單純皰滲病毒、II型單純皰滲病毒、帶狀水痘病毒(帶狀皰 瘆)、巨細(xì)胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病、以及人類免疫缺陷病毒1、包括 HIV-1腦膜腦炎(亞急性腦炎)、空泡脊髓病、AIDS-有關(guān)的肌病、外周神經(jīng) 病、以及小孩中的AIDS、進(jìn)行性多病灶腦白質(zhì)炎、亞急性硬化全腦炎、真 菌性腦膜腦炎、其它神經(jīng)系統(tǒng)的傳染性疾病；可遺傳的海綿狀腦病(朊病毒 疾病)；脫髓鞘疾病、包括多發(fā)性硬化癥、多發(fā)性硬化癥變體、急性彌散型 腦脊髓炎以及急性壞死性出血腦脊髓炎、以及其它有脫髓鞘現(xiàn)象的疾??； 退化性疾病、如影響腦皮質(zhì)的退化性疾病、包括阿耳茨海默氏病和Pick疾 病、基本神經(jīng)中樞和腦干的退化性疾病、包括帕金森病、先天帕金森疾病 (agitans麻痹)、進(jìn)行性核上癱瘓、皮質(zhì)基層的退化、多重系統(tǒng)萎縮、包括紋 狀體黑質(zhì)變性、ShyDrager綜合癥、以及橄欖體腦橋小腦萎縮癥、和 Huntington疾病；脊髓小腦退化、包括脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、包括Friedreich 共濟(jì)失調(diào)、以及毛細(xì)管擴(kuò)增共濟(jì)失調(diào)、影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退化性疾病、包 括肌萎縮側(cè)面硬化癥(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病)、脊柱球萎縮(Kennedy綜合癥)、以 及脊柱肌肉萎縮；先天性新陳代謝偏差、如腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、包括Kmbbe 疾病、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、腎上腺白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、佩-梅病疾病、以及 Canavan疾病、線粒體腦脊髓疾病、包括Leigh疾病和其它線4立體腦脊髓疾 病；中毒和獲得性新陳代謝疾病、包括維生素缺陷如^L胺素(維生素Bl)缺 陷和維生素B12缺陷、新陳代謝疾病造成的神經(jīng)后遺癥、包括低血糖癥、 高血糖癥、以及肝腦病、中毒性疾病、包括一氧化石友、曱醇、乙醇、以及 輻射、包括混合的氨曱蝶呤和輻射誘導(dǎo)傷害；腫瘤、如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、包括 星細(xì)胞瘤、包括原纖維(擴(kuò)散)星細(xì)胞瘤和多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、纖維狀細(xì)胞 星細(xì)胞瘤、多行性黃色星細(xì)胞瘤、以及腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 以及室鼓膜瘤和有關(guān)的心室旁大面積損傷、神經(jīng)元瘤、缺乏分化瘤、包括 成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、其它實(shí)質(zhì)瘤、包括初級(jí)腦淋巴瘤、病菌細(xì)胞瘤、以及松果腺實(shí)質(zhì)瘤、腦膜瘤、轉(zhuǎn)移性腫瘤、伴瘤形成綜合癥、外周神經(jīng)鞘腫瘤、 包括神經(jīng)鞘及纖維神經(jīng)瘤、以及惡性外周神經(jīng)鞘瘤(惡性神經(jīng)鞘)、以及神經(jīng) 皮膚綜合癥(斑痣性錯(cuò)構(gòu)瘤病)、包括神經(jīng)纖維瘤病、包括I型神經(jīng)纖維瘤病(NF 1 )和2型神經(jīng)纖維瘤病(NF2)、結(jié)節(jié)硬化癥、以及Von Hippel-Lindau病。 下面的實(shí)施例目的在于說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。 實(shí)施例1對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)終期巢蛋白-表達(dá)細(xì)胞的觀察巢蛋白是一種中間絲(IF)基因，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)祖細(xì)胞和神經(jīng)上 皮干細(xì)胞的標(biāo)記(Lendahl, U.等，Cell (1990) 60: 585-596)。攜帶受巢蛋白第二 內(nèi)含子增強(qiáng)子控制的強(qiáng)化綠色熒光蛋白(EGFP)的巢蛋白-EGFP轉(zhuǎn)基因小 鼠，可用于研究和觀察CNS干細(xì)胞的自我更新和多能性(Lendahl等， (supra) ;Zimmerman， L.等,Neuron (1994) 12: 11-24; and Kawaguchi, A" Molecular and Cellular Neuroscience (2001) 259-273)。我們?cè)诔驳鞍?EGFP小 鼠中觀察到，巢蛋白在毛嚢干細(xì)胞以及毛嚢間神經(jīng)樣網(wǎng)絡(luò)中強(qiáng)表達(dá)。對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)終期的巢蛋白-GFP皮膚樣品，使真皮朝上、表皮朝下，在 配有熒光鏡片的尼康熒光顯微鏡下直接觀察。另外，使用固定在尼康 Optiphot上的MRC-600共聚焦圖像系統(tǒng)(Bio-Rad),用1 OX PlanApo物鏡， 對(duì)這些皮膚樣本進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巢蛋白表達(dá)細(xì)胞僅僅 出現(xiàn)在毛嚢膨出區(qū)中以及毛發(fā)生長(zhǎng)終期的毛嚢的永久性上部、正好位于脂 肪腺之下，并且在這些部位為優(yōu)勢(shì)群體(圖1)。這些細(xì)胞相對(duì)較小、為紡錘 形、橢圓形或圓形(圖2)。實(shí)施例2毛發(fā)循環(huán)中巢蛋白表達(dá)細(xì)胞的比較我們觀察到巢蛋白表達(dá)細(xì)胞的定位是依賴毛發(fā)循環(huán)的。為了確定這些 巢蛋白-GFP-表達(dá)細(xì)胞是如何與毛嚢發(fā)育相關(guān)聯(lián)的，將7-8周齡、處于毛發(fā) 生長(zhǎng)終期的小鼠通過(guò)脫毛來(lái)誘導(dǎo)毛發(fā)生長(zhǎng)期。分別在將要脫毛前(毛發(fā)生長(zhǎng) 終期)，以及脫毛后l、 2、 3、 4和5天(毛發(fā)生長(zhǎng)期早期)、8和10天(毛發(fā) 生長(zhǎng)期中期)、15和16天(毛發(fā)生長(zhǎng)期晚期)、19和20天(過(guò)渡期)，從背部 皮膚切取皮膚樣品(5x5 mm2)。如上面所提到的，在毛發(fā)生長(zhǎng)終期，毛嚢中 的巢蛋白表達(dá)細(xì)胞僅位于毛嚢膨出區(qū)的永久性上部。當(dāng)新的毛發(fā)循環(huán)被誘 導(dǎo)后，毛發(fā)生長(zhǎng)期毛嚢開(kāi)始生長(zhǎng)。在脫毛兩到三天后，表達(dá)巢蛋白的新毛囊細(xì)胞直接從位于膨出區(qū)的巢蛋白-GFP-表達(dá)細(xì)胞增殖。在毛發(fā)循環(huán)處于再 生期的中期和晚期時(shí)，表達(dá)巢蛋白的毛嚢細(xì)胞特異性定位于外根鞘上部三 分之二處，而在毛嚢或毛發(fā)基質(zhì)球的下部三分之一沒(méi)有表達(dá)。表達(dá)巢蛋白 的外根鞘細(xì)胞在整個(gè)毛發(fā)生長(zhǎng)期和過(guò)渡期期都可觀察到。在過(guò)渡期，當(dāng)毛發(fā)球基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)受衰退和退化時(shí)，外根鞘巢蛋白-GFP-表達(dá)細(xì)胞存留下來(lái)并 隨著毛囊的收縮而減少，最終在新的毛發(fā)生長(zhǎng)終期到來(lái)時(shí)發(fā)現(xiàn)僅存在于毛 嚢膨出區(qū)(圖3)。膨出區(qū)巢蛋白-GFP-表達(dá)細(xì)胞在毛發(fā)循環(huán)中的動(dòng)力學(xué)循環(huán)模式強(qiáng)烈提 示它們是毛嚢干細(xì)胞，并首次提供了活干細(xì)胞形成新毛嚢結(jié)構(gòu)的直接證據(jù)。 通過(guò)在毛發(fā)循環(huán)期間跟蹤巢蛋白-GFP表達(dá)細(xì)胞，我們的觀察證實(shí)膨出區(qū)細(xì) 胞實(shí)際上形成了毛嚢結(jié)構(gòu)。我們的結(jié)果被其它人的發(fā)現(xiàn)有力支持。最近， Oshima等.(上述)報(bào)道，成年小鼠觸須嚢外根鞘的上部區(qū)域含有多能干細(xì)胞， 它們能夠應(yīng)答形態(tài)信號(hào)來(lái)產(chǎn)生復(fù)毛囊、脂肪腺和表皮。這些發(fā)現(xiàn)與我們對(duì) 根鞘外部巢蛋白-GFP-表達(dá)的觀察一致。實(shí)施例3巢蛋白-表達(dá)毛嚢干細(xì)胞的進(jìn)一步鑒定為了進(jìn)一步鑒定這些巢蛋白-GFP-表達(dá)型毛嚢干細(xì)胞，在石蠟包埋的野 生型C57B16和巢蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚中，通過(guò)免疫組化測(cè)定巢蛋白 (1: 80， Rat401, DSHB, University of Iowa， Iowa City, IA)、 GFP (1:100, Boehringer Mannheim)、 角蛋白5/8(1: 250, Chemico International, Temecula, CA)以及作為毛嚢干細(xì)胞潛在標(biāo)記之一的角蛋白15(1:100, Chemico International, Temecula, CA)的共定位。免疫組化染色使用了 DAKO ARK animal research kit或 DAKO En Vision Doublestain System 以及色素原 DAB(3，3-二氨基聯(lián)苯胺)或核固紅。免疫組化染色結(jié)果(圖4)說(shuō)明，巢蛋白、 GFP、角蛋白5/8和角蛋白15共定位在毛嚢膨出區(qū)細(xì)胞、外根鞘細(xì)胞和脂 肪腺基底細(xì)胞中。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明毛嚢膨出區(qū)的巢蛋白-GFP-表達(dá)細(xì)胞 是毛囊干細(xì)胞。我們還觀察到整個(gè)皮膚層中巢蛋白-表達(dá)細(xì)胞的"神經(jīng)樣，，三維網(wǎng)絡(luò)， 所述皮膚層包括聯(lián)系著毛嚢的表皮、毛囊、真皮、皮下和肉膜(圖5)。這些 細(xì)胞的真實(shí)特點(diǎn)和功能還需進(jìn)一步證實(shí)。因此，巢蛋白在毛嚢干細(xì)胞及毛 嚢間神經(jīng)樣網(wǎng)絡(luò)中的表達(dá)，提示與神經(jīng)干細(xì)胞的相關(guān)性。實(shí)施例4
毛嚢干細(xì)胞的分離
為了進(jìn)一步鑒定這些巢蛋白-GFP表達(dá)型毛囊干細(xì)胞是否多能干細(xì)胞， 我們分離了毛嚢膨出區(qū)的巢蛋白-GFP-表達(dá)干細(xì)胞，并對(duì)它們進(jìn)行了體外培 養(yǎng)。將毛發(fā)生長(zhǎng)終期的巢蛋白-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚樣品切下并切碎。接著 將切碎的組織用胰蛋白酶(0.25%)、膠原酶(0.4%)和分散酶(1.0%)的混合物在 37。C消化2小時(shí)。在配有熒光鏡片的解剖顯微鏡下，分離出毛嚢膨出區(qū)中 帶有巢蛋白-GFP表達(dá)細(xì)胞的單個(gè)毛嚢。然后在熒光解剖顯微鏡下，進(jìn)一步 用精細(xì)的注射器分離出毛嚢膨出區(qū)的巢蛋白-GFP表達(dá)細(xì)胞。
實(shí)施例5
干細(xì)胞的生長(zhǎng)
將來(lái)自毛嚢膨出區(qū)的巢蛋白-GFP-表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至沒(méi)有補(bǔ)加生長(zhǎng)因子 的M21培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是用來(lái)培養(yǎng)神經(jīng)球的典型的神經(jīng)維持培養(yǎng)基 (Uchida, N.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 14720-14725)。 12天后 出現(xiàn)神經(jīng)球樣集落。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，從毛嚢膨出區(qū)分離的巢蛋白-GFP-表 達(dá)細(xì)胞以10細(xì)胞/mm2生長(zhǎng)于含有甲基纖維素(1.2%)的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基 中，并每?jī)商煅a(bǔ)加表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(20 ng/ml)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGF)(20 ng/ml)和白血病抑制因子(Lif)(lO ng/ml)。當(dāng)球在培養(yǎng)基中出現(xiàn)后， 將其轉(zhuǎn)移至新的無(wú)曱基纖維素的培養(yǎng)板中。從初級(jí)球產(chǎn)生了次級(jí)球。接下
來(lái)對(duì)這些球的分化潛力進(jìn)行檢測(cè)。 實(shí)施例6 分化培養(yǎng)試驗(yàn)
將球接種在多鳥(niǎo)氨酸/層粘連蛋白包被的培養(yǎng)板上，在分別存在胎牛血 清(FBS)(5。/。)、腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)(IO ng/ml)、血小板衍生生長(zhǎng)因子 (PDGF) (10 ng/m)和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)(10 ng/ml)的Dulbecco's改良 型Eagles培養(yǎng)基(DMEM)-F12上培養(yǎng)。然后，這些細(xì)胞用針對(duì)神經(jīng)元(|3-111 微管蛋白，1: 500，Promega)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP, 1: 300, Sigma)、平滑肌細(xì) 胞(SMA, 1: 300, Sigma)和角質(zhì)細(xì)胞(Pan-keratin， 1: 100, Sigma)的標(biāo)記進(jìn)行免 疫化學(xué)染色來(lái)分析。脂肪細(xì)胞通過(guò)目測(cè)觀察來(lái)確定(圖6)。
在有BDNF時(shí)生長(zhǎng)的球?qū)?3-III微管蛋白和GABA具有免疫反應(yīng)性，表 明存在神經(jīng)元。在有PDGF時(shí)生長(zhǎng)的球主要產(chǎn)生神經(jīng)元，有時(shí)產(chǎn)生GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，表明存在星形月交質(zhì)細(xì)胞。在有CNTF時(shí)生長(zhǎng)的細(xì)胞僅產(chǎn)生p-m 微管蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，表明為神經(jīng)元。所有在FBS存在下生長(zhǎng)的球分化成為 平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)陽(yáng)性細(xì)胞，少數(shù)為角質(zhì)細(xì)胞。
基于我們的觀察和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們得出結(jié)論1)巢蛋白-GFP表達(dá)證明 膨出區(qū)細(xì)胞是毛嚢干細(xì)胞。這是首次證明膨出區(qū)細(xì)胞實(shí)際上有干細(xì)胞功能。 2)毛嚢干細(xì)胞表達(dá)巢蛋白的事實(shí)提示它們與神經(jīng)干細(xì)胞有關(guān)。3)毛嚢通過(guò) 表達(dá)巢蛋白-GFP-的神經(jīng)樣網(wǎng)絡(luò)相聯(lián)系。4)毛嚢干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下可以 形成包括神經(jīng)元細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型，提示它們?cè)隗w內(nèi)有形成腦細(xì)胞 的潛能。
權(quán)利要求
1.分離的毛囊干細(xì)胞，其在生長(zhǎng)周期階段中的毛發(fā)生長(zhǎng)終期從哺乳動(dòng)物永久性上部毛囊緊靠脂肪腺下方的毛囊膨出區(qū)獲得，并且所述細(xì)胞表達(dá)巢蛋白，并且所述細(xì)胞當(dāng)培養(yǎng)在包含F(xiàn)BS、BDNF、PDGF或CNTF的培養(yǎng)基中時(shí)，分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。
2. 通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求1的細(xì)胞制備的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌 細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。
3. 包含權(quán)利要求1所述的細(xì)胞的組合物在制備治療疾病的組合物中的 用途，所述疾病是可以通過(guò)在包含將所述細(xì)胞施用到表現(xiàn)該疾病的受試者 的方法中因產(chǎn)生分化的細(xì)胞而獲益的疾病。
4. 包含權(quán)利要求2所述神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或脂肪細(xì) 胞的組合物在制備治療個(gè)體疾病的組合物中的用途，所述病癥是由于將所 述神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞移入所述受試者而獲益 的疾病。
全文摘要
毛囊干細(xì)胞是通過(guò)分離巢蛋白表達(dá)細(xì)胞的手段從哺乳動(dòng)物中分離得到的。這些毛囊干細(xì)胞是用于同源或異源干細(xì)胞治療的成熟干細(xì)胞來(lái)源之一。這些干細(xì)胞可以系統(tǒng)性地移植入哺乳動(dòng)物或直接移植入器官。另外，該干細(xì)胞可以在體外進(jìn)一步分化，然后系統(tǒng)性地或直接移植入哺乳動(dòng)物。
文檔編號(hào)A61K9/00GK101407785SQ20081017454
公開(kāi)日2009年4月15日 申請(qǐng)日期2002年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月20日
發(fā)明者李伶娜, 萌 楊 申請(qǐng)人:抗癌公司