一組與新生兒肌張力低下表型相關(guān)的基因新突變及檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一組與新生兒肌張力低下表型相關(guān)的基因新突變及 檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌張力低下是嬰幼兒較為常見的異常臨床表現(xiàn)，在不同時期臨床表現(xiàn)各異。新生 兒期起病呈四肢松軟，伴有吸吮無力、喂養(yǎng)困難，稱之為"松軟兒";在兒童期以云頂發(fā)育遲 緩為主，表現(xiàn)獨立走路時間推遲，流涎，語言發(fā)育延遲，反射減弱以及關(guān)節(jié)，四肢運動有關(guān)的 神經(jīng)對刺激反應(yīng)的延遲等。
[0003] 新生兒肌張力低下病因繁多，絕大多數(shù)為遺傳因素。有染色體數(shù)目異常導(dǎo)致 的新生兒肌張力低下，如唐氏綜合征。有染色體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的新生兒肌張力低下，如 Prader-Willi綜合癥。有單基因病導(dǎo)致的新生兒肌張力低下：神經(jīng)肌肉疾病，如雷特綜合 征、脊肌萎縮癥、強直性肌營養(yǎng)不良、先天性肌營養(yǎng)不良等；先天性代謝缺陷病，如苯丙酮尿 癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、半乳糖血癥、尿素循環(huán)疾病等；線粒體疾病，如MELAS綜合 征、Leigh綜合癥等。根據(jù)肌張力低下的病因可分為中樞性和周圍性；根據(jù)其受累部位，肌 張力低下可呈現(xiàn)全身性、局灶性或節(jié)段性。
[0004] 新生兒肌張力低下臨床表現(xiàn)復(fù)雜，醫(yī)生常常難以準確地找出病因，患者往往得不 到及時有效的治療，相當多的患兒在確診和治療之前即已死亡，或因貽誤治療時機造成智 力和身體的終生殘疾。
[0005] 導(dǎo)致新生兒肌張力低下的遺傳疾病多，大部分有多個致病基因。傳統(tǒng)的生化檢 測靈敏度低、準確性差，且需結(jié)合影像學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域的其他多種檢測手段 進行確診，費用高、耗時長，容易耽誤患者的最佳治療時間。常規(guī)的分子遺傳學(xué)檢測方法如 PCR、Sanger測序、MLPA技術(shù)等一次只能對一個基因或一個基因的部分區(qū)域進行檢測。因此 采用上述方法很難對導(dǎo)致新生兒肌張力低下的多個致病基因同時進行檢測，檢出率低，臨 床上很難對疾病進行確診。
[0006]自人類基因組計劃后發(fā)展起來的新一代高通量測序技術(shù)，因其通量高，迅速占領(lǐng) 了市場。近幾年，新一代高通量測序技術(shù)不斷完善，檢測變異的準確性也逐步提高，與此 同時，衍生起來的靶向重測序技術(shù)大大降低了檢測成本，在遺傳性疾病檢測應(yīng)用中極具前 景。在美國，未經(jīng)FDA審批的臨床技術(shù)可以通過參比實驗室CLIA途徑進入臨床，實驗室具 備嚴格的質(zhì)量控制且實驗室管理人員有相應(yīng)的資質(zhì)，實驗室就可以合法收費并提供自己驗 證過LDT的臨床服務(wù)。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)實驗室質(zhì)量評估委員會（ACMG)分別于 2008年4月、2013年9月和2015年3月提出了變異分類、報告與解釋的標準和新一代高通 量測序用于臨床實驗室檢測的標準。中國于2014年12月批準了第一批高通量測序臨床應(yīng) 用試點單位，正在建立技術(shù)標準，開展遺傳病、產(chǎn)前診斷、胚胎植入前篩查等應(yīng)用評估。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了三個新發(fā)突變--MPZ基因的c. 602delA突變、MTM1基因的 c. 1237A>C突變和MTM1基因的c. 231+2T>C突變與肌張力低下表型相關(guān)，所要解決的技術(shù)問 題是如何診斷肌張力低下或篩查肌張力低下患者。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了下述任一產(chǎn)品：
[0009] D1)MPZ突變蛋白質(zhì)，為MPZ發(fā)生p. Lys201AsnfsTer51突變其它氨基酸殘基不變得 到的蛋白質(zhì)（序列22所不的蛋白質(zhì)）；
[0010] D2)MTM1突變蛋白質(zhì)，為MTM1的第413位的Ser突變?yōu)锳rg，其它氨基酸殘基不變 得到的蛋白質(zhì)（序列24所示的蛋白質(zhì)）；
[0011] D3)編碼所述MPZ突變蛋白質(zhì)的DNA分子或cDNA分子；
[0012] D4)編碼所述MTM1突變蛋白質(zhì)的DNA分子或cDNA分子；
[0013] D5)含有Μ的DNA分子或cDNA分子，所述Μ為將MTM1基因第四個內(nèi)含子第2位的 Τ突變?yōu)镃得到的DNA分子；
[0014]D6)由所述D1)和所述D2)中的至少一個與XI組成的成套蛋白質(zhì)；所述XI為 108個與肌張力低下相關(guān)的蛋白質(zhì)發(fā)生突變得到的蛋白質(zhì)中的至少一個；所述108個與肌 張力低下相關(guān)的蛋白質(zhì)為AARS、ALG1、ALG11、ALG12、ALG13、ALG2、ALG3、ALG6、ALG8、ALG9、 B4GALT1、CDKL5、CNBP、COG1、C0G4、C0G5、C0G6、C0G7、C0G8、C0L6A1、C0L6A2、C0L6A3、DD0ST、 DHDDS、DMPK、DNAJB2、DOLK、DPAGT1、DPMI、DPM2、DPM3、DYNC1H1、EGR2、FGD4、FIG4、FKRP、 FKTN、F0XG1、GARS、GDAP1、GMPPA、HSPB1、HSPB8、IGHMBP2、ISPD、KIF1B、LAMA2、LARGE、LITAF、 LMNA、LRSAM1、MAGT1、MAN1B1、MARS、MCEE、MECP2、MED25、MFN2、MGAT2、MMAA、MMAB、MMADHC、 M0GS、MPDU1、MPI、MTMR2、MUT、NDRG1、NEFL、PEX1、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19、 PEX2、PEX26、PEX3、PEX5、PEX6、PGM1、PMM2、PMP22、POMGNT1、POMT1、P0MT2、PRX、RAB7A、RFT1、 RYR1、SBF1、SBF2、SEPN1、SH3TC2、SLC35A1、SLC35A2、SLC35C1、SMN1、SMN2、SRD5A3、SSR4、 STT3A、STT3B、TAZ、TMEM165、TRPV4 和TUSC3 基因；
[0015] D7)由所述D3)、所述D4)和所述D5)中的至少一個與X2組成的成套DNA分子或 cDNA分子；所述X2為編碼所述XI的DNA分子或cDNA分子。
[0016] 上述廣品中，D1)可為序列22所不的蛋白質(zhì)；D2)可為序列24所不的蛋白質(zhì)；D3) 可為序列21所示的DNA分子；D4)可為序列23所示的DNA分子；D5)可為序列25所示的 DNA分子。序列21為MPZ基因發(fā)生c. 602delA突變得到的核苷酸序列；序列23為MTM1基 因發(fā)生c. 1237A>C突變得到的核苷酸序列；序列25為MTM1基因發(fā)生c. 231+2T>C突變得到 的核苷酸序列。
[0017] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了診斷或輔助診斷肌張力低下患者的成套試 劑，為成套試劑1。
[0018] 本發(fā)明所提供的成套試劑1，由名稱為G1的檢測MPZ基因c.602delA突變的 物質(zhì)、名稱為G2的檢測MTM1基因c. 1237A>C突變的物質(zhì)和名稱為G3的檢測MTM1基因 c. 231+2T>C突變的物質(zhì)組成；所述MPZ基因c. 602delA突變?yōu)槿笔PZ基因編碼序列的第 602位核苷酸得到的基因；所述MTM1基因c. 1237A>C突變?yōu)閷TM1基因編碼序列的第1237 位核苷酸得到的基因；所述MTM1基因c. 231+2T>C突變?yōu)閷TM1基因第四個內(nèi)含子第2位 的T突變?yōu)镃得到的DNA分子。
[0019] 上述成套試劑1中，所述MPZ基因c. 602delA突變后的核苷酸序列可為序列21 ;所 述MTM1基因c. 1237A>C突變后的核苷酸序列可為序列23 ;所述MTM1基因c. 231+2T>C突 變后的核苷酸序列可為序列25。
[0020] 上述成套試劑1中，所述MPZ基因c. 602delA突變可為雜合突變；所述MTM1基因 c. 1237A>C突變可為純合突變；所述MTM1基因c. 231+2T>C突變可為純合突變。
[0021] 上述成套試劑1中，所述G1可為檢測MPZ基因c. 602delA突變的探針對和/或引 物對，所述探針對中的兩條探針可分別與MPZ基因c. 602delA突變位點的上游和下游特異 結(jié)合，所述引物對中的兩條引物可分別與MPZ基因c. 602delA突變位點的上游和下游特異 結(jié)合；
[0022] 所述G2可為檢測MTM1基因c. 1237A>C突變的探針對和/或引物對，所述探針對 中的兩條探針可分別與MTM1基因c. 1237A>C突變位點的上游和下游特異結(jié)合，所述引物對 中的兩條引物可分別與MTM1基因c. 1237A>C突變位點的上游和下游特異結(jié)合；
[0023] 所述G3可為檢測MTM1基因c. 231+2T>C突變的探針對和/或引物對，所述探針對 中的兩條探針可分別與MTM1基因c. 231+2T>C突變位點的上游和下游特異結(jié)合，所述引物 對中的兩條引物可分別與MTM1基因c. 231+2T>C突變位點的上游和下游特異結(jié)合。
[0024] 上述成套試劑1中，所述檢測MPZ基因c. 602delA突變的引物對的兩條引物的序 列可分別為序列表中序列1和序列2 ;所述檢測MPZ基因c. 602delA突變的探針對的兩個 探針的序列可分別為序列表中序列3和序列4 ;
[0025] 所述檢測MTM1基因c. 1237A>C突變的引物對的兩條引物的序列可分別為序列表 中序列5和序列6 ;所述檢測MTM1基因c. 1237A>C突變的探針對的兩個探針的序列可分別 為序列表中序列7和序列8;
[0026] 所述檢測MTM1基因c. 231+2T>C突變的引物對的兩條引物的序列可分別為序列表 中序列9和序列10 ;所述檢測MTM1基因c. 231+2T>C突變的探針對的兩個探針的序列可分 別為序列表中序列11和序列12。
[0027] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述Al)-A4)中的任一種診斷或輔助診斷 肌張力低下患者的成套試劑，該成套試劑為成套試劑2 :
[0028] A1)所述G1 ;A2)所述G2 ;A3)所述G3 ;A4)由所述G1、所述G2和所述G3這三種 中的至少兩種組成的成套試劑。
[0029] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了診斷或輔助診斷肌張力低下患者的成套試 劑，該成套試劑為成套試劑3。
[0030] 本發(fā)明所提供的成套試劑3,由所述成套試劑1或所述成套試劑2與檢測108個 與肌張力低下相關(guān)基因突變的物質(zhì)組成；所述108個與肌張力低下相關(guān)基因為AARS、ALG1、 ALG11、ALG12、ALG13、ALG2、ALG3、ALG6、ALG8、ALG9、B4GALT1、CDKL5、CNBP、COG1、C0G4、C0G5、 C0G6、C0G7、C0G8、C0L6A1、C0L6A2、C0L6A3、DDOST、DHDDS、DMPK、DNAJB2、DOLK、DPAGT1、DPMI、 DPM2、DPM3、DYNC1H1、EGR2、FGD4、FIG4、FKRP、FKTN、F0XG1、GARS、GDAP1、GMPPA、HSPB1、 HSPB8、IGHMBP2、ISPD、KIF1B、LAMA2、LARGE、LITAF、LMNA、LRSAM1、MAGT1、MAN1B1、MARS、 MCEE、MECP2、MED25、MFN2、MGAT2、MMAA、MMAB、MMADHC、MOGS、MPDU1、MPI、MTMR2、MUT、NDRG1、 NEFL、PEX1、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19、PEX2、PEX26、PEX3、PEX5、PEX6、PGM1、 PMM2、PMP22、P0MGNT1、P0MT1、P0MT2、PRX、RAB7A、RFT1、RYR1、SBF1、SBF2、SEPN1、SH3TC2、 SLC35A1、SLC35A2、SLC35C1、SMN1、SMN2、SRD5A3、SSR4、STT3A、STT3B、TAZ、TMEM165、TRPV4 和TUSC3基因。
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