豬血液參數(shù)性狀相關(guān)的microRNA分子標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬血液參數(shù)性狀相關(guān)的 microRNA分子標(biāo)記及應(yīng)用。該分子標(biāo)記從microRNA155前體及側(cè)翼序列中篩選得到。
【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNAs(miRNAs)為一類大小約22個(gè)堿基通過(guò)與其革巴mRNA結(jié)合而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄 后基因沉默的小RNA(Barteletal.，2004)。哺乳動(dòng)物中miRNA的加工過(guò)程可分為多步。 首先，大部分miRNA通過(guò)RNA聚合酶II(RNApolymeraseII)轉(zhuǎn)錄成一條長(zhǎng)的原初轉(zhuǎn)錄物 (pri-miRNA)，隨后，pri-miRNA被由III型RNA核酸酶Drosha和雙鏈RNA結(jié)合蛋白DGCR8組 成的微處理復(fù)合體切割成大小為70~80nt的前體miRNA(pre-miRNA)(Leeetal.，2003)。 接著由核輸出蛋白Exportin-5及協(xié)同作用因子Ran-GTP-起將發(fā)夾前體miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核 (Yietal.，2003)。在細(xì)胞質(zhì)中，前體miRNA被另一個(gè)III型RNA核酸酶Dicer切割形成 雙鏈miRNA復(fù)合體。隨后解旋，其中一條成為成熟miRNA進(jìn)入核糖蛋白復(fù)合體，形成RNA干 擾沉默復(fù)合體（RISC)(Prealletal.，2005)。在RISC中，miRNA通過(guò)兩種方式調(diào)節(jié)靶基 因的表達(dá)，如果其與靶基因3'UTR完全互補(bǔ)，則使其降解；若不完全互補(bǔ)結(jié)合，則阻礙其翻 譯。
[0003] 體內(nèi)miRNA的生物合成受到嚴(yán)密的調(diào)控，存在于miRNA宿主基因、pri-miRNA及 pre-miRNA序列上的突變會(huì)不同程度地影響最終成熟miRNA的生成。在哺乳動(dòng)物中，miRNA 是由宿主基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)，由于在宿主基因轉(zhuǎn)錄區(qū)上存在的SNP可影響miRNA的轉(zhuǎn)錄，宿主基 因轉(zhuǎn)錄區(qū)自然產(chǎn)生的SNP是miRNA功能研究的重點(diǎn)對(duì)象。
[0004] Tam等在1997首先定義了人的B細(xì)胞集成簇（BIC，B-cellIntegration Cluster)，它是存在于由禽類白血病病毒誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞癌的一個(gè)常見(jiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒整合 位點(diǎn)上的基因，它可被插入的啟動(dòng)子活性激活轉(zhuǎn)錄。它來(lái)源于一條非編碼長(zhǎng)鏈RNA，由三個(gè) 外顯子組成，跨越了 13kb的區(qū)域（Tametal.，2001)。2005年Eis等發(fā)現(xiàn)miR-155由bic 經(jīng)加工剪切而產(chǎn)生，miR-155的前體存在于第三個(gè)外顯子中（Eisetal.，2005)。本申請(qǐng) 人實(shí)驗(yàn)室前期在長(zhǎng)白、杜洛克、梅山和二花臉豬發(fā)現(xiàn)miR-155宿主基因bic中一個(gè)T/C突變 與⑶3-⑶4-⑶8+T細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)（Lietal.，2013)。進(jìn)一步的SNP分析中發(fā)現(xiàn)在 pre-miR-155前305bp存在A/C突變，該突變導(dǎo)致序列由AAACA突變成AAACC。而調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的特異轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的結(jié)合基序?yàn)锳AACA(Zhengetal.，2007)，由此推測(cè)該突變可 能導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中Foxp3與bic基因的結(jié)合能力發(fā)生變化從而導(dǎo)致miR-155的表達(dá)差 異。
[0005] miR-155功能廣泛，它參與造血、炎癥和免疫等許多生物過(guò)程。MiR-155是一種和 癌癥相關(guān)的microRNA，不僅參與調(diào)控細(xì)胞分裂和免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)信號(hào)通路，在微生物感染 和炎癥反應(yīng)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用（Babaretal.，2012)。與機(jī)體中其他的細(xì)胞比較而 言，miR-155在骨髓來(lái)源的造血細(xì)胞中特異高表達(dá)，其中miR-155-5p在造血細(xì)胞中的表達(dá)， 可能影響機(jī)體的造血功能（Martinetal.，2006)。與其他組織器官比較而言，miR-155在 免疫器官胸腺中高表達(dá)（Landgrafetal.，2007)，而胸腺是機(jī)體的重要淋巴器官，與T細(xì) 胞的分化、發(fā)育密切相關(guān)。為了研究miR-155的功能，在基因水平敲除和敲入miR-155,發(fā) 現(xiàn)miR-155在T和B細(xì)胞活化時(shí)上調(diào)表達(dá)，表明miR-155在體內(nèi)淋巴細(xì)胞生發(fā)中心起正 向調(diào)控作用（LuLetal.，2007)。敲除miR-155后免疫反應(yīng)將大受影響，從產(chǎn)生細(xì)胞因 子的T細(xì)胞，產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞到起抗原呈遞作用的樹(shù)突細(xì)胞均受到影響（Rodriguezet al.，2007)。構(gòu)建野生型和bic/miR155缺陷的小鼠的嵌合體發(fā)現(xiàn)bic/miR55缺失的胸腺細(xì) 胞和脾細(xì)胞的數(shù)量都下降。bic/miR55缺失的胸腺細(xì)胞數(shù)量下降的原因可能是細(xì)胞發(fā)育早 期就出現(xiàn)了缺陷（KohlhaasSetal.，2009)。miR155缺失會(huì)使得Treg細(xì)胞的數(shù)量減少， 但是并不影響其功能。
[0006] 迄今為止，尚未見(jiàn)全面研究豬miR-155基因功能的報(bào)道，而研究突變位點(diǎn)在群體 中的多態(tài)性以及性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的一個(gè)非常有力的手段。所以申請(qǐng)人對(duì) miR-155的基因序列進(jìn)行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析，以期能夠發(fā)現(xiàn)它與豬血液參數(shù)的關(guān)聯(lián)，進(jìn) 而發(fā)現(xiàn)miR-155在免疫方面的功能，以期作為作為一種豬血液參數(shù)性狀相關(guān)的microRNA分 子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，通過(guò)PCR擴(kuò)增與豬免疫相關(guān) microRNA-155的前體及側(cè)翼序列，利用CRS-PCR-RFLP技術(shù)，在豬（例如，杜洛克X二花臉 F2代群體）中進(jìn)行分型，分型結(jié)果與該群體的免疫指標(biāo)關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)而得到一種豬血液參 數(shù)性狀相關(guān)的microRNA分子標(biāo)記。
[0008] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 申請(qǐng)人通過(guò)基因克隆的方法，得到與豬血液參數(shù)性狀相關(guān)的microRNA-155前體 及側(cè)翼序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :1所述。在該序列的109bp處存在一個(gè) A109-C109等位基因的堿基突變，且A109-C109能夠形成A109-C109Dde I-RFLP多態(tài)。申請(qǐng) 人將該基因片段作為檢測(cè)豬免疫性狀的分子標(biāo)記。
[0010] 為了得到與豬血液參數(shù)性狀相關(guān)的micr〇RNA-155前體及側(cè)翼序列，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)、 測(cè)序并檢測(cè)該序列的A109-C109處堿基突變所用的引物對(duì)，其核苷酸序列如下所示：
[0011]正向引物：5'CCCTCTGCGTTTTAGCAT3'（見(jiàn)序列表SEQIDN0:2)
[0012]反向引物：5'TTGCTTTCAGGATACCGTTG3'（見(jiàn)序列表SEQIDNO:3)
[0013] 本發(fā)明所述的microRNA分子標(biāo)記的制備方法如下所述：
[0014] 在miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中下載人 / 鼠miR-155 前體序列，用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTn比對(duì)，釣 取同源豬miR-155基因的部分DNA序列（包括前體序列及側(cè)翼序列），設(shè)計(jì)PCR引物，提取 豬基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序，獲得如序列表SEQIDN0:1所示的核苷 酸序列。
[0015] 應(yīng)用常規(guī)的PCR-RFLP的方法對(duì)序列表SEQIDN0:1所示的第109位堿基突變進(jìn) 行了檢測(cè)，并初步進(jìn)行其基因型與豬血液參數(shù)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，為豬的分子標(biāo) 記輔助選擇提供了 一個(gè)新的分子標(biāo)記。
[0016] 更詳細(xì)的技術(shù)方案參見(jiàn)《【具體實(shí)施方式】》。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 序列表SEQIDNO:1:是本發(fā)明克隆的microRNA-155的前體及側(cè)翼序列，序列全 長(zhǎng)為697bp。在該序列的109bp處存在一個(gè)A/C等位基因突（即，109bp處的堿基"A"突變 后的喊基是C)。
[0018] 序列表SEQIDN0 :2 :是擴(kuò)增與豬血液參數(shù)性狀相關(guān)的microRNA分子標(biāo)記的正向 引物序列。序列長(zhǎng)度為18bp。
[0019] 序列表SEQIDNO:3:是擴(kuò)增與豬血液參數(shù)性狀相關(guān)的microRNA分子標(biāo)記的反向 引物序列。序列長(zhǎng)度為20bp。
[0020] 序列表SEQIDNO:4 :是從NCBI豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTn比對(duì)，釣取同源豬 miRNA-155基因序列，選擇釣取到的同源性大于98 %的20余條序列，導(dǎo)入DNASTAR軟件 seqman程序中，拼接得到一條可信度較高的序列，序列全長(zhǎng)為1034bp，供后續(xù)研究用。
[0021] 圖1 :本發(fā)明的總體技術(shù)流程示意圖。
[0022] 圖2 :本發(fā)明克隆的與部分血液參數(shù)性狀相關(guān)的microRNA分子標(biāo)記的核苷酸序列 PCR產(chǎn)物電泳圖譜，附圖標(biāo)記說(shuō)明：泳道2-8為擴(kuò)增個(gè)體，泳道1的Μ為DL2000。
[0023] 圖3:DdeI-RFLP的三種基因型（AACCAC)電泳圖譜，序列長(zhǎng)度為697bp。附圖 標(biāo)記說(shuō)明：泳道2-7為擴(kuò)增個(gè)體，泳道1的Μ為DL2000。
[0024] 圖4:本發(fā)明中三種基因型（AACCAC)豬miR-155基因序列的部分測(cè)序圖。
[0025] 圖5:是本發(fā)明克隆的microRNA-155前體及其側(cè)翼序列片段。圖中序列的109bp 處存在一個(gè)A/C等位基因突變（109bp處的英文字母"R"為突變位點(diǎn)）。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1:豬microRNA-155前體及部分側(cè)翼序列的克隆
[0027] 1豬microRNA-155前體及部分側(cè)翼DNA序列的擴(kuò)增
[0028] 在miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中 下載人 / 鼠 miRNA-155 前體序列（基因登錄號(hào)：MI0000681/MI0000177)，在NCBI(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTn比對(duì)，釣取同源豬miRNA-155基因序列，選擇 釣取到的同源性大于98%的20余條序列，導(dǎo)入DNASTAR軟件seqman程序中，拼接出一條 可信度較高的序列（其全長(zhǎng)為l〇34bp，其核苷酸序列如SEQIDN0:4所示）以供后續(xù)的分 析。根據(jù)拼接所得序列設(shè)計(jì)PCR引物（如下所示），提取豬基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、PCR 產(chǎn)物純化和測(cè)序，獲得如序列表SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。通過(guò)對(duì)miRNA-155前體 和側(cè)翼部分序列^97bp)的擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在該序列的109bp處存在1個(gè)等位基因的 突變（即A109-C109)，對(duì)此突變進(jìn)行酶切分析，發(fā)現(xiàn)該突變恰好可被內(nèi)切酶DdeI識(shí)別。
[0029] 擴(kuò)增miRNA-1