一種石墨烯加速pcr技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及分子檢驗(yàn)的核酸擴(kuò)增領(lǐng)域，具體涉及通過石墨烯的吸附 和高比表面特性來增加核酸分子之間的接觸，加速PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）過程并較少非特 異性擴(kuò)增的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 核酸擴(kuò)增是隨著人類遺傳學(xué)的發(fā)展，尤其是DNA雙鏈的發(fā)現(xiàn)而演變出來的一項(xiàng)極 具創(chuàng)新的技術(shù)。在1983年美國PE-Cetus公司的KaryMullis無意中產(chǎn)生了核酸擴(kuò)增的靈 感：在試管中模擬天然的DNA指數(shù)性復(fù)制過程。其基本原理是提供寡聚核苷酸引物、DNA聚 合酶、DNA模板以及緩沖體系等合適反應(yīng)體系，經(jīng)過DNA變性、復(fù)性、延伸，即可指數(shù)式擴(kuò)增 已知兩端序列的一段DNA分子。經(jīng)歷了耐熱聚合酶、熱循環(huán)儀器等的發(fā)明和進(jìn)步，在1987 年Cetus公司申請了第一個(gè)PCR相關(guān)發(fā)明專利（USPatent4,683,202)。
[0003]PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）由變性一退火一延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：待擴(kuò)增的模板DNA經(jīng)加熱至94°C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形 成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引 物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至54°C左右，引物與模板DNA單 鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：反應(yīng)溫度升至72°C左右，DNA模板-引物結(jié)合物在 耐熱DNA聚合酶作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，以靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù) 制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，不斷重復(fù)循環(huán)變性一退火一延 伸三過程，就可獲得更多的"半保留復(fù)制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。一 般情況下，每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘，2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬 倍。PCR技術(shù)不僅極大的促進(jìn)了基因克隆技術(shù)的發(fā)展，也提高了核酸檢測的靈敏度和效率， PCR已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程、測序、分子克隆、基因組工程、醫(yī)療、農(nóng)林、畜牧、環(huán)保、食品等 系列檢測領(lǐng)域，已經(jīng)成為二十一試劑生命科學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)。
[0004]采用市面上常用的核酸擴(kuò)增儀，PCR-次反應(yīng)過程大概需要2~3小時(shí)。這雖然 比當(dāng)初發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)時(shí)所用時(shí)間大大縮短了，但由于操作人員對于節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間的要求越 來越迫切，人們漸漸重視如何在不影響PCR檢測效率的情況下，減少PCR反應(yīng)時(shí)間的問題。 石墨烯（Graphene)的相關(guān)功能的研究為提高PCR效率提供了可能。PCR前期非特異性擴(kuò)增 較少，但是隨著目的基因的擴(kuò)增，非特異性擴(kuò)增同樣擴(kuò)增，如果能夠縮短PCR反應(yīng)時(shí)間，則 可大大減少非特異性擴(kuò)增，減少假陽性出現(xiàn)的可能性。
[0005] 石墨稀（Graphene)是最近十年余年來發(fā)現(xiàn)的極其重要的新材料，石墨稀狹義概 念是指由碳原子以sp2雜化軌道組成六角型蜂巢晶格結(jié)構(gòu)的只有一個(gè)碳原子厚度的二維 晶體。石墨烯層數(shù)呈正態(tài)分布，廣義石墨烯大多數(shù)是指多層石墨烯，如寡層石墨烯（3~5 層），多層石墨烯（10層左右）。英國曼徹斯特大學(xué)物理學(xué)家安德烈?海姆和康斯坦丁 ?諾沃 肖洛夫于2004年從石墨中分離出石墨烯，而且證實(shí)石墨烯可以單獨(dú)存在，兩人也因在"二 維石墨烯材料的開創(chuàng)性研究"共同獲得2010年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。石墨烯是良好的導(dǎo)體，不 但非常堅(jiān)硬而且導(dǎo)電性極佳，其電子迀移率可達(dá)200, 000cm2VS\電阻率可達(dá)106Ω· cm， 是世界上電阻率最小的材料，亦是極佳的常溫超導(dǎo)材料。石墨烯亦具有較好的生物兼容性 和吸附各種原子與分子的特性。
[0006] 核酸分子極其微小，其分子之間的相對距離較大，彼此離的較遠(yuǎn)，如果能夠增加核 酸分子之間的接觸，就能夠增加核酸擴(kuò)增的效率。由于石墨烯具有較好的生物兼容性，同時(shí) 具有吸附各種原子與分子和高達(dá)2600m2/g比表面的特性，石墨烯可吸附核酸分子，并進(jìn)一 步迅速分散至PCR反應(yīng)空間中，大大加速核酸分子之間的接觸面積和效率。而常規(guī)PCR反 應(yīng)僅僅通過高溫使核酸雙鏈分開，使其隨機(jī)結(jié)合而進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過石墨烯與核酸分子 的有機(jī)結(jié)合，大大縮短反應(yīng)時(shí)間，同時(shí)由于反應(yīng)時(shí)間縮短可減少PCR非特異性擴(kuò)增，確保結(jié) 果的可靠性。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 為了解決PCR反應(yīng)時(shí)間長以及由此帶來的非特異性擴(kuò)增問題，本發(fā)明"一種石墨 烯加速PCR技術(shù)"綜合了一種新材料石墨烯與PCR相結(jié)合的加速PCR過程的改良PCR技術(shù)， 利用石墨烯具有吸附和高比表面的特性，增加核酸分子之間的接觸面積和效率，大大縮短 了PCR反應(yīng)時(shí)間，讓科研和臨床檢驗(yàn)人員及時(shí)了解檢測結(jié)果，同時(shí)減少非特異性擴(kuò)增，提高 了檢測效率和準(zhǔn)確性。
[0008] -種石墨稀加速PCR技術(shù)，其特征是一種新材料石墨稀與PCR相結(jié)合的一種整合 的新性能加速核酸擴(kuò)增的改良PCR技術(shù)，利用石墨烯具有吸附和高比表面特性，在PCR反應(yīng) 體系中增加核酸分子之間的接觸，加速PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）過程并減少非特異性擴(kuò)增。 上述所述的PCR是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可被看作是生 物體外的特殊DNA復(fù)制過程。
[0009] -種石墨稀加速PCR技術(shù)，其特征在于所述的新材料石墨稀狹義概念是指由碳原 子以sp2雜化軌道組成六角型蜂巢晶格結(jié)構(gòu)的只有一個(gè)碳原子厚度的二維晶體，亦可采用 廣義石墨烯（多層）尤以10層以內(nèi)的多層石墨烯為佳，且具有較高的吸附和高比表面特性 的石墨稀。
[0010] -種石墨稀加速PCR技術(shù)，其特征在于所述的PCR其英文表述為Polymerase ChainReaction，其中文表述為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指提供寡聚核苷酸引物、DNA聚合酶、 DNA模板以及緩沖體系等合適反應(yīng)體系，經(jīng)過DNA變性、復(fù)性、延伸即可指數(shù)式擴(kuò)增已知兩 端序列的一段DNA分子的過程。
[0011] -種石墨烯加速PCR技術(shù)，其特征在于所述的石墨烯與PCR相結(jié)合的一種整合的 新性能加速核酸擴(kuò)增的改良PCR技術(shù)，可以在配制PCR反應(yīng)體系過程前、中、后根據(jù)具體溶 液特性加入適量的石墨烯，以縮短核酸擴(kuò)增時(shí)間，解決了PCR-次反應(yīng)時(shí)間過長（需要2~ 3小時(shí)）以及由此造成的非特異性擴(kuò)增的問題，能夠縮短PCR反應(yīng)時(shí)間，同時(shí)大大減少非特 異性擴(kuò)增的產(chǎn)生，減少假陽性出現(xiàn)的可能性，使在較短時(shí)間內(nèi)了解實(shí)驗(yàn)或檢測結(jié)果以及獲 得更可靠的數(shù)據(jù)成為可能。
[0012] -種石墨烯加速PCR技術(shù)，其特征在于核酸分子是指由許多核苷酸聚合成的生物 大分子化合物，是生命的最基本物質(zhì)之一，廣泛存在于所有動(dòng)植物細(xì)胞、微生物以及人工培 養(yǎng)或繁殖的細(xì)胞、器官、組織等或其他生命體體內(nèi)，核酸根據(jù)化學(xué)組成不同分為脫氧核糖核 酸（DNA)和核糖核酸（RNA)以及RNA與DNA結(jié)合的雜交分子或是反應(yīng)體系中的DNA單鏈、RNA單鏈。DNA是儲(chǔ)存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。RNA主要有tRNA、mRNA、rRNA以 及MicroRNA等：RNA在蛋白質(zhì)合成過程中起著重要作用-其中轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸，簡稱tRNA， 起著攜帶和轉(zhuǎn)移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，簡稱mRNA，是合成蛋白質(zhì)的模板；核糖 體的核糖核酸，簡稱rRNA，是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的主要場所。
[0013] -種石墨烯加速PCR技術(shù)，其特征在于增加核酸分子之間的接觸是指通過石墨烯 吸附、分散核酸分子，以增加核酸分子之間的接觸概率，提高核酸擴(kuò)增效率。
[0014] -種石墨烯加速PCR技術(shù)，其特征在于在配制好的PCR反應(yīng)液液面之上，加入礦 物油或液體石蠟封閉隔絕外界環(huán)境，并使dUTP代替dTTP底物，同時(shí)在PCR體系加入尿嘧 啶-DNA糖基化酶（UDG酶）消化微量氣霧膠污染。聯(lián)合采用PCR緩釋某一或多種成分熱啟 動(dòng)方