單細(xì)胞定位微孔膜及應(yīng)用和單細(xì)胞自動(dòng)化獲取裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于稀有細(xì)胞檢測領(lǐng)域，具體涉及一種從細(xì)胞懸液中獲取單個(gè)細(xì)胞的微孔 膜，及采用該微孔膜獲取單個(gè)細(xì)胞的方法，還涉及一種單細(xì)胞自動(dòng)化獲取裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 單細(xì)胞分析已成為生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，它能夠揭示異質(zhì)性較大細(xì)胞群體的 分子特征，特別是一些數(shù)量極其稀少，卻具有重要生物學(xué)功能或臨床檢測意義的細(xì)胞，如人 外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、被病毒感染的細(xì)胞，孕婦外周血中來自胎兒的有 核紅細(xì)胞，以及少量實(shí)體腫瘤樣本中的腫瘤干細(xì)胞等，對(duì)其的捕獲和檢測分析意義就更為 重大了。但是如何可靠獲取單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，尤其針對(duì)數(shù)目極少的稀有細(xì)胞，無疑是目前 技術(shù)上的瓶頸。
[0003] 這些稀有細(xì)胞在進(jìn)一步分析之前往往需要加以富集，但即使在富集之后，這些稀 有細(xì)胞的數(shù)目仍然極少且存在一定量其他的干擾細(xì)胞，需要一種可靠且自動(dòng)化程度較高方 法能夠?qū)⑦@些珍貴的細(xì)胞一一取出并進(jìn)行分析。
[0004] 對(duì)單個(gè)細(xì)胞的操縱是屬于對(duì)單細(xì)胞分析前的樣本準(zhǔn)備過程，要求將目標(biāo)細(xì)胞從背 景樣本中分離出來然后運(yùn)送至指定位置或處于指定環(huán)境中以便于下一步的單細(xì)胞分析。一 個(gè)典型的應(yīng)用場景是經(jīng)過富集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞樣本中含有80個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，500個(gè)白細(xì) 胞，其中循環(huán)腫瘤細(xì)胞與白細(xì)胞可以通過針對(duì)細(xì)胞膜表面蛋白的免疫熒光染色來區(qū)分，為 了從單細(xì)胞尺度上研究循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分子特征，需要將80個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞一一取出并 分別進(jìn)行細(xì)胞裂解、基因組擴(kuò)增以及靶基因的測序。
[0005] 目前已有多種單細(xì)胞操縱的方法，常見的是通過顯微操作儀、激光顯微切割或光 鑷來獲取靶細(xì)胞，能夠?qū)ι倭考?xì)胞樣本進(jìn)行處理，但自動(dòng)化程度低、操作時(shí)間長，需要訓(xùn)練 有素的操作人員且操作過程中細(xì)胞存在一定的損失率。流式細(xì)胞儀是另一種常見的細(xì)胞分 選設(shè)備，能夠?qū)⒓?xì)胞逐個(gè)分到比如96孔板中的各個(gè)孔內(nèi)，但這一技術(shù)的不足之處是其無法 處理較少數(shù)目的細(xì)胞，難以對(duì)只含有幾百甚至幾十個(gè)細(xì)胞的樣本進(jìn)行可靠的分選。
[0006] 微流控芯片是一種操控微量液體流動(dòng)的芯片技術(shù)，非常適用于微量液體生物 樣本、少量細(xì)胞的操作與分析，且易于自動(dòng)化并能夠?qū)崿F(xiàn)多項(xiàng)功能或模塊的整合。比如 Fluidigm公司的C1?單細(xì)胞自動(dòng)前處理系統(tǒng)（Single-CellAutoPrepSystem)，通過微 流控芯片上設(shè)計(jì)精巧的幾何結(jié)構(gòu)將單個(gè)細(xì)胞滯留在指定位置從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的捕獲。每塊 芯片有96個(gè)捕獲單元，當(dāng)單個(gè)細(xì)胞被捕獲后可以隨即進(jìn)行芯片上的細(xì)胞裂解，核酸擴(kuò)增等 步驟，完成整個(gè)單細(xì)胞操縱與處理過程，所獲得的來自單細(xì)胞的核酸可轉(zhuǎn)移至該公司的另 一款設(shè)備進(jìn)行分析以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的基因分析。但是，這一系統(tǒng)仍然不太適合極少數(shù)目細(xì)胞 的操縱，原因在于其操縱準(zhǔn)確率低，從而靶細(xì)胞損失率較高，且無法處理混有除靶細(xì)胞以外 其他細(xì)胞的樣本，同時(shí)用于分選單個(gè)細(xì)胞的微流控芯片價(jià)格昂貴。另一種對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行 操縱的方式是在芯片外施加不均一的電場，從而將不同細(xì)胞移動(dòng)至特定位置，比如Silicon Biosystems公司的DEPArray?系統(tǒng)可以操縱可移動(dòng)的介電泳講從細(xì)胞群體取出特定的單 個(gè)細(xì)胞，雖然操縱準(zhǔn)確，細(xì)胞損失率低，但其操作時(shí)間較長，通量很低，且該系統(tǒng)價(jià)格極其昂 貴，難以裝備一般實(shí)驗(yàn)室，更加無法應(yīng)用于臨床，普及性差。
[0007] 綜述所述，現(xiàn)有技術(shù)中用于單細(xì)胞操縱裝置的優(yōu)缺點(diǎn)匯總于表1。
[0008]表1
[0009]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了一種從細(xì)胞懸液中獲取單個(gè)細(xì)胞的微孔膜，及采用該微孔膜獲取單 個(gè)細(xì)胞的方法，用以解決傳統(tǒng)稀有細(xì)胞檢測中的單細(xì)胞提取準(zhǔn)確度低，損失率高，周期長的 問題。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種單細(xì)胞自動(dòng)化獲取裝置，用以解決目前獲取裝置自動(dòng)化程度 低或設(shè)備成本過高，不利于普及的問題。
[0012] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：所述單細(xì)胞定位微孔膜，包括開設(shè) 有若干通孔的多孔膜和覆蓋所述通孔的濾膜，所述通孔內(nèi)濾膜上設(shè)有至少一個(gè)微孔，所述 微孔直徑為3-8μm，優(yōu)選5μm，所述濾膜的厚度為0. 5-2μm，優(yōu)選1μm。5微米的孔徑小于 絕大部分的稀有細(xì)胞，如血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，孕婦血液中的胎兒有核紅 細(xì)胞，以及胸腔積液、腦脊液等體液中的游離腫瘤細(xì)胞，因此5微米的微孔可以截留細(xì)胞懸 液中以上這些稀有細(xì)胞，另外〇. 5-2μm厚度的濾膜一方面可以保證成功截留，另一方面在 定位回收時(shí)可以較容易戳破。
[0013] 優(yōu)選的是，所述多孔膜的材質(zhì)為硅，所述濾膜的材質(zhì)為氮化硅。氮化硅材質(zhì)較脆， 既能保證細(xì)胞的承載，又容易被利器打破。
[0014] 優(yōu)選的是，所述多孔膜上通孔呈陣列分布，數(shù)量為10000-100000個(gè)。如果細(xì)胞懸 液中細(xì)胞的數(shù)目遠(yuǎn)小于濾膜上通孔的數(shù)目（超過10000個(gè)），根據(jù)泊松分布可知，在每個(gè)微 孔上的基本都是單個(gè)細(xì)胞，陣列分布的通孔，坐標(biāo)容易確定，從而使落入通孔內(nèi)的單細(xì)胞坐 標(biāo)確定，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞快速準(zhǔn)確定位。
[0015] 優(yōu)選的是，所述多孔膜上的通孔直徑為20-100μm，優(yōu)選70μm。多孔膜的直徑，一 方面要能夠在單位面積中容納盡量多的孔，另一方面要保證后續(xù)破除濾膜時(shí)，機(jī)械器件可 以戳破膜的通知不會(huì)碰到其中的細(xì)胞。
[0016] 本發(fā)明還提供了采用上述單細(xì)胞定位微孔膜進(jìn)行單細(xì)胞定性并獲取的方法，其包 括如下步驟：
[0017] 1)將樣品施于所述單細(xì)胞定位微孔膜上，樣品中細(xì)胞落入所述通孔內(nèi)，被所述濾 膜截留，至此各個(gè)細(xì)胞坐標(biāo)通過通孔位置得以確定；
[0018] 2)通過顯微鏡明場成像或熒光素標(biāo)記細(xì)胞并成像確定各通孔內(nèi)細(xì)胞類別，從而確 定了目標(biāo)細(xì)胞位置；
[0019]3)將容器置于所述單細(xì)胞定位微孔膜下方，排除目標(biāo)細(xì)胞所處通孔內(nèi)濾膜的阻 擋，使其落入所述容器內(nèi)，完成目標(biāo)細(xì)胞的收集。
[0020] 細(xì)胞懸液中截留的稀有細(xì)胞，可以通過顯微鏡的明場成像觀察到，如果細(xì)胞懸液 中還存在其他種類的細(xì)胞，可以在濾膜上直接通過針對(duì)細(xì)胞膜表面特異性蛋白的免疫熒光 染色將不同種類區(qū)分開。比如，細(xì)胞懸液中同時(shí)存在非小細(xì)胞肺癌的腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞，這 些細(xì)胞在被濾膜截留后，可以用FITC熒光素標(biāo)記的白細(xì)胞抗原CD45的抗體（顯微鏡下為 綠色），以及APC熒光素標(biāo)記的上皮標(biāo)志物EpCAM和EGFR的抗體（顯微鏡下為紅色）來對(duì) 細(xì)胞進(jìn)行染色，然后在顯微鏡下將顯示較強(qiáng)紅色熒光、不顯示綠色熒光的細(xì)胞認(rèn)定為腫瘤 細(xì)胞，將顯示較強(qiáng)綠色熒光、不顯示紅色熒光的細(xì)胞認(rèn)定為白細(xì)胞。
[0021] 優(yōu)選的是，所述目標(biāo)細(xì)胞為血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、胎兒有核紅細(xì) 胞、體液中的游離腫瘤細(xì)胞和/或白細(xì)胞。
[0022] 優(yōu)選的是，所述容器收集到目標(biāo)細(xì)胞后進(jìn)一步在其中進(jìn)行細(xì)胞裂解和單細(xì)胞全基 因組放大。經(jīng)過簡單處理后可用于后續(xù)的目的基因擴(kuò)增，進(jìn)行一系列檢測。
[0023]本發(fā)明還提供了一種單細(xì)胞自動(dòng)化獲取裝置，包括支架、設(shè)置在支架上的破膜機(jī) 構(gòu)、位于所述破膜機(jī)構(gòu)下方的第一平臺(tái)和設(shè)置在所述破膜機(jī)構(gòu)和所述第一平臺(tái)之間的第二 平臺(tái)，所述第一平臺(tái)和第二平臺(tái)在XY向平面平移，所述破膜機(jī)構(gòu)在Z向豎直運(yùn)動(dòng)，所述第一 平臺(tái)上設(shè)置容器，所述第二平臺(tái)上設(shè)置上述單細(xì)胞定位微孔膜。
[0024] 優(yōu)選的是，所述容器為微孔板。比如96孔板或384孔板。
[0025] 優(yōu)選的是，所述破膜機(jī)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)精度為0· 1-10ym，優(yōu)選5μm，所述第二平臺(tái)的運(yùn) 動(dòng)精度為〇· 1-5μm，優(yōu)選1μm，所述第一平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)精度為0· 1-10μm，優(yōu)選5μm。
[0026] 優(yōu)選的是，所述單細(xì)胞自動(dòng)化獲取裝置還包括顯微鏡。
[0027]優(yōu)選的是，所述破膜機(jī)構(gòu)包括第三平臺(tái)和固定在第三平臺(tái)上破膜針，所述第三平 臺(tái)沿Z向運(yùn)動(dòng)。
[0028]本發(fā)明提供的技術(shù)方案中細(xì)胞懸液中的單細(xì)胞落入單細(xì)胞定位微孔膜中的各通 孔中，而又被濾膜截獲，對(duì)各通孔中單細(xì)胞進(jìn)行鑒別，其中目標(biāo)細(xì)胞因通孔可尋址從而完成 定位，然后將目標(biāo)細(xì)胞所處通孔移至收納容器上方，將濾膜刺破，目標(biāo)細(xì)胞落入容器內(nèi)。該 微孔膜、方法和裝置可準(zhǔn)確、可靠、自動(dòng)完成目標(biāo)單細(xì)胞獲取，能夠處理極少數(shù)目細(xì)胞的樣 本，能夠?qū)崿F(xiàn)極低的靶細(xì)胞損失率，能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化操作，同時(shí)裝置的成本明顯低于其他現(xiàn) 有設(shè)備。
【附圖說明】
[0029] 圖1是本發(fā)明所述單細(xì)胞自動(dòng)化獲取裝置一【具體實(shí)施方式】的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0030]圖2是本發(fā)明所述單細(xì)胞定位微孔膜一【具體實(shí)施方式】的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031]圖3是本發(fā)明所述多孔膜和濾膜一【具體