專利名稱：長(zhǎng)效干擾素融合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。具體涉及一種用于治療病毒性感染疾病和腫瘤以及細(xì) 胞增殖性疾病的重組長(zhǎng)效同源干擾素(ClFN)-人蛋白結(jié)合肽(ABP)融合蛋白，及其用途。
背景技術(shù)：
人們?cè)缙谠谘芯坎《镜母蓴_現(xiàn)象(virus interference)時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種作為抗病 毒物質(zhì)的蛋白稱之為干擾素(interferon)。1957年Isaacs和Lindenmann證明流感病毒 感染的雞細(xì)胞可分泌一種可溶性因子介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)同源和異源病毒都產(chǎn)生抵抗作用。1958年 Nagano和Kojima也觀察并得到了相似的結(jié)果。這些都為后來(lái)更詳細(xì)地闡明生物機(jī)體干擾 素系統(tǒng)打下了早期的基礎(chǔ)。1970年代，從白細(xì)胞中純化出干擾素蛋白才使得干擾素真正可 用于研究用途。1980年，由于成功用基因工程方法可獲得大量純化干擾素制劑，這樣人們能 夠用干擾素對(duì)病毒感染疾病和腫瘤患者進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)和治療。干擾素是由一組誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子組成的多基因家族蛋白。干擾素具有廣泛作 用，它可調(diào)控包括病毒增殖等一系列生物學(xué)功能。干擾素通常分為兩種1型干擾素，也稱 病毒干擾素(Viral IFNs)，包括α -干擾素(白細(xì)胞干擾素)和β _干擾素(成纖維細(xì)胞 干擾素)，以及ω-干擾素。II型干擾素也稱免疫干擾素(Y-干擾素)。病毒干擾素由病 毒感染誘導(dǎo)生成。II型干擾素則由促有絲分裂或抗原刺激誘導(dǎo)生成。大部分病毒感染的細(xì) 胞在培養(yǎng)中可合成α/β-干擾素。然而Y-干擾素只能由免疫系統(tǒng)的活性細(xì)胞合成之，包 括自然殺傷細(xì)胞(NK)，OTfTh1細(xì)胞以及⑶8+胞毒/抑制性T細(xì)胞。人體有許多病毒干擾素編碼基因，包括14種α-干擾素基因，1種β-干擾素和1 種ω-干擾素基因。它們都不含內(nèi)含子(intron)，它們?cè)谌说牡?號(hào)染色體短臂排列在一 起。小鼠則在它的4號(hào)染色體相應(yīng)區(qū)域。Y -干擾素只有1種，它具有3個(gè)內(nèi)含子，它位于人 的第12號(hào)染色體長(zhǎng)臂；小鼠則為第10號(hào)染色體。盡管一些干擾素在機(jī)體內(nèi)可經(jīng)過(guò)一些翻譯 后的修飾諸如N-和0-糖基化修飾，但主要的人α -干擾素沒(méi)有被糖基化。α -干擾素主要 以單體發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，而β-干擾素和Y-干擾素則以同源二聚源體形式起作用。現(xiàn)在 還不知道人體為什么會(huì)有這么多α _干擾素基因。當(dāng)用基因敲除(gene knock-out)方法除 去小鼠單個(gè)β-干擾素基因，產(chǎn)生的小鼠則對(duì)病毒感染十分敏感，這說(shuō)明眾多的α-干擾素 基因并不能補(bǔ)償干擾素基因的作用，干擾素在抗病毒感染過(guò)程中有其獨(dú)特的作用。 由于在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)干擾素進(jìn)行了大量成功的基礎(chǔ)研究，這才有了后來(lái)干擾素在臨床治療中 的應(yīng)用。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)三種干擾素α _，β -和Y-干擾素作為臨床治療藥物。對(duì)于α -干 擾素用于最廣泛的病毒感染性疾病包括乙型和丙型肝炎。此外，α-干擾素還被批準(zhǔn)用于 Kaposi氏肉瘤、性病皰疹、毛細(xì)胞性白血病、慢性髓性白血病和惡性骨髓瘤的治療。β-干 擾素被批準(zhǔn)用于多發(fā)性硬化復(fù)發(fā)后的治療。Y“干擾素則被批準(zhǔn)用于慢性遺傳性免疫紊亂 (慢性腎小球疾病)的治療。有數(shù)家生物制藥公司生產(chǎn)治療用的干擾素藥物。Hoffman-La Roche公司生產(chǎn)商品名為RoferonA的干擾素-α 2a ；Schering公司生產(chǎn)商品名為Intron A 的干擾素-a 2b ；Amgen公司生產(chǎn)商品名Infergen的同源干擾素；Interferon Sciences公司生產(chǎn)了商品名為Alferon N的由人白細(xì)胞制備而成的干擾素-α N3 ；Glaxo Wellcome公 司生產(chǎn)了商品名為Avonex、Chiron公司商品名為Betaseron的β -干擾素。Genentech公 司生產(chǎn)了商品名Actimmune的γ-干擾素。2001年1月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了 Schering公司生 產(chǎn)的商品名PEG-Intron的聚乙二醇化干擾素-α 2b用于治療此前未接受過(guò)干擾素治療的 慢性丙型肝炎病人。Roche也生產(chǎn)聚乙二醇化得干擾素-a 2a(商品名為Pegasys)用于治 療慢性丙型肝炎病人。同源干擾素(Consensus Interferen，cIFN)是一個(gè)全合成的I型干擾素。通過(guò) 分析比較14種天然α-干擾素亞型蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)，選取不同亞型相應(yīng)每一位置上最常出 現(xiàn)的氨基酸組成一新的蛋白質(zhì)序列(即同源序列)從而得到一全新的同源干擾素。已經(jīng)比 較了同源干擾素與天然干擾素在抗病毒、抗細(xì)胞增殖、激活NK細(xì)胞活性、細(xì)胞因子誘導(dǎo)以 及干擾素刺激基因表達(dá)活性方面的作用。在所有這些作用方面，與干擾素- a 2a和- α 2b 相比較，同源干擾素作用都較二者強(qiáng)。這可能是由于細(xì)胞表面I型干擾素受體組成對(duì)同 源干擾素較α-干擾素親和力較高的原因。相反，在誘導(dǎo)白介素生成方面同源干擾 素較α-干擾素弱。這些結(jié)果也可能反映了與I型干擾素受體相互作用的多種協(xié)同蛋白 (accessery proteins)不同結(jié)合作用的結(jié)果。這些獨(dú)特的生物學(xué)特性使得同源干擾素比天 然產(chǎn)生和重組天然干擾素在臨床治療上有明顯優(yōu)勢(shì)。臨床試驗(yàn)證明同源干擾素可用于治療一系列疾病包括慢性病毒感染和某些惡性 腫瘤。在多個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行的各種安全和有效性實(shí)驗(yàn)中對(duì)同源干擾素和淋巴細(xì)胞源性 α-干擾素IFN-α (NAMALWA)治療感染了高滴度丙肝病毒慢性的肝炎患者進(jìn)行了比較。 在不增加額外毒性作用的情況下同源干擾素(18MIU)的有效性明顯優(yōu)于IFN-α (NAMALWA) (9MIU)；特別是當(dāng)患者干擾了基因型為Ib的病毒時(shí)效果更為顯著。同源干擾素能安全、有 效地作用于治療慢性丙型肝炎病人以及常規(guī)干擾素治療失敗和治療后復(fù)發(fā)的患者。近來(lái)同 源干擾素也與其它抗肝類化學(xué)藥物如ribavirin —起合用于治療慢性丙型肝炎病人。同源 干擾素也成功地用于了乙型肝炎病人的治療。然而，干擾素治療與許多蛋白藥物一樣有明顯不足之處就是血液中的半衰期短， α-干擾素注射入機(jī)體后迅速被清除之。在這種短循環(huán)半衰期條件下，為了達(dá)到有效地治 療效果，往往采用多效量(每日或每周三次)長(zhǎng)時(shí)間用藥(6-12個(gè)月或更長(zhǎng))。為了改善 α -干擾素的藥代動(dòng)力學(xué)，減少用藥頻率。有些制藥公司將α -干擾素與-12-KDa或30-KDa 大小的聚乙二醇分子結(jié)合在一起制備了一種半合成型的干擾素藥物(Pegglated IFN)。這 種聚乙二醇化干擾素分子可使α-干擾素在體內(nèi)作用時(shí)間延長(zhǎng)，有其正面臨床治療效果。 對(duì)聚乙二醇化干擾素的物理化學(xué)和生物學(xué)特性進(jìn)行研究揭示了這種半合成干擾素分子特 異的抗病毒活性與結(jié)合的聚乙二醇分子的組成和結(jié)合位置明顯相關(guān)。這種聚乙二醇化作用 可降低α-干擾素的特異性生物學(xué)比活。白蛋白(分子量為約67KDa)是血液中最豐富的蛋白質(zhì)，濃度為50mg/ml (600um)。 在人類半衰期為19天。白蛋白的功能包括維持血漿PH值，膠體滲透壓，使送代謝產(chǎn)物、脂肪 酸等。并且它可作用血漿中的主要藥物載體蛋白。人白蛋白(HSA)的長(zhǎng)半衰期及穩(wěn)定性使 其提供了一種理想的載體與一些短效治療蛋白組成融合分子。將葡萄球菌G蛋白的白蛋白 結(jié)合功能區(qū)與人的補(bǔ)體受體-1組成融合蛋白可使后者在大鼠體內(nèi)半衰期增加3倍達(dá)5小 時(shí)。將α-干擾素與白蛋白融合產(chǎn)生一種全新的融合蛋白分子。人類基因組公司將β-干擾素與HSA編碼基因串聯(lián)在一起從而表達(dá)出一種二者融合蛋白(Albuferon-β).這種重組 融合蛋白具有抗病毒和抗細(xì)胞增殖活性，可啟動(dòng)干擾素刺激應(yīng)答元件(ISRE)介導(dǎo)的信號(hào) 傳導(dǎo)作用。然而，這種融合蛋白的特異性生物學(xué)活性比活仍比α-干擾素低。這可能是由 于HSA與干擾素分子共價(jià)融合在一起時(shí)可影響后者的空間構(gòu)象。與白蛋白非共價(jià)結(jié)合已證明也能延長(zhǎng)一些短效蛋白的半衰期。但目前沒(méi)有關(guān)于 干擾素的相關(guān)研究，而且如何進(jìn)行實(shí)干擾素與白蛋白進(jìn)行有效的非共價(jià)結(jié)合目前也是未知 的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是在延長(zhǎng)干擾素的體內(nèi)半衰期的同時(shí)還能盡可能地保 持其活性。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是提供一種長(zhǎng)效干擾素融合蛋白。該長(zhǎng) 效干擾素融合蛋白是由干擾素的C末端通過(guò)一段連接肽連接人白蛋白特異性親和短肽 (HSA-BP)而成。優(yōu)選的，上述長(zhǎng)效干擾素融合蛋白中的干擾素為同源干擾素。其中，上述同源干擾素的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示。H2N-MCDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQT FNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSIIAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAW EVVRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKE-COOH(SEQ ID NO. 1)。其中，上述長(zhǎng)效干擾素融合蛋白中的人白蛋白特異性親和短肽(HSA-BP)的氨基 酸序列為SEQ ID NO. 2所示。H2N-SQRLMEDICLPRffGCLffEDDF-COOH(SEQ ID NO. 2)。其中，上述長(zhǎng)效干擾素融合蛋白的其氨基酸序列為SEQ ID NO. 3所示。H2N-MCDLPQTHSLGNRRALILLAQMRRISPFSCLKDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAQAISVLHEMIQQT FNLFSTKDSSAAWDESLLEKFYTELYQQLNDLEACVIQEVGVEETPLMNVDSIIAVKKYFQRITLYLTEKKYSPCAW EVVRAEIMRSFSLSTNLQERLRRKEGGGSQRLMEDICLPRffGCLffEDDF-COOH(SEQ ID N0. 3)。其中的干擾素的C末端和人白蛋白特異性親和短肽HSA-BP之間的連接肽的氨基 酸序列為GGG。本發(fā)明在提供上述長(zhǎng)效干擾素融合蛋白的同時(shí)，也提供了編碼上述的長(zhǎng)效干擾素 融合蛋白的核苷酸序列。進(jìn)一步的，編碼本發(fā)明長(zhǎng)效干擾素融合蛋白的核苷酸序列為SEQ ID N0. 4所示。ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCCTGCTGGCTCAGATGCGT CGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAAGAATTCGACGGTAACCAGTT CCAGAAAGCTCAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTCAACCTGTTCTCCACCAAAGACTCCT CCGCTGCTTGGGACGAATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGC GTTATCCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCA GCGTATCACCCTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGGAAGTTGTTCGTGCTGAAATCATGCGTT CCTTCTCCCTGTCCACCAACCTGCAGGAACGTCTGCGTCGTAAAGAAGGCGGTGGCTCTCAGCGTCTGATGGAAGAT ATCTGCCTGCCGCGTTGGGGCTGCCTGTGGGAAGATGATTTCTAA(SEQ ID N0. 4)。
本發(fā)明還提供了含有權(quán)利要求6或7所述的核苷酸序列的載體。本發(fā)明還提供了含有權(quán)利要求6或7所述的核苷酸序列的宿主細(xì)胞。同時(shí)，本發(fā)明還提供了上述長(zhǎng)效干擾素融合蛋白在制備治療抗病毒藥物或抗腫瘤 藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種治療抗病毒藥物或抗腫瘤藥物，該抗病毒藥物或抗腫瘤藥物 是以上述長(zhǎng)效干擾素融合蛋白為主要活性成分添加藥學(xué)上可接受的輔助性成分制備而成 的。采用高通量篩選方法(HTS)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)短肽(HSA-BP)能選擇性地與人白蛋白進(jìn) 行高親和力結(jié)合。本發(fā)明設(shè)計(jì)和合成了這一短肽的DNA編碼序列，將其與干擾素的編碼序 列通過(guò)一甘氨酸鏈編碼序列鏈接在一起，從而編碼干擾素-HSA-BP融合蛋白。HSA-BP位于 干擾素的C-末端。將這一融合蛋白的編碼序列克隆到大腸桿菌高效表達(dá)載體中去，可通過(guò) 含有表達(dá)載體的大腸桿菌高效表達(dá)干擾素-HSA-BP(cIFN-HSA-BP)融合蛋白。采用生化分 離純化方法從大腸桿菌裂解物中得到高純度的cIFN-HSA-BP融合蛋白。體外實(shí)驗(yàn)證明該融 合蛋白與同源干擾素有相同的抗病毒和抗細(xì)胞增殖作用。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明融合蛋白注射到小鼠體內(nèi)其半衰期比單用ClFN延長(zhǎng)12倍。這 說(shuō)明cIFN-ABP融合蛋白在具有干擾素的抗病毒、抗細(xì)胞增殖生物學(xué)活性同時(shí)，它在體內(nèi)的 半衰期顯著延長(zhǎng)，從而其臨床治療作用比干擾素本身有明顯的優(yōu)勢(shì)。


圖1、0. 7KB大小的cIFN-GGG-ABP編碼DNA片段的凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果圖。圖 2、凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果圖。Lane 1 :1KD DNA ladder marker (1 μ g/ΙΟμ 1) ,Lane 2 :pBAD-cIFN 質(zhì)粒 Nhel+SphI 酶切物 20 μ 1，Lane 3 :pBAD_cIFN 質(zhì)粒 Xbal+SacI 酶切物 20 μ 1，Lane 4 禾口 5 =PCRI I 反應(yīng)產(chǎn)物 20 μ 1。圖3、凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果圖。l:lkb DNA ladden Marker (1 μ g/10 μ 1) ;2 集落 ISacI+xbal酶的結(jié)果；3 集落2SacI+xbaI酶的結(jié)果；4 集落3SacI+xbaI酶的結(jié)果；5 集 落4SacI+xbaI酶的結(jié)果；6 集落5SacI+xbaI酶的結(jié)果。圖4、pBAD-cIFN的ECoRV酶切凝膠電泳結(jié)果圖。1 :ECoRV酶切后的pBAD-cIFN質(zhì) 粒；2 未經(jīng)酶切的 pBAD-cIFN 質(zhì)粒；3 =Ikb DNA Ladder marker (1 μ g/10 μ 1)。結(jié)果顯示， ECoRV酶切可使pBAD-cIFN質(zhì)粒線性化。圖 5、pBAD-cIFNm 的酶切結(jié)果圖 1 :lkb DNA ladder make (1 μ/10 μ 1) ；2 pBAD-cIFNm#l質(zhì)粒經(jīng)ECORV酶切；3 :pBAD_cIFNm#l質(zhì)粒Sacl+Xba雙酶切；4 =PCR-Blunt II Topo-cIFN 質(zhì)粒經(jīng) Sacl+Xbal 雙酶切。圖6、生產(chǎn)純化過(guò)程的免疫印跡(Western Blot)鑒定圖1、未用L-阿拉伯糖誘導(dǎo) 的細(xì)菌裂解液；2、L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解液；3、過(guò)Q-Siipharose柱的樣品；4最后純 化完成的蛋白。圖7、WeStern blot免疫印跡結(jié)果圖。第1道為重組cIFN-ABP可被人白蛋白抗體 與人血清白蛋白一起免疫共沉淀下來(lái)，第2道為重組cIFN，沒(méi)有發(fā)生免疫共沉淀。圖8、重組cIFN-ABP融合蛋白與其它的動(dòng)物血清白蛋白結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果。1人白蛋 白做對(duì)照；2 犬白蛋白；3 大鼠白蛋白；4 猴子白蛋白；5 家兔白蛋白；6 :小鼠白蛋白。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖通過(guò)具體實(shí)施式進(jìn)一步說(shuō)明但不限定本發(fā)明。實(shí)施例一重組cIFN-ABP蛋白編碼基因的獲得及其高效表達(dá)工程菌的構(gòu)建人工化學(xué)合成ClFN編碼基因序列，并克隆到PBAD18質(zhì)粒載體中(購(gòu)自英俊公 司 Invitrogen, Carlsbad, USA,其序列參見 J. Bacteriol. 177，4121-4130 (1995))，得到 pBAD-cIFN。首先以該質(zhì)粒中的cIFN編碼序列為模板，用PCR方法在其C-末端加入人白蛋白 特異性親和短肽(HSA-BP，簡(jiǎn)稱ABP)編碼序列及連接序列。PBAD18質(zhì)粒是大腸桿菌高效表 達(dá)質(zhì)粒。cIFN編碼序列是克隆到該質(zhì)粒的XbaI和SacI酶切位點(diǎn)處。因此，用PCR方法分 2步加入ABP、連接肽以及酶切位點(diǎn)的編碼序列以便其cIFN-ABP融合蛋白編碼序列能夠重 新克隆到該P(yáng)BAD18表達(dá)載體中去高效表達(dá)。 PCR反應(yīng)I 在cIFN編碼序列C末端引入連接肽(GGG)及ABP (SQRLMEDICLPRff GCLWEDDF)的編碼序列，在0. 2mlPCR管中加入下列成分混勻之
dH2062μ1
5 X HF緩沖液20μ1
10 mM dNTP2μ1
50 mM MgCl24μ1
20 mM pBAD 上游引物(SEQ IDNO. 5) 5μ1
20 mM ABP 編碼下游引物(SEQID NO. 8) 5μ1
pBAD-cIFN 質(zhì)粒( μβ/5μ1) μ
Phusion DNA 聚合酶(2ιι/μ1) μ PCR反應(yīng)周期為I :98°C 2 分鐘11:25 個(gè)周期
權(quán)利要求
長(zhǎng)效干擾素融合蛋白，其特征在于由干擾素的C末端通過(guò)連接肽連接人白蛋白特異性親和短肽HSA BP而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)效同源干擾素融合蛋白，其特征在于所述的干擾素為同 源干擾素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長(zhǎng)效同源干擾素融合蛋白，其特征在于所述的同源干擾素 的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長(zhǎng)效同源干擾素融合蛋白，其特征在于所述的人白蛋白特 異性親和短肽的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4任一項(xiàng)所述的長(zhǎng)效干擾素融合蛋白，其特征在于其氨基酸 序列為SEQ ID N0.3所示，其中的干擾素的C末端和人白蛋白特異性親和短肽HSA-BP之間 的連接肽的氨基酸序列為GGG。
6.編碼權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的長(zhǎng)效干擾素融合蛋白的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的編碼長(zhǎng)效干擾素融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于其序 列為SEQ ID NO. 4所示。
8.含有權(quán)利要求6或7所述的核苷酸序列的載體。
9.含有權(quán)利要求6或7所述的核苷酸序列的宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的長(zhǎng)效干擾素融合蛋白在制備治療抗病毒藥物或抗腫 瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域。具體涉及一種重組長(zhǎng)效干擾素融合蛋白及其用途。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提高干擾素的體內(nèi)作用時(shí)間。解決該問(wèn)題的技術(shù)方案是提供一種融合蛋白。該融合蛋白由N-端的干擾素和C-末端的人白蛋白結(jié)合肽以及鏈接二者之間的甘氨酸鏈接肽所組成。該蛋白可在大腸桿菌中高效表達(dá)，而且純化工藝簡(jiǎn)單，可用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)制備藥物級(jí)的rcIFN-ABP融合蛋白純品。與重組同源干擾素(rcIFN)本身相比較，本發(fā)明所獲得的rcIFN-ABP融合蛋白具有血清半衰期更長(zhǎng)的特點(diǎn)。同時(shí)其特異性抗病毒比活性與cIFN相當(dāng)。該rcIFN-ABP融合蛋白可用于治療病毒感染性疾病，諸如艾滋病、肝炎、SARS、禽流感等；同時(shí)也可用于腫瘤以及其它細(xì)胞增殖性疾病的治療。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101942026SQ201010507000
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者吳炯, 易興旺, 白敏 申請(qǐng)人:成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司