一株高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，簡稱G0D，E.C.1.1.3.4)是一種黃素糖蛋白，在有氧條件下能專一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。G0D廣泛分布于動植物和微生物體內(nèi)。由于微生物生長繁殖快、來源廣，是生產(chǎn)G0D的主要來源，主要生產(chǎn)菌株為黑曲霉和青霉。目前G0D的應用領(lǐng)域不斷拓展，國內(nèi)外市場需求量急劇增加。目前G0D的應用領(lǐng)域不斷拓展，國內(nèi)外市場需求量急劇增加。目前G0D基因已經(jīng)在畢赤酵母GS115、大腸桿菌、瑞氏木霉等中得到表達，但還未見其在非常規(guī)酵母解脂耶氏酵母中進行表達研究，而解脂耶氏酵母被認為是安全的，因此，能用于食品和藥物生產(chǎn)上。
[0003]解脂耶氏酵母Pold菌系中，編碼能水解其它蛋白質(zhì)的AEP基因被剔除，使得外源蛋白能更好地表達。人們將Pold系改造，生成一系列的派生菌系，如Polh、Polg、Polf。Polh、Polg在Pold系基礎(chǔ)上進行改造，只有一個營養(yǎng)缺陷型基因。Polg被改造為適合以PBR322為基礎(chǔ)的質(zhì)粒整合的菌系，Polh將穿梭質(zhì)粒的細菌部分在整合入酵母前剔除掉，形成酵母框。它們在Pold系的基礎(chǔ)上均被剔除了酸性蛋白酶基因，消除了全部蛋白酶活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，所述解脂耶氏酵母于2015年12月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為 CCTCC NO:M 2015736。
[0005]所述解脂耶氏酵母可利用蔗糖等廉價碳源，適合高密度發(fā)酵，而且解脂耶氏酵母被認為是安全的，可用于食品、SCP等的工業(yè)化生產(chǎn)。所述解脂耶氏酵母在以甘油為唯一碳源，3L發(fā)酵罐發(fā)酵96h后，葡萄糖氧化酶酶活力達到134U/ml。
[0006]所述解脂耶氏酵母是對申請?zhí)枮?014106530764( —種重組表達葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其應用)的專利申請中的重組酵母進行誘變得到的。
[0007]本發(fā)明還提供所述解脂耶氏酵母在生產(chǎn)葡萄糖氧化酶方面的應用。
[0008]所述應用是將解脂耶氏酵母種子液體以10%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于3L罐上進行發(fā)酵培養(yǎng)，甘油補料為30g/l，pH控制5.0，培養(yǎng)溫度28°C。
[0009]所述發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L計含有:甘油20，酵母提取物1.32，氯化銨1.32，磷酸二氫鉀0.32，無水硫酸鎂0.132，維生素Bi 3.34X 10 4;溶于pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中。
[0010]所述發(fā)酵培養(yǎng)具體是:B1tron 3L罐罐上培養(yǎng)，裝液量1L，接種量為10%，于28°C培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm，通氣量2.0vvm, pH控制5.0，當溶氧第一次反彈且大于60%時，短時流加30g/L的甘油，甘油流速7.5g/h，培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。
[0011]本發(fā)明還要求保護所述解脂耶氏酵母在食品或制備藥物方面的應用。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
[0013](1)本發(fā)明的解脂耶氏酵母，可利用蔗糖等廉價的作碳源，適合高密度發(fā)酵。解脂耶氏酵母被認為是安全的，可用于食品、SCP等的工業(yè)化生產(chǎn)；
[0014](2)本發(fā)明的解脂耶氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶，培養(yǎng)96h的產(chǎn)量可達134U/ml，生產(chǎn)強度可達1.396U/ (ml.h)。
[0015]生物材料保藏
[0016]解脂耶氏酵母，分類學命名為解脂耶氏酵母T2Yarrowia lipolytica T2，于2015年12月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M2015736o
【具體實施方式】
[0017]主要試劑:蛋白胨和酵母粉購自0X10D公司；SDS_PAGE試劑盒和蛋白質(zhì)標準分子量購于碧云天生物技術(shù)研究所(南通)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0018]所需培養(yǎng)基:YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 ;蛋白胨20 ;酵母粉10。YNB培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 ;ΥΝΒ1.7 ;硫酸銨5。ΡΡΒ培養(yǎng)基(g/L):甘油20 ;酵母提取物1.32 ;氯化銨
1.32 ;磷酸二氫鉀0.32 ;無水硫酸鎂0.132 ;維生素B13.34X10-4 ;溶于檸檬酸鹽緩沖液pH6.0中。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加2%瓊脂粉。
[0019]Y.lipolytica種子培養(yǎng)條件:從_80°C保藏的工程菌甘油管點至YPD固體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)過夜，用接種針挑取單菌落接種于用250mL三角瓶裝有25mL的YPD液體培養(yǎng)基中，于28 °C培養(yǎng)18?24h，轉(zhuǎn)速為200rpm。
[0020]Y.lipolytica發(fā)酵培養(yǎng)條件:采用PPB培養(yǎng)基，B1tron 3L罐上培養(yǎng)，裝液量1L，接種量為10%，于28°C培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm，通氣量2.0VVm，pH控制5.0。當溶氧第一次反彈且大于60%時，短時流加30g/L的甘油，甘油流速7.5g/h，培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。
[0021]酶活測定方法:
[0022]酶活力單位定義:在30°C，pH 6.0的條件下，lmin從1 μπιο?的β _D_葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H202所需的酶量為一個葡萄糖氧化酶酶活力單位，以U/mL表示。
[0023]試管中加入2.5mL鄰聯(lián)茴香胺溶液，0.3mL的18%葡萄糖，0.lmL的100U/ml辣根過氧化物酶，30°C保溫2min后，向試管中加入稀釋好的酶液樣品0.lmL，反應3min后，加入2mol/L硫酸終止反應。取出試管，測0D500的吸光值，以熱失活的酶液做空白對照。
[0024]結(jié)果表示與計算:
[0025]X = [ Λ A+(7.5XtX0.1)] X5Xn
[0026]式中:Λ Α一500nm吸光值；t一測定時間，min ；0.1一樣品體積，ml ；5一終反應體積，ml ;7.5—消光系數(shù)；n—稀釋倍數(shù)。
[0027]實施例1菌株發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖氧化酶
[0028]將本發(fā)明的解脂耶氏酵母菌在YPD平板上活化培養(yǎng)一定階段，接種到種子液體培養(yǎng)基YPD中，20h后以10 %的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基PPB中，B1tron 3L罐上培養(yǎng)，裝液量1L，接種量為10%，于28°C培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm，通氣量2.0vvm，pH控制5.0。當溶氧第一次反彈且大于60%時，短時流加30g/L的甘油，甘油流速7.5g/h，培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。其培養(yǎng)96h酶活可達到134U/ml。
[0029]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1.一株高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，所述解脂耶氏酵母于2015年12月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC Μ2015736ο2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解脂耶氏酵母，其特征在于，所述解脂耶氏酵母的葡萄糖氧化酶產(chǎn)量達134U/ml。3.權(quán)利要求1所述解脂耶氏酵母在生產(chǎn)葡萄糖氧化酶方面的應用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述應用是將解脂耶氏酵母種子液體以10%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于3L罐上進行培養(yǎng)，補料30g/L的甘油，pH控制5.0，培養(yǎng)溫度28 °C。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基按g/L計含有:甘油20，酵母提取物1.32，氯化銨1.32，磷酸二氫鉀0.32，無水硫酸鎂0.132，維生素匕3.34X 10 4；溶于pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中。6.權(quán)利要求1所述解脂耶氏酵母在食品或制備藥物方面的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的所述解脂耶氏酵母于2015年12月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC？M？2015736。本發(fā)明的菌株可利用蔗糖等廉價的作碳源，適合高密度發(fā)酵，而且解脂耶氏酵母被認為是安全的，可用于食品、SCP等的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的菌株在以甘油為唯一碳源，3L發(fā)酵罐發(fā)酵96h后，葡萄糖氧化酶酶活力達到134U/ml。CCTCC NO：M 201573620151210
【IPC分類】C12N1/16, C12N9/04, C12R1/645
【公開號】CN105368728
【申請?zhí)枴緾N201510941376
【發(fā)明人】張娟, 陳堅, 劉曉筱, 堵國成, 王彬晨
【申請人】江南大學
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月16日