專利名稱：一種新型噬菌粒展示載體pCANTAB5M的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種應(yīng)用于噬菌體展示技術(shù)的新型噬菌粒展示載體。
背景技術(shù)：
噬菌體展示技術(shù)是目前應(yīng)用得最為廣泛的分子展示技術(shù)，是利用細(xì)菌的病毒，如絲狀噬菌體M13作為載體，將基因和基因產(chǎn)物有機(jī)的結(jié)合起來。由此衍生的其它展示系統(tǒng)的基本原理都是一樣的，只是載體和宿主細(xì)胞不同而已。1985年，美國Missouri大學(xué)的Smith GP第一次將外源基因插入絲狀噬菌體(Filamentousbacteriophage, fd)的基因組,使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)(Smith G P, Science, 1985,228(4705) :1315-1317)。1994年McCaffery等最先構(gòu)建了曬菌體抗體展示文庫，開始了曬菌體展示技術(shù)應(yīng)用的新時(shí)代(McCafferty J, et al, Nature, 1990, 348 :552-554) 如今卩遼菌體展示技術(shù)已被廣泛用于抗體庫的展示以及多肽和酶的制備中。噬菌體展示抗體庫通過直接將特定分子的基因型與表型相連接，統(tǒng)一于同一病毒顆粒內(nèi)，這樣通過“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的富集過程，就可以篩選到有特定結(jié)合功能的蛋白，同時(shí)可有效地從抗體庫中篩選出特異性抗體的可變區(qū)基因。噬菌體抗體庫的用途主要有兩個(gè)方面一是可以制備人源抗體；二是可以優(yōu)化抗體結(jié)構(gòu)，提高抗體的高通量表達(dá)。這對抗體的制備和應(yīng)用有著深遠(yuǎn)的意義。到目前為止，研究人員已開發(fā)出數(shù)種常用的噬菌體展示系統(tǒng)，根據(jù)研究的側(cè)重點(diǎn)可選用相應(yīng)的展示系統(tǒng)。如絲狀噬菌體展示系統(tǒng)，可以篩選出以分泌形式釋放的高親和力和高拷貝數(shù)的配體，并且絲狀噬菌體具有很好的免疫原性，在進(jìn)行生物疫苗研制開發(fā)方面具有重要價(jià)值；、噬菌體展示系統(tǒng)和T4噬菌展示體系統(tǒng)容量較大，不易篩選高親和力配體；17噬菌體展示系統(tǒng)是目前最為理想的展示系統(tǒng)(徐潔，顧東生等.中國生物工程雜志，2009，29 (2) :11-16)，能以多種拷貝展示不同分子量的蛋白，如將目的基因與IOB的17外殼蛋白的基因融合，可在17噬菌體表面展示高達(dá)400拷貝的大分子蛋白。噬菌體展示的載體主要分為噬菌粒展示載體和噬菌體展示載體兩大類。噬菌粒載體是一類帶有噬菌體復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒載體。它巧妙的組合了質(zhì)粒和噬菌體的特征，是一種人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體。噬菌粒需要輔助噬菌體(helper phage)來提供復(fù)制和包裝所需的蛋白酶和外殼蛋白。它在細(xì)菌的細(xì)胞中出現(xiàn)有輔助噬菌體的情況下，可被誘導(dǎo)成單鏈DNA噬菌粒，可以像噬菌體或質(zhì)粒一樣復(fù)制。噬菌粒具有以下令人矚目的特征1.雙鏈DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特征；2.免除了將外源DNA片段從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體這一繁瑣又費(fèi)時(shí)的步驟；3.由于載體足夠小，故可得到長達(dá)IOkb的外源DNA區(qū)段的單鏈。其中Lerner實(shí)驗(yàn)室以pBluescript為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體pCBAKS, pComb3, plomb8,主要用于Fab抗體庫的構(gòu)建，以PUC為基礎(chǔ)構(gòu)建的pHEN載體，用于構(gòu)建ScFv抗體庫，Winter實(shí)驗(yàn)室以I3UCl 19為基礎(chǔ)構(gòu)建了 pCANTAB系列載體。pCANTAB5E載體是由Pharmacia的Jackson等人于1992年構(gòu)建的一種卩遼菌粒載體，其中含有氨芐抗性基因(Amp)，Plac啟動(dòng)子及M13噬菌體間隔區(qū)片段，用于克隆ScFv基因的Sfi I,Not I克隆位點(diǎn)及Etag序列和瑚珀終止碼TAG，該載體被廣泛地應(yīng)用于噬菌體抗體庫的構(gòu)建過程中。1999年，潘衛(wèi)、戚中田首次對PCANTAB5E進(jìn)行了改造，通過PCR技術(shù)將限制酶切點(diǎn)Xba I和HGV C片段引入新的噬菌體展示載體PCANTAB5X中，在一定程度上提高了克隆效率(潘衛(wèi)，戚中田，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，Oct，20 (10)，723-725)。但是在使用過程中發(fā)現(xiàn)，pCANTAB5X展示隨機(jī)肽庫時(shí)有些重組噬菌體的庫容及滴度較低，很少篩選到插入SOObp以上插入片段，于是沈毅等對PCANTAB5X進(jìn)行了改進(jìn)，構(gòu)建了新的載體pCANTAB5L，將常用內(nèi)切酶位點(diǎn)增加到5個(gè)，并引入了柔性多肽接頭[G4S]3與大腸桿菌稀有密碼子，不僅改善 了庫容量較低的問題，并且對形成和維持活性功能起到促進(jìn)作用(沈毅、潘衛(wèi)等，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003Mar, 24 (3)，298-302)。2004年，徐容等對pCANTABL載體的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行了閱讀框的校正，進(jìn)一步得到了改進(jìn)后的載體PCANTAB5S，并成功應(yīng)用該載體展示了葡萄球菌A蛋白的5個(gè)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域及大消化鏈球菌屬蛋白L的B3結(jié)構(gòu)域，顯示了該載體廣闊的應(yīng)用前景。但是，該載體仍然存在一些缺陷，PCANTAB5E載體本身使用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為Not I和Sfi I，這為后續(xù)的抗體庫構(gòu)建和庫容量提高帶來了很多不利影響。首先，因?yàn)閮煞N限制性內(nèi)切酶的最佳作用溫度不同，所以導(dǎo)致在操作過程中增加了操作步驟，不利于抗體庫庫容的提高，而且?guī)聿槐匾睦速M(fèi)；其次，Not I的酶切位點(diǎn)是一種G(鳥苷酸)、C(胞嘧啶)含量比較高的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，因此在酶切時(shí)需要過量的酶和較長的時(shí)間才能達(dá)到理想的效果；最后，Sfi I是一種具有位點(diǎn)優(yōu)勢效應(yīng)的酶，酶切效率不高，因此對PCANTAB5E載體進(jìn)行改造，使其更加適用于噬菌體抗體庫的構(gòu)建是具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值的。我們改造后的pCANTAB5M 載體，引入了 Xba I、Stu I、EcoRV 和 KpnI等4個(gè)常用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，這些酶的最佳工作溫度均為37°C，而且基本上都可以使用雙酶切系統(tǒng)，簡化了后續(xù)的試驗(yàn)操作，為更好的提高庫容提供了可能性。此外，我們還在新的噬粒載體上引入了 His和Myc兩種常用的蛋白標(biāo)簽，可以用來鑒定展示的噬菌體中是否有目標(biāo)蛋白的表達(dá)。最后，我們引入的BGH序列，也為噬菌體抗體庫后期的陽性克隆測序鑒定提供了方便的測序引物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過使用分子生物學(xué)技術(shù)，在PCANTAB5E載體的Sfi I和Not I酶切位點(diǎn)之間插入了 Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I 4個(gè)常用內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)，為噬菌體展示技術(shù)提供了改進(jìn)的新型噬菌粒載體PCANTAB5M，如圖I所示。該載體不僅可以方便地進(jìn)行多位點(diǎn)克隆，提高克隆效率與庫容量，而且可以用來鑒定展示的噬菌體中是否含有目標(biāo)蛋白表達(dá)，方便陽性克隆測序鑒定工作。針對pCANTAB5E載體存在的上述問題，本發(fā)明引入了 Xba I、Stu I,EcoR V和KpnI等常用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，這些酶的最佳工作溫度均為37°C，而且基本上都可以使用雙酶切系統(tǒng)，簡化了后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作，進(jìn)一步提高了克隆效率與庫容能力。除此之外，改進(jìn)后的載體PCANTAB5M還增加了一些新的功能。本發(fā)明在載體中引入了 His和Myc兩種常用的蛋白標(biāo)簽，這兩種標(biāo)簽可以用來鑒定展示的噬菌體中是否有目標(biāo)蛋白的表達(dá)，為陽性噬菌粒克隆的鑒定工作提供一種更為準(zhǔn)確的檢測工具。同時(shí)，本發(fā)明還在新的噬菌粒載體中引入了 BGH序列，BGH序列是通用引物，它的引入極大地簡化了噬菌體抗體庫后期的陽性克隆的測序鑒定工作。改良后的噬菌粒載體PCANTAB5M適用于展示各種抗體庫，隨機(jī)肽片段和功能蛋白。應(yīng)用PCANTAB5E噬菌粒己成功地展示了抗跨膜糖蛋白⑶22抗原的抗體庫。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供了一種新型的噬菌粒展示載體pCANTAB5M，該載體是由噬菌粒PCANTAB5E及其Sfi I和Not I酶切位點(diǎn)之間插入的linker核苷酸片段組成，所述的 linker核苷酸片段包含a. Xba I、Stu I、EcoRV 和 Kpn I 酶切位點(diǎn)；b.序列為 GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG 的 myc 標(biāo)簽；c.序列為 CATCATCATCATCATCAT 的 His 標(biāo)簽；d.序列為CCTCGACTGTGCCTTCTA的通用測序引物BGH。所述的pCANTAB5E載體，是由pCANTAB5E載體先后經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Not I、SfiI酶切后回收而得。所述的linker核苷酸片段，來源于載體p⑶NA 3. 1/myc-His㈠，即以載體pCDNA 3. 1/myc-His (-)為模板，通過PCR擴(kuò)增而得。所述的linker核苷酸片段，包含Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I 4個(gè)常用內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)，其中Stu I酶切位點(diǎn)通過在引物中引入Stu I酶切位點(diǎn)核苷酸序列后PCR擴(kuò)增而得。除上述4個(gè)酶切位點(diǎn)，該多克隆位點(diǎn)區(qū)還包含Xho I、BstX I、EcoR I、BstX I、BamH
I、Asp718 I, Hind III 和 Apa I 酶切位點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種新型噬菌粒展示載體PCANTAB5M，其linker核苷酸片段具有SEQ ID NO I所示的序列。本發(fā)明提供了噬菌粒展示載體PCANTAB5M用于展示抗體庫、隨機(jī)肽庫和功能靶蛋白的用途。本發(fā)明提供了噬菌粒展示載體pCANTAB5M用于展示⑶22抗體的用途。


圖I :新型噬菌粒載體pCANTAB5M。圖2 :Linker序列PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖3 pCANTAB5M陽性克隆菌液PCR鑒定結(jié)果。圖4 pCANTAB5M陽性克隆酶切鑒定結(jié)果。圖5 :應(yīng)用pCANTAB5M噬粒載體構(gòu)建的⑶22抗體庫ELISA標(biāo)簽檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施方案通過下列實(shí)施例舉例說明。然而本發(fā)明的實(shí)施方案不限于這些實(shí)施例的特定細(xì)節(jié)，因?yàn)閷τ诒绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，其它的變化是已知的，或根據(jù)直接公開的內(nèi)容和附屬的權(quán)利要求是顯而易見的。因此，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。本文引用的參考文獻(xiàn)以其全文通過引用并入本文。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例I :pCANTAB5M重組載體的構(gòu)建I、linker序列的引物設(shè)計(jì)依據(jù)pCANTAB5E 載體與 pO)NATM3. 1/myc-His (-)載體的序列設(shè)計(jì) linker 序列 PCR 擴(kuò)展引物如下MH-SenseGCTGGCTTAGTCTTGGCCTTCTCGGCCCTCTAGACTCGAGAGGCCTCCMH-AntisenseTTTTCCTTTTGCGGCCGCTAGAAGGCACAGTCGAGGCTGATCAGCGGT2、I inker序列的擴(kuò)增以pcDNA 3. 1/myc-His (-)質(zhì)粒為模板，以 MH-Sense、MH-Antisense 為引物擴(kuò)增linker序列。在擴(kuò)增的同時(shí)，由于引物中Stu I酶切位點(diǎn)基因序列的引入，pcDNA 3. I/myc-His(-)載體原有的Not I酶切位點(diǎn)被突變成為Stu I酶切位點(diǎn)，通過擴(kuò)增，從而得到了包含Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I四個(gè)酶切位點(diǎn)，myc、His標(biāo)簽和BGH通用測序引物的 linker 序列。擴(kuò)增體系為pcDNA 3. 1/myc-His (-)質(zhì)粒模板 0. 5 u L, MH-Sensell U 1，MH-Antisense I u l,dNTP 4u I, IOx buffer 5 y 1，Taq 聚合酶 0. 5 y 1，ddH20 38 yl。擴(kuò)增條件為95°C 5min，一個(gè)循環(huán)；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，一個(gè)循環(huán)。電泳結(jié)果如圖2所示，I號泳道是天根生化科技有限公司DNA marker III，2號泳道是linker序列PCR擴(kuò)增的結(jié)果。電泳結(jié)果表明擴(kuò)增得到的linker條帶單一、清晰、位置正確。3、I inker序列的回收使用Axygen公司DNA膠回收Kit回收linker序列，并進(jìn)行DNA含量測定，檢測結(jié)果顯示linker DNA濃度為70ng/ul。4、pCANTAB5E載體和linker序列的雙酶切使用限制性內(nèi)切酶Not I (購自New England Biolabs Inc.)分別過夜酶切PCANTAB5E載體和linker序列，然后回收酶切后的載體和linker序列片段。使用限制性內(nèi)切酶Sfi I (購自New England Biolabs Inc.)再次過夜酶切回收后的載體和linker序列片段，然后二次回收雙酶切的載體和linker片段，定量備用。5、雙酶切片段的連接與轉(zhuǎn)化將經(jīng)過Not I和Sfi I雙酶切的載體序列與linker序列連接過夜，轉(zhuǎn)化TGl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂2YTAG培養(yǎng)基平板，370C，靜置，過夜培養(yǎng)。6、陽性克隆的鑒定從連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化平板上挑取12個(gè)克隆分別進(jìn)行酶切鑒定和菌液PCR鑒定。擴(kuò)增體系為菌液 I y I，MH-Sense lul, MH-Antisense lul, dNTP 4 u I, IOx buffer 5 U I,Taq 聚合酶 0. 5ii l，ddH20 38 u I0 擴(kuò)增條件為95°C 5min，一個(gè)循環(huán)；95°C 30s, 56°C 30s,72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，一個(gè)循環(huán)。鑒定結(jié)果如圖3所不，I號和14號泳道為天根生化科技有限公司DNA marker III,2號泳道到11號泳道分別為克隆12到克隆3，12號泳道為克隆1，13號泳道為克隆2。菌液PCR結(jié)果表明只有克隆I為陽性克隆。提取12個(gè)陽性克隆中的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI與EcoRV(購自New England Biolabs Inc.)進(jìn)行雙酶切，37°C，過夜酶切。酶切結(jié)果如圖4所示，I號泳道為天根生化科技有限公司DNA marker III，2號泳道到13號泳道分別為克隆12到克隆I。酶切結(jié)果表明只有I號克隆為陽性克隆，可以切出大小正確的兩條目標(biāo)條帶。7、測序驗(yàn)證pCANTAB5M重組載體將PCANTAB5M質(zhì)粒的陽性克隆Cl送英俊公司進(jìn)行核苷酸序列測定，檢測采用BGH 和SI兩種引物并雙向測通，檢測結(jié)果表明Cl與目標(biāo)序列完全匹配。序列匹配結(jié)果如下所示，所插入的linker序列如SEQ ID NO 1所示。
權(quán)利要求
1.ー種新型的噬菌粒展示載體PCANTAB5M，由噬菌粒pCANTAB5E及其Sfi I和Not I酶切位點(diǎn)之間插入的linker核苷酸片段組成,所述的linker核苷酸片段包含 a.Xba I、Stu I、EcoRV 和 Kpn I 酶切位點(diǎn)； b.序列為GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG 的 myc 標(biāo)簽； c.序列為CATCATCATCATCATCAT 的 His 標(biāo)簽； d.序列為CCTCGACTGTGCCTTCTA的通用測序引物BGH。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的曬菌粒展示載體PCANTAB5M,其特征在于,所述的linker序列如SEQ ID NO 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2任一所述的噬菌粒展示載體pCANTAB5M用于展示抗體庫、隨機(jī)肽庫和功能靶蛋白的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的噬菌粒展示載體pCANTAB5M用于展示⑶22抗體的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型噬菌粒展示載體pCANTAB5M及其制備方法和應(yīng)用。該載體對商用載體pCANTAB5E進(jìn)行了改進(jìn)，在Sfi I和Not I酶切位點(diǎn)之間插入了Xba I、Stu I、EcoRV和Kpn I 4個(gè)常用的內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)，同時(shí)在載體中引入了Myc標(biāo)簽和His標(biāo)簽及通用測序引物BGH。這樣的改進(jìn)簡化了外源基因的定向克隆操作，提高了庫容量與克隆效率，使得陽性噬菌粒克隆的鑒定更為準(zhǔn)確，極大地方便了陽性克隆的測序驗(yàn)證工作。本發(fā)明適用于展示各種隨機(jī)肽庫，抗體庫和各種功能靶蛋白。
文檔編號C12N7/01GK102676569SQ20121014214
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者劉志剛, 劉方杰, 尹琪, 王康, 白先宏, 馬金偉 申請人:百泰生物藥業(yè)有限公司