同時(shí)檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實(shí)時(shí)熒光pcr引物探針組合及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)檢測技術(shù)，具體地說，設(shè)及一種同時(shí)檢測引起蘋果牛眼果 腐病的4種病原菌的實(shí)時(shí)巧光PCR引物探針組合及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘋果牛眼果腐病度uirs-eyerotofapple)是我國關(guān)注的進(jìn)境水果真菌病害， 病原菌包括Neofabraeamalicorticis、N.perennans、N.a化a和N.kienholzii運(yùn) 4 個種， 其中N.malicodicis(異名：Peziculamalicodicis)被列入我國進(jìn)境植物檢疫性有害生 物名錄中。蘋果牛眼果腐病是蘋果和梨重要的采后病害，難W防控，不僅為害果實(shí)，導(dǎo)致嚴(yán) 重的采后損失，而且可侵害枝條、樹干，導(dǎo)致樹勢衰弱、幼樹死亡。其在世界范圍內(nèi)廣泛分 布，但尚未在我國發(fā)現(xiàn)。該病一旦傳入我國，在我國蘋果產(chǎn)區(qū)擴(kuò)散、定殖的可能性很大，將對 我國蘋果生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅，十分必要加大口岸檢疫力度，嚴(yán)防該病菌的傳入。然而，蘋果 牛眼果腐病菌相似的形態(tài)特征和生理特性使運(yùn)些病原菌的區(qū)分非常困難，要求鑒定者必須 具備豐富的真菌分類學(xué)基礎(chǔ)與經(jīng)驗(yàn)。加之傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法周期長，不符合進(jìn)境水果快速通關(guān) 的要求，使其成為進(jìn)境水果真菌病害檢疫的瓶頸。因此建立快速準(zhǔn)確的檢測體系尤為必要。
[0003] 近年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，大量WPCR為基礎(chǔ)的技術(shù)廣泛地運(yùn)用到植 物病原菌的鑒定中，大大提高了鑒定的速度和準(zhǔn)確性。實(shí)時(shí)巧光PCR結(jié)合了巧光檢測系統(tǒng) 和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，通過巧光放大檢測信號，在PCR擴(kuò)增的過程中就能檢測模板DNA的擴(kuò)增， 不需要凝膠電泳分析，簡化了檢測程序，與常規(guī)的PCR比較更能縮短檢測周期。而且其檢測 特異性強(qiáng)，靈敏度高，其運(yùn)用范圍越來越廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對W上要解決的技術(shù)問題，提供一種特異性好、靈敏度高的同 時(shí)檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實(shí)時(shí)巧光PCR引物探針組合。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于實(shí)時(shí)巧光PCR檢測引起蘋果牛眼果腐病的4 種病原菌的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的再一個目的是提供同時(shí)檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實(shí)時(shí) 巧光PCR方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病 原菌的實(shí)時(shí)巧光PCR引物探針組合，該引物探針組合包括W下引物：
[0008] NeoF:5' -CCCTCGGTGGGGCAAAG-3';
[0009] NeoR:5' -CCAACTCGGCGGCTTCC-3f;
[0010] MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB；
[0011] 陽R-P:CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-B冊2 ;
[0012] ALB-P:肥D-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-B冊 1 ;
[0013] KIE-P :肥X-TGACCACTTGATGATCTC-MGB ;
[0014] 其中，F(xiàn)AM、CY5、肥D、肥X為巧光基團(tuán)，MGB、B冊1、B冊2為巧滅基團(tuán)。
[0015] 上述引物中，Neo F和化0R為檢測蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的通用引物； MAkPa為檢測N. malico;rticis的特異性探針；PER-Pb為檢測N. perennans的特異性探針； ALB-Pc為檢測N. a化a的特異性探針；KIE-Pd為檢測N. kienholzii的特異性探針。
[0016] 本發(fā)明還提供了用于實(shí)時(shí)巧光PCR檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的試劑 盒，該試劑盒含有上述引物探針組合。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2\PCR反應(yīng)緩沖液中的至少 一種。
[0018] 更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種同時(shí)檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實(shí)時(shí)巧 光PCR方法，即利用所述引物探針組合進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光PCR檢測待測樣品。
[0020] 具體地，所述方法包括W下步驟：1)提取待檢測樣品中的DNA;2)W步驟1)中提 取的DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)分析Ct值。
[002。 其中，實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系W20μL計(jì)為：
[002引模板DNA 50ng，
[0023] 引物 每條引物的終濃度均為〇.5μπιο1/1，
[0024] 探針 每條探針的終濃度均為0. 25 μ mol/l，
[00巧]2XThunderbird Probe qPCR Mix 10 μL,
[0026] (1地2〇補(bǔ)足至20 μ L ;
[0027]其中，2XThunderbirdProbeqPCRMix內(nèi)含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖 液、ROX。2X化underbirdProbeqPCRMix購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，貨號 為WS-101。
[0028] 其中，實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)條件為：95°C10分鐘；94°C15秒，60°C60秒，共40個循 環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后在FAM、CY5、肥D、肥X通道下檢測巧光信號。
[0029] 上述方法中，步驟3)中根據(jù)FAM、CY5、肥D、肥X通道下的巧光信號Ct值進(jìn)行結(jié)果 判斷。若FAM通道下Ct值小于35,貝Ij判為N.malicodicis陽性，若Ct值大于35或無擴(kuò)增 信號則判為N.malico;rticis陰性；若CY5通道下Ct值小于35,卯J判為N.perennans陽性， 若Ct值大于35或無擴(kuò)增信號則判為N.perennans陰性；若肥D通道下Ct值小于35,卯J判 為N.a化a陽性，若Ct值大于35或無擴(kuò)增信號則判為N.a化a陰性；若肥X通道下Ct值小 于35,卯J判為N.kienholzii陽性，若Ct值大于35或無擴(kuò)增信號則判為N.kienholzii陰 性；
[0030] 本發(fā)明根據(jù)4種蘋果牛眼果腐病菌的EF-la基因特異序列，設(shè)計(jì)了 1對通用引物 和4條特異性探針，并基于運(yùn)些引物探針組合建立了同時(shí)檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種 病原菌的實(shí)時(shí)巧光PCR方法，可實(shí)現(xiàn)對樣品的定性檢測。
[0031] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的引物探針組合、試劑盒及檢測方法特異性好、靈敏度高、通量 高、快速，提高了檢測效率，為引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的檢測提供了更有效的方 法。
【附圖說明】
[0032]圖1為本發(fā)明在FAM通道下的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中從左至右1-2分別為菌株CBS 102863、CBS102872。
[0033]圖2為本發(fā)明在CY5通道下的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中從左至右1-6分別為菌株CBS 139. 4UCBS102869、CBS102873、CBS453. 64、VPRI41734、VPRI10502。
[0034]圖3為本發(fā)明在肥D通道下的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中從左至右1-6分別為菌株CBS 109875、CBS102871、CBS628. 72、CBS452. 64、CBS304. 62、CBS261.32。
[0035] 圖4為本發(fā)明在肥X通道下的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中1為菌株CBS355. 72。
[0036] 圖5為本發(fā)明在FAM通道下的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中1-6分別為濃度10化g/μ^ lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。
[0037] 圖6為本發(fā)明在CY5通道下的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中1-5分別為濃度l(K)ng/μL lOng/μL Ing/μLO. Ing/μL和 0.Olng/μL。
[0038] 圖7為本發(fā)明在肥D通道下的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中1-6分別為濃度10化g/μL lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。
[0039] 圖8為本發(fā)明在肥X通道下的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中1-6分別為濃度10化g/μL lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。
【具體實(shí)施方式】
[0040] W下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0041] 實(shí)施例1檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實(shí)時(shí)巧光PCR引物探針組合
[0042] 根據(jù)引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的EF-1α基因特異序列，設(shè)計(jì)了如下檢測 引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實(shí)時(shí)巧光PCR引物探針組合，引物序列如下：
[0043]NeoF:5' -CCCTCGGTGGGGCAAAG-3'(沈QIDNo. 1);
[0044]NeoR:5' -CCAACTCGGCGGCTTCC-3< (沈QIDNo. 2);;
[0045]MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB(SEQIDNo. 3)；
[0046]陽R-P:CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-B冊2(沈QIDNo. 4);
[0047]ALB-P:肥D-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-B冊 1 (沈QIDNo. 5);
[0048]KIE-P:肥X-TGACCACTTGATGATCTC-MGB(SEQIDNo. 6);
[0049] 其中，F(xiàn)AM、CY5、肥D、肥X為巧光基團(tuán)，MGB、B冊1、B冊2為巧滅基團(tuán)。
[0050]NeoF和化οR為檢測蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的通用引物；MAkP為檢測 N.malico;rticis的特異性探針；PER-P為檢測N.perennans的特異性探針；ALB-P為檢測 N.a化a的特異性探針；KIE-P為檢測N.kienholzii的特異性探針。
[0051] 實(shí)施例2檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實(shí)時(shí)巧光PCR特異性實(shí)驗(yàn)
[00閲 1、DNA的提取
[0053]提取表1中21株菌株的基因組DNA。將供試菌株在PDA平板上20°C黑暗培養(yǎng)7~ lOd，收集菌絲，液氮研磨，取0.Ig參照試劑盒說明操作（植物基因組DNA提取試劑盒，貨號 為DP305-02,天根生物科技有限公司）分別提取引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的基因 組DM。
[0054]菌株1-13、16-19購買于荷蘭菌種保藏中屯、（CB巧；菌株14-15由澳大利亞環(huán)境與 初級產(chǎn)業(yè)部（Dep曰rtmentofEnvironment曰ndPrim曰ryIndustries,Austr曰li曰）提供； 菌株20保藏于廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中屯、，