一種分子量內(nèi)標(biāo)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種新型分子量內(nèi)標(biāo)及其應(yīng)用。尤其是設(shè)及 一種能清晰地分辨單個堿基、確保正確分型的分子量內(nèi)標(biāo)及其應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002] 基因組掃描（genomescanning)是從全基因組的遺傳標(biāo)記中尋找與特定性狀或基 因緊密連鎖的標(biāo)記，并在染色體上定位相關(guān)基因的方法。而基因分型（Genotyping)又稱為 基因型分析（Genotypicassay),是利用生物學(xué)檢測方法測定個體基因型（Genotype)的技 術(shù)，其中使用技術(shù)的包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)、DNA片段分析、寡核巧酸探針（AS0probes)、 基因測序、核酸雜交、基因忍片技術(shù)等。人類基因組計劃開始W來，基因掃描和基因分型技 術(shù)發(fā)展迅速。在致病基因篩查，疾病基因連鎖和關(guān)聯(lián)分型，腫瘤等疾病早期診斷、法醫(yī)學(xué)個 體識別等方面都廣泛應(yīng)用。基因分型技術(shù)重要的手段就是利用DNA測序儀或遺傳分析儀分 析基因片段的分子量。運(yùn)類儀器分析分子量時需要一個分子量標(biāo)準(zhǔn)來對樣品進(jìn)行計算，也 就是分子量內(nèi)標(biāo)，又稱為分子量內(nèi)對照（InternalLaneStandard)。
[0003]目前常用的分子量內(nèi)標(biāo)，如LIZ-500,其由15條帶有LIZ巧光素（紅色）標(biāo)記的 雙鏈DNA片段組成，分子量分別是：3化P、50bp、7化P、IOObp、139bp、150bp、160bp、200bp、 250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、490bp和 500bp，運(yùn)些DNA片段之間的分子量差都 大于或等于lObp，是通過先對質(zhì)粒酶切，再連接上一條帶巧光素的寡核巧酸得到的內(nèi)標(biāo)片 段。而在STR分型的過程中，由于遺傳分析儀上Buffer槽中的Buffer、水槽中的水、毛細(xì)管 W及POP膠和甲酯胺均會出現(xiàn)過期或不合格現(xiàn)象。而且也會出現(xiàn)很多的擴(kuò)增片段，當(dāng)擴(kuò)增 的片段比較大且大小相近，而標(biāo)記引物顏色相同時，使用現(xiàn)有的DNASTR檢測用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)即 分子量內(nèi)標(biāo)檢測DNA時就不能保證單個堿基分辨率，也就不能在Buffer槽中的Buffer、水 槽中的水、毛細(xì)管W及POP膠和甲酯胺中某一部分出現(xiàn)過期或不合格時保證基因分型的正 確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有分子量內(nèi)標(biāo)在使用時存在的不足，提供一種能清晰地分辨單個堿 基，確保正確分型，從而方便操作人員判讀的分子量內(nèi)標(biāo)及其應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
[0006] 一種分子量內(nèi)標(biāo)，由n條不同分子量的帶有可識別的標(biāo)記物的核巧酸片段構(gòu)成； 其中至少包含P對相差一個堿基的核巧酸片段對；所述相差一個堿基的核巧酸片段對中一 個片段的堿基數(shù)為m，另一個片段的堿基數(shù)為m+1或m-1。
[0007] 其中，在一些實(shí)施方案中，所述n為偶數(shù)時，P為1~n/2。即至少包含1~n/2對 相差一個堿基的核巧酸片段。如n為10時，P可W為！~10/2。即可W包含1對、2對、3 對、4對或5對相差一個堿基的核巧酸片段對。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，所述n為奇數(shù)時，P為！~（n-1)/2。即至少包含1~（n-1)/2 對相差一個堿基的核巧酸片段。如n為11時，P可W為！~（11-1)/2。即可W包含I對、 2對、3對、4對或5對相差一個堿基的核巧酸片段對。
[0009] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述分子量內(nèi)標(biāo)中P為2~6。即本發(fā)明所述分子 量內(nèi)標(biāo)中包含2~6對相差一個堿基的核巧酸片段對。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明分子量內(nèi)標(biāo)中所述的堿基數(shù)m在30~5000個之間。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，所述的堿基數(shù)m在30~1000個之間。
[0012] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的堿基數(shù)m在30~600個之間。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明分子量內(nèi)標(biāo)中所述可識別的標(biāo)記物為巧光標(biāo)記物，其 巧光發(fā)射區(qū)域在400皿至1000皿范圍內(nèi)。
[0014] 優(yōu)選地，所述的巧光標(biāo)記物包括但不局限于W下巧光素：LIZ、FAM、肥X、JOE、TMR、 TET、VIC、NH635、C巧。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述的分子量內(nèi)標(biāo)在片段分析中的應(yīng)用。
[0016] 優(yōu)選地，所述片段分析包括但不局限于STR分型、測序、大片段分析W及基因組 分析。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種包括本發(fā)明所述的分子量內(nèi)標(biāo)的片段分析試劑盒。
[0018] 本發(fā)明制備的分子量內(nèi)標(biāo)是帶有巧光標(biāo)記物的DNA分子。一般使用方法是加入去 離子甲酯胺，95'C加熱3-5分鐘變性，迅速置于冰上冷卻3分鐘。
[0019] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種分子量內(nèi)標(biāo)，由n條不同分子量的帶有 可識別的標(biāo)記物的核巧酸片段構(gòu)成；其中至少包含P對相差一個堿基的核巧酸片段對；所 述相差一個堿基的核巧酸片段對中一個片段的堿基數(shù)為m，另一個片段的堿基數(shù)為m+1或 m-1。本發(fā)明所述分子量內(nèi)標(biāo)相對現(xiàn)有的商業(yè)分子量內(nèi)標(biāo)而言，具有分辨單個堿基的能力， 可W有效地區(qū)分相差一個堿基的PCR產(chǎn)物片段，能確保正確分型，從而方便檢測人員判讀， 廣泛適用于STR分型，測序，大片段分析W及基因組分析。
【附圖說明】
[0020] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0021] 圖1示實(shí)施例2STR分型檢測結(jié)果圖，其中圖a為Fam標(biāo)記的產(chǎn)物片段；圖b為化X 標(biāo)記的產(chǎn)物片段；圖C為Tamra標(biāo)記的產(chǎn)物片段；圖d為本發(fā)明內(nèi)標(biāo)片段；橫坐標(biāo)為堿基數(shù) 目，縱坐標(biāo)為信號強(qiáng)度；
[002引圖2示實(shí)施例2傳統(tǒng)分子量內(nèi)標(biāo)與基因共同電泳檢測分型結(jié)果圖譜，其中圖a為Fam標(biāo)記的產(chǎn)物片段，A表示Fam標(biāo)記的產(chǎn)物片段，并且在Bin上，背景暗色豎紋為Bin;B表 示為Fam標(biāo)記的產(chǎn)物片段，并且不在Bin上；圖b為傳統(tǒng)內(nèi)標(biāo)片段；橫坐標(biāo)為堿基數(shù)目，縱坐 標(biāo)為信號強(qiáng)度；
[0023] 圖3示實(shí)施例2本發(fā)明分子量內(nèi)標(biāo)與基因共同電泳檢測分型結(jié)果圖譜，其中圖a 為Fam標(biāo)記的產(chǎn)物片段，A表示Fam標(biāo)記的產(chǎn)物片段，并且在Bin上；B表示為Fam標(biāo)記的產(chǎn) 物片段，并且不在Bin上；圖b為本發(fā)明分子量內(nèi)標(biāo)片段；橫坐標(biāo)為堿基數(shù)目，縱坐標(biāo)為信 號強(qiáng)度；
[0024] 圖4示實(shí)施例2本發(fā)明分子量內(nèi)標(biāo)毛細(xì)管電泳圖譜，其中橫坐標(biāo)為堿基數(shù)目，縱坐 標(biāo)為信號強(qiáng)度；
[00巧]圖5為圖4的75bp和76bp的局部放大圖，其中橫坐標(biāo)為堿基數(shù)目，縱坐標(biāo)為信號 強(qiáng)度；
[0026] 圖6為圖4的500bp和5(Ubp的局部放大圖，其中橫坐標(biāo)為堿基數(shù)目，縱坐標(biāo)為信 號強(qiáng)度。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施