體的用途，使黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體成為抗肝癌藥物的有效樣品原料，顯著提高黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體的附加值。
[0034]5、本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、回收率高、重復(fù)性較好、質(zhì)量穩(wěn)定可控，所得到的黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體抗肝癌留醇類活性樣品(第FrS-1號(hào)樣品和第Fr8-4號(hào)樣品)經(jīng)NMR氫譜、碳譜分析，分別判定為 3 β -hydroxy- (22E, 24R) -ergosta-5, 8, 22-trien-7_one 和(3 α，5 α )，(8β , 11 β ) -diepid1xy-ergost-22E-en-12-one (參見圖 5)。
【附圖說明】
[0035]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0036]圖1為本發(fā)明黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體標(biāo)準(zhǔn)化組分的制備色譜圖。
[0037]圖2為本發(fā)明黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體標(biāo)準(zhǔn)化組分的抗肝癌活性檢測(cè)圖。
[0038]圖3為本發(fā)明黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體第八號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分的制備色譜圖。
[0039]圖4為本發(fā)明黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體第FrS-1?Fr8_4號(hào)樣品的抗肝癌活性檢測(cè)圖。
[0040]圖5本發(fā)明黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體第Fr8-1和第Fr8_4號(hào)樣品的化合物結(jié)構(gòu)式。
【具體實(shí)施方式】
[0041]實(shí)施例1 一種黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體抗肝癌活性留醇類化合物的制備方法，包括以下步驟:
[0042]⑴黃綠蜜環(huán)菌丙酮提取物加入其體積的I倍50%正己烷-乙酸乙酯混合液進(jìn)行溶解，溶解后過0.45 μπι的有機(jī)濾膜，得到含丙酮提取物的樣品溶液；所述含丙酮提取物的樣品溶液在以10 μπι硅膠為分離基質(zhì)的制備色譜上分離并減壓干燥，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、FrlO、Frl2、、Frl3、Frl4 共 14 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品；
[0043]其中:
[0044]減壓濃縮的條件是指真空度為0.06MPa，溫度為70°C。
[0045]制備色譜分離的條件是指色譜柱尺寸為260X 50mm ;采用A為正己烷、B為乙酸乙酯的二元流動(dòng)相體系進(jìn)行分離:0?15min，100% A?100% A ;15?35min，60% A?60%A ；35?50min,0% A?0% A ;檢測(cè)波長為260nm ;上樣量為1.0g0
[0046]⑵將所述14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品采用iCelligence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀按下述步驟進(jìn)行體外抗肝癌細(xì)胞模型篩選:
[0047]①確認(rèn)iCelligence測(cè)試系統(tǒng)正確連接，37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱工作正常；
[0048]②8孔細(xì)胞板內(nèi)按150 μ L/孔加入培養(yǎng)基，室溫放置15分鐘后置于iCelligence測(cè)試臺(tái)上測(cè)基線；所述培養(yǎng)基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基；
[0049]③將所述14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品中的每個(gè)組分樣品用DMSO配制成濃度為5mg/mL的樣品溶液；
[0050]④將對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞H印G2，用胰酶按常規(guī)方法消化后，以950rpm的速率離心5min，將細(xì)胞重懸于所述培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞濃度調(diào)至2.85 X 14個(gè)/mL，得到對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞HepG2懸液，并按345 μ L/孔、每孔10000個(gè)細(xì)胞的量將所述對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞ifepG2懸液接種入所述8孔細(xì)胞板的相應(yīng)孔中，室溫放置30min ;
[0051]⑤將所述14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品分兩批按每孔加5 μ L所述濃度為5mg/mL的樣品溶液、每孔加345 μ L所述對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞H印G2懸液的量接種入所述8孔細(xì)胞板的相應(yīng)孔中，并置于所述iCelligence測(cè)試臺(tái)，放入所述培養(yǎng)箱中開始檢測(cè)；45h后得到兩張黃綠蜜環(huán)菌子抗肝癌標(biāo)準(zhǔn)化組分的活性檢測(cè)圖；其中縱坐標(biāo)為細(xì)胞指數(shù)，橫坐標(biāo)為實(shí)時(shí)細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)效應(yīng)；
[0052]⑥根據(jù)所述兩張黃綠蜜環(huán)菌子抗肝癌標(biāo)準(zhǔn)化組分的活性檢測(cè)圖，當(dāng)細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)上升平緩或不上升的趨勢(shì)，則說明細(xì)胞分裂減緩或停止，即細(xì)胞不能進(jìn)行正常的分裂，從而確定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分具有體外抑制人肝癌細(xì)胞貼壁及增殖活性。
[0053]⑶將第8號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分加入其體積的2倍20%正己燒-乙醇混合液進(jìn)行溶解，溶解后過0.45 μ m的有機(jī)濾膜，得到含第8號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分的樣品溶液；所述含第8號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分的樣品溶液在以10 μπι XAmide為分離基質(zhì)的制備色譜上分離并減壓干燥，即得Fr8_l、Fr8-2、Fr8-3、Fr8_4 共 4 個(gè)樣品；
[0054]其中:
[0055]減壓濃縮的條件是指真空度為0.06MPa，溫度為70°C ;
[0056]制備色譜分離的條件是指色譜柱尺寸為250 X 20mm ;采用A為正己烷、B為乙醇的二元流動(dòng)相體系進(jìn)行分離:0?40min，97% A?92% A ;檢測(cè)波長為260nm ;上樣量為0.15或 0.3g0
[0057]⑷將所述4個(gè)樣品采用iCelligence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀按下述步驟進(jìn)行體外抗肝癌細(xì)胞模型篩選:
[0058]①確認(rèn)iCelligence測(cè)試系統(tǒng)正確連接，37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱工作正常；
[0059]②8孔細(xì)胞板內(nèi)按150 μ L/孔加入培養(yǎng)基，室溫放置15分鐘后置于iCelligence測(cè)試臺(tái)上測(cè)基線；所述培養(yǎng)基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基；
[0060]③將所述4個(gè)樣品中的每個(gè)樣品用DMSO配制成濃度為5mg/mL的樣品溶液；
[0061]④將對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞H印G2，用胰酶按常規(guī)方法消化后，以950rpm的速率離心5min，將細(xì)胞重懸于所述培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞濃度調(diào)至2.85 X 14個(gè)/mL，得到對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞HepG2懸液，并按345 μ L/孔、每孔10000個(gè)細(xì)胞的量將所述對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞ifepG2懸液接種入所述8孔細(xì)胞板的相應(yīng)孔中，室溫放置30min ;
[0062]⑤將所述4個(gè)樣品分兩批按每孔加5 μ L所述濃度為5mg/mL的樣品溶液、每孔加345 μ L所述對(duì)數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞H印G2懸液的量接種入所述8孔細(xì)胞板的相應(yīng)孔中，并置于所述iCelligence測(cè)試臺(tái)，放入所述培養(yǎng)箱中開始檢測(cè)；45h后得到兩張黃綠蜜環(huán)菌子抗肝癌標(biāo)準(zhǔn)化組分的活性檢測(cè)圖；其中縱坐標(biāo)為細(xì)胞指數(shù)，橫坐標(biāo)為實(shí)時(shí)細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)效應(yīng)；
[0063]⑥根據(jù)所述兩張黃綠蜜環(huán)菌子抗肝癌標(biāo)準(zhǔn)化組分的活性檢測(cè)圖，當(dāng)細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)上升平緩或不上升的趨勢(shì)，則說明細(xì)胞分裂減緩或停止，即細(xì)胞不能進(jìn)行正常的分裂，從而確定第FrS-1號(hào)樣品和第Fr8-4號(hào)樣品具有體外抑制人肝癌細(xì)胞貼壁及增殖活性。
[0064]所得到的黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體抗肝癌留醇類活性樣品(第FrS-1號(hào)樣品和第Fr8_4號(hào)樣品)經(jīng)NMR氫譜、碳譜分析，分別判定為3 β -hydroxy-(22Ε, 24R) -ergosta-5, 8, 22-trien-7-one 和(3 α, 5α), (8 β , 11 β ) -diepid1xy-ergost-22E-en-12-one (參見圖 5)。
[0065]實(shí)施例2 —種黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體抗肝癌活性留醇類化合物的制備方法，包括以下步驟:
[0066]⑴黃綠蜜環(huán)菌丙酮提取物加入其體積的6倍10%正己烷-乙酸乙酯混合液進(jìn)行溶解，溶解后過0.45 μπι的有機(jī)濾膜，得到含丙酮提取物的樣品溶液；所述含丙酮提取物的樣品溶液在以ΙΟμπι硅膠為分離基質(zhì)的制備色譜上分離并減壓干燥，即得Frl、Fr2、……、Fr 13、Fr 14共14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組分樣品；
[0067]其中:
[0068]減壓濃縮的條件是指真空度為0.09MPa，溫度為50°C。
[0069]制備色譜分離的條件同實(shí)施例1步驟⑴。
[0070]⑵將5個(gè)組分樣品采用iCelligence實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀按實(shí)施例1所述步驟進(jìn)行體外抗肝癌細(xì)胞模型篩選，確定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分具有體外抑制人肝癌細(xì)胞貼壁及增殖活性。
[0071 ] ⑶將第8號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分加入其體積的5倍5 %正己烷-乙醇混合液進(jìn)行溶解，溶解后過0.45 μ m的有機(jī)濾膜，得到含第8號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分的樣品溶液；所述含第8號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化組分的樣品溶液在以10 μπι XAmide為分離基質(zhì)的制備色譜上分離并減壓干燥，即得Fr8_l、Fr8-2、Fr8-3、Fr8_4 共 4 個(gè)樣品；
[0072]其中:
[0073]減壓濃縮的條件是指真空度為0.09MPa，溫度為50°C ;
[0074]制備色譜分離的條件同實(shí)施例1步驟⑵。<