鑒定的樣品序列與雞油菌復合種內的RPB1序列合并應用MEGA或PAUP軟件構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，檢驗未鑒定樣品的DNA條形碼序列與標準基因序列聚類在 一起的物種，若未知樣品與數(shù)據(jù)庫中的物種構成單支系，則鑒定為該物種。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點在于： 1、優(yōu)選RPB1基因作為最適合鑒別雞油菌（CciAariM)的DNA條形碼，相比于其他基 因，RPB1序列具有通用、易擴增、易比對的特點。
[0011] 2、建立了雞油菌ci如riM)的標準基因序列和樣品的鑒別方法，相比于傳統(tǒng) 的形態(tài)學鑒定方法，大大提高了鑒定效率。該方法對于樣品的完整程度要求低，鑒別指標能 夠量化，這對于及時判定該類野生食用菌的種質資源提供了有效的依據(jù)。此外，加入了形態(tài) 學混淆種并運用基于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設立鑒定規(guī)則進行鑒定，其鑒定的可靠性和 準確性也大大優(yōu)于常規(guī)的分子鑒定方法，彌補了該類野生食用菌分子鑒定的空白。
【附圖說明】
[0012] 圖1是待鑒定樣品序列及形態(tài)學混淆種和RPB1標準基因序列基于 Kimura-2-parameter模型的遺傳距離構建的NJ樹。
【具體實施方式】
[0013] 下面結合具體的實例對本發(fā)明做進一步說明： 實施例1 :待測樣品與雞油菌ci如riM)DNA條形碼鑒別標準基因片段的同源性鑒 定 1、雞油菌標本的采集：采集的7份來自云南省麗江、大理等地的樣品，新鮮子實體直接 剪取組織或用硅膠干燥備用。樣品及來源詳細信息見表1。
[0014] 表1樣品及來源信息 Ζ、出困 P乂
aiomigaiiAgenerungal gDNAMinipr印Kit試劑盒提取基因組DNA，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到 0. 5μg/μ1 〇
[0015] 3、擴增DNA片段，進行聚合酶鏈式（PCR)反應，即用特異的引物進行擴增，引物 對序列為正向引物TEF-630F: 5'CTTGTTCTAGTGGAGCGAGGAT3' 和反向引物TEF-630R:5'TTGGCAGGGTCGTTCTTC3'。PCR反應體系為 25μ1 :ddH2018μ1、PCRBuffer2. 5μl、MgCl2 2. 5μ1，dNTPs0· 5μ1，TaqDNA聚合酶0· 5μ1、DNA模板1μ1，不含染料；擴增程序： 95°C預變性3min，接下來94°C變性30s，50°C退火1min，72°C延伸1. 5min，一共進行35個 循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0016] 4、擴增產(chǎn)物上樣，用1. 0%的瓊脂糖凝膠、1XTBE電泳液中電泳檢測，使用 DNAmarker檢測PCR片段大小。若出現(xiàn)明顯清晰的630bp大小的條帶，且無雜帶，送生物測 序公司測序。
[0017] 5、首先用軟件Chromas中檢查測序后得到的序列峰圖質量，確定峰圖質量達到數(shù) 據(jù)分析的要求之后，用DNASTAR軟件包中的SeqMan進行正反向序列的拼接。將測序結果進 行手工校對、序列拼接，如果目的基因片段與所述基因序列SEQ ID NO. 1同源性在99%以 上，即可判斷所述的待測組織即為該菌。經(jīng)檢測，樣品LJ2-2、ZD12-2和XY2-13與標準基 因的同源性皆為100%，由此判定它們屬于雞油菌ciAariys)組織，而其余樣品CN2-2、 MHl-10、DL7-2和DL7-10與標準基因的同源性分別為93%、95. 1%、92%和91. 2%，不屬于雞油 菌（CciAariiA?)組織。
[0018] 實施例2 :運用系統(tǒng)發(fā)生樹法設立鑒定規(guī)則來鑒別物種 采用實施例1中所述步驟得到待測樣品的序列，將標準基因序列和待鑒定的樣品 序列合并應用MEGA基于Kimura-2-parameter模型重復1000次構建系統(tǒng)發(fā)育樹，待測 樣品（LJ2-2、ZD12-2和XY2-13)的DNA條形碼序列與標準基因序列聚類在一起，與C 和CciiMaAariiws的序列呈現(xiàn)明顯的分歧，說明待鑒定樣品可以鑒定為雞油 菌（Ccibarius、。
[0019]與傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法相比，本發(fā)明獲得的基因序列和運用的方法有利于實現(xiàn) 對雞油菌快速和準確的鑒定。
【主權項】
1. 一種雞油菌的DNA條形碼標準基因，其特征在于，所述DNA條形碼標準基因序列SEQ ID NO. 1 ： GAGAGGAGCGACTAAGGTGCACCTCACTGCACCCATGTCTATACATCACCTCTCTGCTTGCTTATAGAATT TATTATGTCTGGCGTGGTTCACTTGCGCCATCCGTCTATCATCCACCATCATGGTCATTGCCCATATACTGACTAC TCATTTCTCTATGTTACCGTGGTCGAAAACTCGCAATAGTCGGATCATGCTTTCATTGAACGTCTCAAACATATACG TGATGTCAAGGTTCGAATGGCAAAGGTCCACGACCACTGCAAGGGCAAGATGATTTGTGACGCCACCGAGCCGGAGC TTGACGGTGATGGCCAGCCTTTGCCAGTTCTGGATGCGTTAACAAAGATTGGTTGTGGTCACGTTCAACCCTCGATC CGTAAAGAAGGTTTGAAATTATTTATGGTGTATAAGAAGTCAAAAGATGAGGATGAGCAGGTGTGTGCCCTGCCTCC TTTTTTTTCAAGTATGATCGACCTGTGTTGCAGGACATGCGATTGGCCTTGCCAGACAAGCGCCTGTTCACGGCTTT GGAGGTCTACAACAACTTGCGCAAGATATCCGATGAACATCTTGAGCTTATGGGGTTATCTGTGGAATATGCTCGAC CTGAATGGATGATACTTACTG。2. 應用權利要求1所述的標準基因進行分子鑒定的方法，其特征在于，包括以下4個步 驟： (1)從樣品組織中分離提取基因組DNA ; ⑵以步驟（1)所提取的基因組DNA為模板，用雞油菌RPBl特異性引物，進行聚合酶 鏈式反應； (3) 對步驟（2)擴增得到的DNA產(chǎn)物進行測序； (4) 將測序結果進行手工拼接，與所述基因序列RPBl的進行同源性比對，若同源性在 99%以上，即可將該樣品鑒定為雞油菌（ciAariiA?)。3. 根據(jù)權利要求2所述的分子鑒定的方法，其特征在于，所述RPBl特異性引物序列 為： 正向引物 RPBl-S 5' -TTTGGGCGGTGAGGACTA-3'， 反向引物 RPBl-A 5' -GTGGGACGGGTAAGACAG-3'。4. 根據(jù)權利要求2所述的分子鑒定的方法，其特征在于，所述聚合酶鏈式反應中，其擴 增條件為95°C預變性3min，接下來94°C變性30s，50°C退火I min，72°C延伸1.5min，一共 進行30-35個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。5. 根據(jù)權利要求2所述的分子鑒定的方法，其特征在于，所述DNA產(chǎn)物長度為630bp。
【專利摘要】本發(fā)明涉及雞油菌復合種的標準基因及分子鑒定方法，屬真菌物種鑒定領域。本發(fā)明引物序列：RPB1-S？5ˊ-TTTGGGCGGTGAGGACTA-3ˊ，RPB1-A？5ˊ-GTGGGACGGGTAAGACAG-3ˊ，該通用引物可針對雞油菌RNA聚合酶Ⅰ大亞基基因（RPB1）基因進行擴增，獲得標準檢測基因。根據(jù)RPB1基因DNA序列的差異，可以快速準確鑒定雞油菌復合種內的各個物種。本發(fā)明的有益效果在于：RPB1基因克服了傳統(tǒng)雞油菌形態(tài)不易鑒定的缺點，具有通用、易擴增、易比對的特點，其鑒定的可靠性和準確性也大大提高，為雞油菌的種質資源挖掘、保護和利用提供有力的研究工具。
【IPC分類】C12N15/31, C12Q1/04, C12Q1/68
【公開號】CN105238796
【申請?zhí)枴緾N201510569031
【發(fā)明人】張穎, 劉春麗, 徐建平, 余澤芬, 張克勤
【申請人】云南大學
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年9月9日