鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鴨痘病毒檢測(cè)方法，尤其涉及一種鴨痘 病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法；此外，本發(fā)明還涉及檢測(cè)鴨痘病毒的引物和探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨痘病毒（duck poxvirus)為痘病毒科（Poxviridae),脊椎動(dòng)物痘病毒亞科 (Chordopoxvirinae )，禽痘病毒屬（Avipoxvirus )的成員。鴨痘是由鴨痘病毒引起家鴨或野 生水禽的一種病毒性傳染病，臨床表現(xiàn)為體表無(wú)羽毛部位出現(xiàn)散在的、結(jié)節(jié)狀的增生性皮 膚病灶(皮膚型)，或上呼吸道、口腔和食管黏膜出現(xiàn)纖維素性壞死和增生性病灶（白喉型)， 也可能同時(shí)發(fā)生全身性感染。禽群發(fā)生溫和性皮膚型鴨痘時(shí)，死亡率較低，但影響動(dòng)物采 食和生長(zhǎng)；而發(fā)生全身性感染，特別是白喉型鴨痘，或者有并發(fā)感染或飼養(yǎng)管理差時(shí)，死亡 率較高，可給養(yǎng)鴨業(yè)造成較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。過(guò)去，鴨痘主要在北美地區(qū)的麻鴨（mallard duck)、黑嘴天鵝（trumpeter swan)、北美斑鴨（mottled duck)、赤頭鴨（red head duck)和 藍(lán)翅鴨（blue-winged teal)等野生水禽中被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，我國(guó)部分地區(qū)的麻鴨飼養(yǎng)場(chǎng)也 相續(xù)暴發(fā)鴨痘疫情，并造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鴨痘是由痘病毒引起的一種急性傳染病。其臨診特征是在皮膚、口腔 或眼睛上出現(xiàn)痘斑癥狀和病變：病初體溫稍高，遲鈍，食欲下降，產(chǎn)蛋下降或完全停止。鴨 痘的病癥有以下幾種形式：1、皮膚型 ：在鴨的嘴角和與鴨喙連接的皮膚上、眼瞼處皮膚上 出現(xiàn)大小不等的結(jié)節(jié)狀痘樣疹，并經(jīng)常匯集成較大的疣狀結(jié)節(jié)：其他如跗跖關(guān)節(jié)以下的足 部趾或蹼上，也會(huì)出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀痘樣疹，此病例約占3 %。2、口腔型：最初在口腔黏膜上現(xiàn) 灰白色痘疹，在口角處有結(jié)節(jié)樣疹痘疹逐漸變黃，后期形成潰瘍，經(jīng)I 〇?I 5 d愈合， 不形成偽膜。3、眼型：病初有水樣分泌物，后來(lái)逐漸成膿性結(jié)膜炎，常將上下眼瞼黏、合在一 起，嚴(yán)重時(shí)町導(dǎo)致一側(cè)或兩側(cè)眼睛失明。一般鴨痘的病變除化膿外，痘樣結(jié)節(jié)狀病變干涸 后成痂，痂脫落后留一下一暫時(shí)性的瘢痕。很多養(yǎng)鴨專業(yè)戶沒(méi)有遇見過(guò)鴨痘病毒，所以即使 看見癥狀也無(wú)法進(jìn)行判斷而失去了防病治病的時(shí)機(jī)。 由于鴨痘在我國(guó)是新發(fā)現(xiàn)的疫病，目前尚缺乏針對(duì)性的檢測(cè)技術(shù)和方法，無(wú)法開展相 關(guān)病原學(xué)和流行病學(xué)研究，以科學(xué)評(píng)估該病對(duì)家養(yǎng)麻鴨、其他品種家禽和野生禽類的危害 及其程度，并制訂出針對(duì)性的防控措施。因此，迫切需要發(fā)展快速、準(zhǔn)確的鴨痘病毒檢測(cè)方 法。
[0004] 近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表 達(dá)水平分析、突變和多態(tài)性研究、病原體的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用。熒光定量 PCR定義：是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反 應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò) cr值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析。探 針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR原理：PCR擴(kuò)增時(shí)在體系中含有引物的基礎(chǔ)上再加入一個(gè)特異性的 突光探針，該探針為一寡核苦酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告突光基團(tuán)（R)和一個(gè)淬滅突光基 團(tuán)（Q)。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信 號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5 '一 3 '外切核酸 酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。目 前仍末見探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)用于鴨痘病毒檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)當(dāng)前鴨痘病毒特異性檢測(cè)技術(shù)手段的缺乏，提供一種鴨痘 病毒的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物和探針。該檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)100個(gè)拷貝 的病毒分子，對(duì)于單個(gè)樣本檢測(cè)時(shí)間為2個(gè)小時(shí)，可同時(shí)進(jìn)行大批量的樣本檢測(cè)，具有良好 的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鴨痘病毒快速準(zhǔn)確檢測(cè)并鑒定的目的。
[0006] 在本發(fā)明的一方面，提供一種鴨痘病毒的實(shí)時(shí)突光PCR檢測(cè)方法，其特征包括： (1) 針對(duì)鴨痘病毒P4b基因設(shè)計(jì)能夠檢測(cè)鴨痘病毒的特異性引物和探針序列； (2) 采用FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5任意一種熒光素標(biāo)記探針序 列； (3) 將用于檢測(cè)鴨痘病毒的引物和探針置于同一反應(yīng)管中，使用熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。
[0007] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)鴨痘病毒的引物，其特異性引物對(duì)序列 為： 上游引物：5 ' -TGCTAAACAACAAAGGCCTATGC-3 '， 下游引物：5' -TCCAGAATCTGGGACACTTTTACA-3'。
[0008] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)鴨痘病毒的探針，其特異性探針序列 為：5' -CTTCGCAGTAGCAAACAAAAGCCCGAT-3'。
[0009] 在本發(fā)明的另一方面，提供檢測(cè)鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序，上述 步驟（3)中所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95°C 5min;然后95°C 3〇sec， 60°C 30sec 循環(huán) 40 次。
[0010] 本發(fā)明采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR進(jìn)行鴨痘病毒的特異性檢測(cè)，具有以下優(yōu)點(diǎn)： (1) 特異性好，由于TaqMan熒光探針能基于核酸雜交原理對(duì)被檢分子進(jìn)行甄別，具有 極高的準(zhǔn)確性，同時(shí)，靶序列由引物和熒光探針雙重控制，特異性好，假陽(yáng)性低； (2) 靈敏度高，熒光檢測(cè)技術(shù)是極靈敏的檢測(cè)技術(shù)，本方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)100個(gè)拷 貝的病毒分子； (3) 可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量，由于熒光信號(hào)的強(qiáng)度和每次擴(kuò)增產(chǎn)物量成意義對(duì)應(yīng)的線性關(guān) 系，通過(guò)熒光信號(hào)的檢測(cè)可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量。
[0011] (4)操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高，擴(kuò)增和檢測(cè)一步完成。
[0012] (5)養(yǎng)殖戶通過(guò)本發(fā)明的鴨痘病毒檢測(cè)方法，能夠盡快知道是否鴨子患有鴨痘病 毒，及早采取措施，減少損失。
[0013]
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的有效性試驗(yàn)結(jié)果。曲 線1~4為4份鴨痘樣品的特異性擴(kuò)增曲線，Ct值均小于32 ;曲線5~8為陰性對(duì)照冰)擴(kuò)增 結(jié)果，無(wú) Ct值并且無(wú)特異性的擴(kuò)增曲線。
[0015] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果。曲 線1為鴨痘組織樣品（TDl)的特異性擴(kuò)增曲線，Ct值均小于32 ;曲線2~11分別為H9N2亞 型禽流感病毒、H5N2亞型禽流感病毒、鴨黃病毒、鴨肝炎病毒、新城疫病毒、山羊痘病毒、雞 痘病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒和陰性對(duì)照(水）擴(kuò)增結(jié)果，無(wú) Ct值并且無(wú)特異性的擴(kuò)增曲 線。
[0016] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏性試驗(yàn)結(jié)果。曲 線分別為100、101、102、103、104、105和106個(gè)拷貝數(shù)陽(yáng)性模板的擴(kuò)增曲線。由圖3 表明該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)100個(gè)拷貝。
[0017]
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施 例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按常規(guī)條件。
[0019] 實(shí)施例1 鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的有效性試驗(yàn) 1、設(shè)計(jì)引物和探針 針對(duì)鴨痘病毒P4b基因設(shè)計(jì)能夠檢測(cè)鴨痘病毒的特異性引物和探針序列： 上游引物：5 ' -TGCTAAACAACAAAGGCCTATGC-3 '， 下游引物：5' -TCCAGAATCTGGGACACTTTTACA-3'。
[0020] 熒光探針：5' -CTTCGCAGTAGCAAACAAAAGCCCGAT-3' 上下游引物和熒光探針均由Life公司合成，其中熒光探針5'末端標(biāo)記有熒光基團(tuán) FAM，3'末端偶聯(lián)淬滅基團(tuán)BHQl。
[0021] 2、提取鴨痘病毒DNA 取患病鴨組織樣品，加無(wú)菌生理鹽水研磨成組織懸液，用TakaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit (大連寶生物公司）提取樣品DNA。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 針對(duì)鴨痘病毒P4b基因設(shè)計(jì)能夠檢測(cè)鴨痘病毒的特異性引物和探針序列； (2) 采用FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5任意一種熒光素標(biāo)記探針序 列； (3) 將用于檢測(cè)鴨痘病毒的引物和探針置于同一反應(yīng)管中，使用熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（1)所 述的特異性引物對(duì)序列為：上游引物：5' -TGCTAAACAACAAAGGCCTATGC-3';下游引物：5' -TC CAGAATCTGGGACACTTTTACA-3'。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（1)所 述的特異性探針序列為：5' -CTTCGCAGTAGCAAACAAAAGCCCGAT-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于：步驟 (3)中所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95°C 5min;然后95°C 3〇sec，60°C 30sec循環(huán)40次。
5. -種用于鴨痘病毒的檢測(cè)方法，包括權(quán)利要求1所述的針對(duì)鴨痘病毒檢測(cè)的實(shí)時(shí)突 光PCR檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物和探針。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物和探針，根據(jù)禽痘病毒基因組DNA中P4b基因序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)和探針，建立了鴨痘病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，本方法具有靶序列由引物和熒光探針雙重控制，特異性好，假陽(yáng)性低，靈敏度高，可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量，操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高，擴(kuò)增和檢測(cè)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)鴨痘病毒快速準(zhǔn)確檢測(cè)并鑒定。
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-93, C12N15-11
【公開號(hào)】CN104611468
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510076187
【發(fā)明人】鄭敏, 曹慧慧, 孫文超, 韋顯凱, 蒙振畝, 鄭列豐, 蘇嬌秀, 梁晟, 李軍
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心
【公開日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日