一種阿巴卡韋個(gè)體化用藥檢測(cè)試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及阿己卡韋用藥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種阿己卡韋個(gè)體化用藥檢測(cè) 試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[000引阿己卡韋（油acavir，簡(jiǎn)稱ABC,商品名：Ziagen)是一種抗艾滋病新藥，為新的碳 環(huán)2' -脫氧鳥巧核巧類藥物，其口服生物利用度高，易滲入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。與其他核巧類逆 轉(zhuǎn)錄酶抑制劑一樣，阿己卡韋是一個(gè)無活性的前藥，在體內(nèi)經(jīng)4個(gè)步驟代謝成為具活性的 =憐酸醋，并通過W下2條途徑發(fā)揮抑制人免疫缺陷病毒化IV)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用：①競(jìng)爭(zhēng)性 地抑制2'-脫氧鳥巧S憐酸醋（dGTP)ONA合成片段之一）結(jié)合進(jìn)入核酸鏈；②通過阻止新 堿基的加入而有效地終止DNA鏈的合成。
[0003] 近年來的研究表明，HLA-B基因的多態(tài)性與藥物不良反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。2008 年美國食品藥品監(jiān)督管理局（抑A)發(fā)布有關(guān)阿己卡韋和含阿己卡韋藥物的安全信息，指出 攜帶HLA-B巧701基因的HIV感染者使用阿己卡韋更易發(fā)生阿己卡韋超敏反應(yīng)（ABCHSR)。 阿己卡韋超敏反應(yīng)是一種多器官綜合征，會(huì)出現(xiàn)兩種或兩種W上的體征或癥狀，包括發(fā)熱、 皮疹、胃腸道反應(yīng)、呼吸系統(tǒng)反應(yīng)和全身性反應(yīng)。超敏反應(yīng)通常出現(xiàn)在治療早期或治療開始 的前六周，然而，由于癥狀較多W及合并用藥的影響，難W在早期確診。
[0004]CFDA在2015年發(fā)布的《藥物代謝酶和藥物作用祀點(diǎn)基因檢測(cè)技術(shù)指南（試行）》 中指出："攜帶HLA-B巧701等位基因者慎用阿己卡韋，W免引起藥物性肝損害。"因此，HIV 感染者在使用ABC藥物之前，必須篩查HLA-B巧701基因，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性，即患者不攜帶 HLA-B巧701基因方可使用ABC藥物。
[0005]HLA-B巧701的檢測(cè)手段主要有血清學(xué)檢測(cè)法、PCR-直接測(cè)序法（PCR-SBT)和巧 光PCR法，然而通過血清學(xué)檢測(cè)進(jìn)行HLA分型，結(jié)果并不精確?，F(xiàn)在一般則是通過測(cè)序來 分析HLA的基因型，盡管運(yùn)種方法能得到最準(zhǔn)確的基因序列信息，但是消耗時(shí)間較長且成 本較高，并不適合在檢測(cè)時(shí)大規(guī)模推廣，所W在臨床上并不適用；巧光PCR法雖然相對(duì)操 作容易，耗時(shí)也少于直接測(cè)序法，但是依舊依賴于較為昂貴的檢測(cè)設(shè)備和探針，很難在偏 遠(yuǎn)或經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的地區(qū)普及推廣。因此，有必要開發(fā)出能W極低的成本快速準(zhǔn)確得檢測(cè) HLA-B巧701的方法。
[0006] 新近研究發(fā)現(xiàn)，在HLA-B基因座附近的SNP位點(diǎn)rs2395029的G等位基因與 HLA-B巧701高度連鎖，二者的敏感性為100%，運(yùn)為HLA-B巧701的檢測(cè)提供了一個(gè)新的視 角，即我們可W通過避免直接對(duì)HLA-B的序列分析，而只是檢測(cè)rs2395029的堿基狀況來間 接得知檢測(cè)樣本是否存在HLA-B巧701。
[0007]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediatedIsothermalAmplification,LAMP)技術(shù)是日本 科學(xué)家于2000年開發(fā)出來的一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，針對(duì)祀基因的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四條特異性 引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下恒溫?cái)U(kuò)增，可在十幾分鐘到一小時(shí)之內(nèi)產(chǎn)生IO9-IQin數(shù) 量級(jí)的產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)束后通過肉眼直接觀察體系狀態(tài)的改變來判定待測(cè)樣本的基因型，無 需開管，因此大大簡(jiǎn)化了操作步驟，同時(shí)又可W有效避免樣本交叉污染，而且，僅需普通水 浴鍋即可開展檢測(cè)，又節(jié)約了大量的檢測(cè)成本。因此，采用LAMP方法檢測(cè)HLA-B巧701的基 因型是一種新型且適于大規(guī)模使用的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的問題是現(xiàn)有的檢測(cè)HLA-B巧701的方法不理想，不適于大規(guī)模推 廣使用。
[0009] 為解決上述問題，本發(fā)明在LAMP的基礎(chǔ)上采用等位基因特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (Allele-SpecificLAMP)技術(shù)，針對(duì)HLA-B巧701的標(biāo)簽SNP進(jìn)行檢測(cè)，提供了一種適于推 廣使用的試劑盒及檢測(cè)方法。
[0010] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種阿己卡韋個(gè)體化用藥檢測(cè)引物，用于檢測(cè) HLA-B巧701的標(biāo)簽SNPrs2395029的G等位基因，包括W下引物：
[0017] 本發(fā)明提供的引物中，BIP是針對(duì)rs2395029G等位基因的特異性引物。為了避免 潛在的非特異干擾，人為地在BIP中引進(jìn)了了一個(gè)突變點(diǎn)。運(yùn)個(gè)突變點(diǎn)可增加了引物的特 異性，降低非特異擴(kuò)增的可能性，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
[0018] 優(yōu)選地，所述F3、B3、FIP、BIP均為HPLC純化法純化后的引物。
[0019] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種阿己卡韋個(gè)體化用藥檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒 包括檢測(cè)rs2395029位點(diǎn)基因型進(jìn)而檢測(cè)HLA-B巧701的組合物。所述組合物包括上述的 引物，還包括dNTP、緩沖液、Bst聚合酶和超純水。
[0020] 進(jìn)一步地，所述組合物還包括用于顯示組合物顏色的指示劑。
[0021] 優(yōu)選地，所述指示劑為巧黃綠素和氯化儘的組合物或者為徑基糞酪藍(lán)。
[0022] 優(yōu)選地，若指示劑為巧黃綠素和氯化儘的組合物，巧黃綠素為25iiM，氯化儘為 0. 5mM。若指示劑為徑基糞酪藍(lán)，其為120yM。
[0023] 進(jìn)一步地，所述組合物還包括添加劑。所述添加劑為甜菜堿或二甲基亞諷中的一 種。若添加劑為甜菜堿，其濃度大于等于0,小于等于1M。若添加劑為二甲基亞諷，其濃度 大于等于0,小于等于10% (體積分?jǐn)?shù)）。
[0024] 優(yōu)選地，所述組合物中，F(xiàn)3和B3均為0. 4yM，F(xiàn)IP和BIP均為1. 6yM。
[00巧]進(jìn)一步地，所述緩沖液包括：Tris-肥1 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4l〇mM，M拆〇44mM，Tween-20 0.1 % (體積分?jǐn)?shù)）。
[0026] 優(yōu)選地，所述組合物中dNTP為1. 4mM，Bst聚合酶為8000U/mL。
[0027] 本發(fā)明的第=個(gè)目的在于提供一種阿己卡韋個(gè)體化用藥檢測(cè)方法。所述檢測(cè)方 法，使用上述的阿己卡韋個(gè)體化用藥檢測(cè)試劑盒，具體為：將待檢測(cè)的核酸加入到所述組合 物中，得到的反應(yīng)體系于55~70°C下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后觀察體系的變化。
[0028] 進(jìn)一步地，所述待檢測(cè)的核酸在反應(yīng)體系中的濃度為0.8~4ng/y L。
[0029] 優(yōu)選地，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系進(jìn)行滅活處理。滅活處理使得體系中的酶失活， 防止體系放置時(shí)間長時(shí)發(fā)生非特異性擴(kuò)增。
[0030] 優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為63 °C。
[0031] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)時(shí)間為40~120min。
[0032] 在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，反應(yīng)前體系為澄清狀態(tài)，發(fā)生陽性反應(yīng)時(shí)，儀離子與副產(chǎn) 物焦憐酸形成沉淀，體系產(chǎn)生肉眼可見的沉淀，變?yōu)闇啙釥顟B(tài)。觀察體系狀態(tài)的變化可W直 接判定是否發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。
[0033] 當(dāng)體系中存在指示劑時(shí)：（1)若指示劑為徑基糞酪藍(lán)，反應(yīng)前體系中的儀離子與 dNTP馨合，體系呈現(xiàn)紫羅蘭色；當(dāng)有陽性反應(yīng)時(shí)，儀離子與副產(chǎn)物焦憐酸形成沉淀，溶液抑 發(fā)生改變，顏色逐漸由紫羅蘭色變?yōu)樘焖{(lán)色；（2)若指示劑為巧黃綠素和氯化儘的組合物 時(shí)，反應(yīng)前巧黃綠素與氯化儘中的儘離子結(jié)合，體系呈現(xiàn)黃色；當(dāng)有陽性反應(yīng)時(shí)，副產(chǎn)物焦 憐酸與儘離子結(jié)合生成沉淀，巧黃綠素與體系中的儀離子結(jié)合，顏色逐漸由黃色變?yōu)榍晒?綠色。觀察反應(yīng)體系顏色和/或狀態(tài)的變化可W直接判定是否發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。
[0034] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：（1)本發(fā)明采用Allele-SpecificLAMP技術(shù)， 針對(duì)rs2395029的G等位基因設(shè)計(jì)了特異引物，利用rs2395029的G等位基因與HLA-B巧701 的關(guān)聯(lián)性判斷患者是否攜帶HLA-B巧701等位基因，從而指導(dǎo)阿己卡韋個(gè)體化用藥，避免直 接測(cè)試HLA-B巧701。（2)本發(fā)明采用Allele-SpecificLAMP技術(shù)，設(shè)計(jì)的引物特異性好。 檢測(cè)時(shí)，只有運(yùn)4條引物能完全與待檢測(cè)的模板配對(duì)時(shí)才能引發(fā)后續(xù)的擴(kuò)增，提高了檢測(cè) 的特異性、準(zhǔn)確性。（3)本發(fā)明運(yùn)用Allele-SpecificLAMP技術(shù)，設(shè)計(jì)了特異引物，測(cè)試后， 觀察反應(yīng)體系的狀態(tài)變化（是否有沉淀或者顏色的變化）即可判斷是否發(fā)生陽性反應(yīng)，肉 眼即可進(jìn)行判斷，無需額外的裝置設(shè)備，簡(jiǎn)便易行。（4)使用本發(fā)明提供的檢測(cè)引物、試劑盒 和方法進(jìn)行檢測(cè)，所需要的設(shè)備僅是水浴鍋或金屬浴或者熱循環(huán)儀，檢測(cè)成本低、檢測(cè)耗時(shí) 較短。且本檢測(cè)方法不需要額外的開管檢測(cè)，因此有效避免了交叉污染的產(chǎn)生，提高了檢測(cè) 的準(zhǔn)確性。
[0035] 本發(fā)明提供的試劑盒成本低廉、檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確性高，易于推廣。
【附圖說明】
[0036] 圖1是檢測(cè)樣本1