一種基于磁性可回收納米抗菌劑的膠原凈化及防腐方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于磁性可回收納米抗菌劑的膠原凈化及防腐方法，屬于生物質(zhì)材料領域。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原蛋白是動物結(jié)締組織中的主要成分，也是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質(zhì)總量的25%?30%，與組織的形成、成熟、細胞間信息的傳遞，以及關(guān)節(jié)潤滑、傷口愈合、鈣化作用、血液凝固和衰老等有著密切的關(guān)系。目前，膠原蛋白憑借其低免疫原性、生物相容性、有利于細胞貼附和迀移、可降解及凝血性等優(yōu)異性能已成為生物科技產(chǎn)業(yè)最關(guān)鍵的原材料之一，在生物醫(yī)學、化妝品、食品工業(yè)等領域均有著廣泛應用。
[0003]然而，受自身結(jié)構(gòu)因素的影響，天然膠原蛋白極易受到細菌、霉菌等微生物侵蝕。微生物在生長繁殖的過程中，會酶解膠原蛋白產(chǎn)生雜質(zhì)，降低膠原蛋白制品品質(zhì)，使膠原蛋白失去活性。除此之外，微生物的不斷增殖和代謝極易導致膠原制品中微生物內(nèi)毒素含量增加。因此，基于膠原蛋白質(zhì)的制品，尤其是應用于生物醫(yī)藥領域的膠原蛋白制品在制備期間必須作殺菌、防腐處理。
[0004]將小分子抗菌劑(如氯仿、苯甲酸鈉、山梨酸鉀等)添加至膠原溶液中是目前最常用、最有效的膠原蛋白凈化防腐方法。然而，這些小分子抗菌劑或多或少存在生理毒性，一旦被添加至膠原溶液中，將無法從膠原溶液中徹底分離、回收，一部分有毒的小分子抗菌劑將永久存在于膠原溶液中，影響膠原蛋白自身優(yōu)異的生物相容性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，而提供一種基于磁性可回收納米抗菌劑的膠原凈化及防腐方法，其特征在于該方法的工藝步驟和條件如下(其中所述物料的份數(shù)均為重量份數(shù)):
(I)磁性可回收納米抗菌劑的制備:
(1.1)表面含雙鍵的磁性納米顆粒的制備:將1-10份磁性納米顆粒分散于150-200份乙醇體積分數(shù)為90%的水溶液中，然后滴加2-8份硅烷偶聯(lián)劑，并于室溫下攪拌20-50分鐘；然后滴加4-16份引發(fā)劑，同時升溫至40-60°C反應4-8小時，獲得的產(chǎn)物用磁鐵進行分離并用無水乙醇反復洗滌，烘干至恒重后即得表面含雙鍵的磁性納米顆粒；
(1.2)氟喹諾酮乙烯基化:將氟喹諾酮10-20份、催化劑4-8份與溶劑300-500份混合均勻，于0-5°C攪拌30-60分鐘，隨后在持續(xù)攪拌和惰性氣體保護下滴加乙烯基化試劑4-8份，滴加完畢后升溫至20-35°C反應1-2.5小時；反應完畢后，將以上混合物倒入沉淀劑中，產(chǎn)物經(jīng)反復水洗、烘干即得乙烯基化氟喹諾酮；
(1.3)磁性可回收納米抗菌劑的制備:將5-10份表面含雙鍵的磁性納米顆粒分散于300-500份溶劑中，在持續(xù)攪拌和惰性氣體保護下加入0.7-1.2份引發(fā)劑，在20-40°C下攪拌10-30分鐘后滴加4-8份乙烯基化氟喹諾酮和30-40份丙烯酸，滴加完畢后升溫至40-80°C反應20-30小時，反應結(jié)束后，產(chǎn)物用磁鐵分離并用濃度為0.05-lmol/L的堿水溶液反復洗滌，烘干至恒重，得到磁性可回收納米抗菌劑；
(2)膠原的凈化及防腐處理:以無菌操作在100份濃度小于或等于lmg/mL的膠原溶液中加入0.3-3份以上制得的磁性可回收納米抗菌劑，并在室溫條件下攪拌1-3小時，然后用磁鐵將抗菌劑吸附、分離、回收，最后以無菌操作將凈化后的膠原溶液密封并保存。
[0006]以上方法中步驟(1.1)所述磁性納米顆粒為粒徑為10_50nm的Fe3Ozp γ-Fe2O3中一種或多種。
[0007]以上方法中步驟(1.1)所述硅烷偶聯(lián)劑為甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(β_甲氧基乙氧基)硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷中的一種或多種。
[0008]以上方法中步驟(1.1)所述引發(fā)劑為鹽酸、冰乙酸、硝酸、磷酸、氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀中的一種或多種。
[0009]以上方法中步驟(1.2)所述氟喹諾酮為諾氟沙星、沙氟沙星、環(huán)丙沙星、羅氟哌酸、加替沙星、依諾沙星、司氟沙星中的一種或多種。
[0010]以上方法中步驟(1.2)所述催化劑為A1C13、BF3、碳酸鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉、吡啶、三乙胺、4-吡咯烷基吡啶和4- 二甲氨基吡啶中的一種或多種。
[0011]以上方法中步驟(1.2)所述沉淀劑為正己烷、環(huán)己烷、環(huán)戊烷中的一種或多種。
[0012]以上方法中步驟(1.2)所述溶劑為二氯甲烷、二氯乙烷、四氫呋喃、W I 二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺中的一種或多種。
[0013]以上方法中步驟(1.2)所述乙烯基化試劑為丙烯酰氯、丙烯酰溴、4-戊烯酰氯、己-5-烯酰氯中的一種或多種。
[0014]以上方法中步驟(1.3)所述溶劑為甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶、四氫呋喃、W I 二甲基甲酰胺、W I 二甲基乙酰胺、二甲亞砜中的一種或多種。
[0015]以上方法中步驟(1.3)所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二環(huán)己腈、過氧化環(huán)己酮、過氧化二苯甲酰、過氧化苯甲酸特丁酯、叔丁基過氧化氫中的一種或多種。
[0016]以上方法中步驟(1.3)所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀中的一種或多種。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下積極效果:
1、氟喹諾酮抗菌劑自身抗菌譜廣、抗菌活性強。其7位哌嗪環(huán)上的胺基基團是氟喹諾酮抗菌劑非藥效活性位點，該基團與丙稀酰氯、丙稀酰溴、4-戊稀酰氯、己-5-稀酰氯間?；磻哂懈叨葘Ｒ恍?，對氟喹諾酮抗菌劑基本母核結(jié)構(gòu)域及各增效取代基并無影響，因此在對氟喹諾酮乙烯基化后，并不會影響氟喹諾酮抗菌劑自身生物活性；這些乙烯基化氟喹諾酮被固定于磁性納米顆粒表面后，所獲得的磁性可回收納米抗菌劑仍然抗菌譜廣、抗菌效率高。
[0018]2、氟喹諾酮抗菌劑的疏水性較強，在水中的溶解度較??；另一方面，磁性納米Fe3Ozp γ-Fe2O3顆粒在水中又容易沉淀。本發(fā)明采用丙稀酸與乙稀基化氟喹諾酮共聚，在磁性納米顆粒表面形成抗菌殼層，由于表面含有大量丙烯酸(含親水羧基)，制備的磁性可回收納米抗菌劑在膠原水溶液中可以很好地分散，保證了殺菌作用范圍的全面性和徹底性。
[0019]3、本發(fā)明將氟喹諾酮抗菌劑共價固定于磁性納米顆粒表面，在防腐處理過程中，抗菌劑分子不會從納米顆粒表面脫落、釋放出來，在防腐處理完畢后，這些磁性納米抗菌劑在磁場作用下可徹底地從膠原溶液中分離、回收，抗菌劑分子不會殘留于膠原溶液中，不會影響膠原蛋白自身結(jié)構(gòu)及其優(yōu)異的生物相容性。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明所涉及的磁性可回收納米抗菌劑的合成路線。
[0021]圖2為本發(fā)明所涉及的磁性可回收納米抗菌劑用于膠原溶液凈化及防腐處理效果圖。
【具體實施方式】
[0022]下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限定，該領域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。
[0023]實施例1:
(1)制備表面含雙鍵的磁性納米顆粒:將0.6份粒徑為1nm的納米Fe3O4和0.4份粒徑為50nm的γ -Fe2O3分散于150份乙醇體積分數(shù)為90%的水溶液中，然后滴加2份乙烯基三甲氧基硅烷，并于室溫下攪拌20分鐘；然后滴加4份冰乙酸，同時升溫至40°C反應4小時，獲得的產(chǎn)物用磁鐵進行分離并用無水乙醇反復水洗，烘干至恒重后即得表面含雙鍵的磁性納米顆粒；
(2)制備乙烯基化環(huán)丙沙星:將環(huán)丙沙星10份、吡啶4份和二氯甲烷300份混合均勻，于(TC攪拌30分鐘，隨后在持續(xù)攪拌和惰性氣體保護下滴加丙烯酰氯4份，滴加完畢后升溫至20°C反應I小時；反應完畢后，將以上混合物倒入環(huán)己烷中，沉淀經(jīng)反復水洗、烘干即得乙烯基化環(huán)丙沙星；
(3)合成磁性可回收納米抗菌劑:將5份以上制得的表面含雙鍵的磁性納米顆粒分散于300份二甲亞砜中，在持續(xù)攪拌和惰性氣體保護下加入0.7份偶氮二異庚腈，在40°C下攪拌10分鐘后滴加4份乙烯基化環(huán)丙沙星和30份丙烯酸，滴加完畢后升溫至80°C反應20小時，反應結(jié)束用磁鐵分離并用lmol/L碳酸鉀溶液反復洗滌，烘干至恒重，得到磁性可回收納米抗菌劑；
(4)以無菌操作在100份濃度為0.8mg/mL的膠原溶液中加入0.3份以上制得的磁性可回收納米抗菌劑，并在室溫條件下攪拌I小時，然后用磁鐵將抗菌劑吸附回收，使膠原溶液與之分離，最后以無菌操作將分離出來的膠原溶液密封并保存。
[0024]采用以上方法對膠原溶液進行處理后，通過平板計數(shù)法測定磁性可回收納米抗菌劑的殺菌率為100% ;對凈化后的膠原進行光電子能譜分析，凈化后的膠原中無任何納米抗菌劑殘留；對凈化后膠原的紅外光譜和圓二色譜結(jié)果進行分析后發(fā)現(xiàn)，以上處理方法并沒有破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)。
[0025]實施例2:
(I)制備表面含雙鍵的磁性納米顆粒:將3份粒徑為20nm的納米Fe3O4分散于170份乙醇體積分數(shù)為90%的水溶液中，然后滴加6份甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷，并于室溫下攪拌30分鐘；然后滴加4份氨水和4份碳酸鈉，同時升溫至50°C反應5小時，獲得的產(chǎn)物用磁鐵進行分離并用無水乙醇反復水洗，烘干至恒重后即得表面含雙鍵的磁性納米Fe3O4;
(2)制備乙烯基化諾氟沙星:將諾氟沙星13份、三乙胺5份和二氯甲烷400份混合均勻，于2°C攪拌40分鐘，隨后在持續(xù)攪拌和惰性氣體保護下滴加丙烯酰氯5份，滴加完畢后升溫至25°C反應1.5小時；反應完畢后，將以上混合物倒入環(huán)戊烷中，沉淀經(jīng)反復水洗、烘干即得乙烯基化諾氟沙星；
(3)合成磁性可回收納米抗菌劑:將6份表面含雙鍵