一種高純度二十碳五烯酸乙酯濃縮物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種魚油濃縮物，其包含ω-3型長鏈多不飽和脂肪酸一二十碳五烯 酸（ΕΡΑ)，更具體地，涉及EPA乙酯濃縮物，其包含按油的重量百分含量計至少96. 5%的EPA 乙酯并且反-5,順-8, 11，14, 17-二十碳五烯酸乙酯、反-11，順-5, 8, 14, 17 -二十碳五烯 酸乙酯、反-14,順-5, 8, 11，17-二十碳五烯酸乙酯、反-17,順-5, 8, 11，14-二十碳五烯酸 乙酯、反-8, 17,順-5, 11，14-二十碳五烯酸乙酯的含量均低于0. 3%，同時濃縮物的過氧化 值低于2,茴香胺值低于5。
【背景技術(shù)】
[0002] 二十碳五烯酸(順式-5, 8, 11，14, 17-二十碳五烯酸；ΕΡΑ)是一種人類不能自身合 成的必需脂肪酸，屬ω-3型長鏈多不飽和脂肪酸，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、提高免疫功能、舒張血 管、降低血清膽固醇和低密度血脂蛋白水平、減少血小板凝聚、抗炎、抗癌等作用，高純度的 EPA可用于防治動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、炎性病癥、腫瘤、老年癡呆等疾病，在醫(yī)藥制 藥領(lǐng)域極有發(fā)展前景。
[0003] 然而，由于EPA的結(jié)構(gòu)中具有多個不飽和的雙鍵，均以順式構(gòu)象存在，在分離純化 的過程中，如除臭、蒸餾等工藝環(huán)節(jié)，受光熱、催化等的影響，常會從順式構(gòu)象轉(zhuǎn)化為反式構(gòu) 象，即產(chǎn)生大量的反式ΕΡΑ。較容易產(chǎn)生的反式EPA有反-5,順-8, 11，14, 17-二十碳五烯 酸、反-11，順-5, 8, 14, 17 -二十碳五烯酸、反-14,順-5, 8, 11，17-二十碳五烯酸、反-17， 順-5, 8, 11，14-二十碳五烯酸、反-8, 17,順-5, 11，14-二十碳五烯酸(下文簡述為5種反 式EPA)等，其含量相對較高，且由于與EPA具有非常類似的物理特性(如類似的蒸氣壓、溶 解度和吸附特征)，去除較為困難，這不僅影響了 EPA產(chǎn)品的純度，也增加了危害人體健康的 風(fēng)險，目前已知文獻(xiàn)報道的反式脂肪酸對人體的危害包括降低記憶力、導(dǎo)致發(fā)胖、引發(fā)冠心 病、誘發(fā)腫瘤、哮喘、糖尿病及過敏等病癥、影響嬰幼兒的生長發(fā)育、影響男性生育能力等， 因此，盡可能控制和減少EPA濃縮物中上述反式脂肪酸的含量，能夠提高EPA產(chǎn)品的質(zhì)量， 減少其所含雜質(zhì)和副產(chǎn)物對人體健康帶來的潛在影響和危害。
[0004] 由EPA的結(jié)構(gòu)特點帶來的另一個問題是分離純化過程中其不飽和鍵極易發(fā)生氧 化反應(yīng)，形成氫過氧化物(一級氧化產(chǎn)物，以過氧化值為評價指標(biāo))，并進(jìn)一步分解形成烴、 醇、醛、酸等化合物(二級氧化產(chǎn)物，以茴香胺值為評價指標(biāo))，這些氧化產(chǎn)物有些是形成魚 油腥臭味的關(guān)鍵性物質(zhì)(如小分子醛、酮揮發(fā)產(chǎn)生腥臭)，引起消費者反胃、惡心嘔吐；有些 則對人體健康有害(如過氧化物和自由基加速人體衰老)。美國藥典（USP34-NF29版）對魚 油ω-3型多不飽和脂肪酸的過氧化值的標(biāo)準(zhǔn)限度為低于5.0,茴香胺值的標(biāo)準(zhǔn)限度為低 于20.0,但為了保證產(chǎn)品儲存期內(nèi)的氧化穩(wěn)定性，并盡可能降低氧化產(chǎn)物潛在的破壞人體 正常生理功能，促使疾病發(fā)生和發(fā)展的風(fēng)險，將新鮮加工的魚油的過氧化值和茴香胺值控 制在盡可能低的范圍，是衡量魚油質(zhì)量的關(guān)鍵之一。
[0005] CN101253952A公開了一種不產(chǎn)生反式脂肪酸和聚合生成的醛、酮等有害物質(zhì)的魚 油低溫除腥工藝：將乙酯型魚油、甘油、脂肪酶混合，在進(jìn)行酶促酯交換反應(yīng)過程中加入魚 油重量的0. 1%~0. 2%的香基除腥劑除腥。上述方法雖然避免了魚油在高溫條件下除腥時對 內(nèi)在結(jié)構(gòu)的破壞，使得除腥工藝過程中反式脂肪酸及氧化產(chǎn)物的量不會增加，但并不能降 低魚油中反式脂肪酸及氧化產(chǎn)物的量；并且，制備高純度EPA濃縮物的過程十分復(fù)雜，隨著 進(jìn)一步的深加工處理，其反式脂肪酸及氧化產(chǎn)物的量仍會升高。
[0006] 劉芳等人通過研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾草酸能夠有效抑制魚油中反式脂肪酸、醛類等有害 成分的含量[劉芳《迷迭香鼠尾草酸的分離純化及抗氧化作用研究》東北林業(yè)大學(xué)碩士學(xué) 位論文2010,編號Y2050407]。本發(fā)明申請人按照其所述方法，在魚油中加入0. 3mg/g鼠 尾草酸作為抗氧化劑，然后采用銀離子絡(luò)合法和超臨界流體萃取法分離純化至EPA乙酯的 重量百分含量達(dá)到96. 5%，檢測發(fā)現(xiàn)其5種反式EPA的含量為0. 37%~0. 98%，濃縮物過氧化 值為5. 3,茴香胺值為12. 5。
[0007] CN101538508A公開了一種降低植物油反式脂肪酸含量的脫色方法：在中和植物 油中加入活性白土于一定溫度和真空度下攪拌脫色，活性白土 Bronsted酸中心18 mmol/ g~22mmol/g、Levis酸中心2. 7 mmol/g~3. 3mmol/g，活性白土添加量為油重的1%，于 KKTC ~120°C脫色30~50分鐘后，冷卻水中冷卻至60°C，過濾即得。本發(fā)明申請人對經(jīng)分離 純化至EPA乙酯重量百分含量達(dá)96. 5%的濃縮物，按照上述方法進(jìn)行脫色，結(jié)果檢測脫色后 濃縮物中5種反式EPA的含量為0. 48%~1. 23%，濃縮物過氧化值為6. 1，茴香胺值為13. 6,由 于魚油和植物油脂肪酸成分構(gòu)成的差異，上述方法無法應(yīng)用于EPA乙酯濃縮物的制備。
[0008] 鑒于高純度EPA廣泛的醫(yī)療保健作用以及人們對產(chǎn)品質(zhì)量要求的不斷提高，開發(fā) 一種EPA乙酯含量高于96. 5%，同時反式EPA和氧化產(chǎn)物含量控制在盡可能低的水平的EPA 濃縮物，對于提高產(chǎn)品的氧化穩(wěn)定性，延長產(chǎn)品保存期限，降低潛在的引發(fā)疾病的風(fēng)險，保 障公眾健康具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)無法提供一種EPA含量高，同時反式EPA及氧化產(chǎn)物含量低的 EPA乙酯濃縮物，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案： 本發(fā)明提供了 一種高純度的EPA乙酯濃縮物，其包含按油的重量百分含量計 至少96. 5%的EPA乙酯，并且反-5,順-8, 11，14, 17-二十碳五烯酸乙酯、反-11， 順-5, 8, 14, 17 -二十碳五烯酸乙酯、反-14,順-5, 8, 11，17-二十碳五烯酸乙酯、反-17， 順-5, 8, 11，14-二十碳五烯酸乙酯、反-8, 17,順-5, 11，14-二十碳五烯酸乙酯的含量均低 于0. 3%，同時濃縮物的過氧化值低于2,茴香胺值低于5。
[0010] 本發(fā)明還提供了上述高純度的EPA乙酯濃縮物的制備方法： (1) 將EPA乙酯重量百分含量大于等于70%的原料魚油，加到尿素的乙醇溶液中，在 45°C ~78°C，優(yōu)選60°C ~75°C下攪拌溶解至澄清，反應(yīng)0. 5~24h后，在KTC ~15°C結(jié)晶l~3h， 然后在(TC ~5°C結(jié)晶:T6h，最后在-KTC ~-5°C結(jié)晶廣3h，過濾除去結(jié)晶所得的析出物，濾 液在惰性氣體保護(hù)下，減壓濃縮、洗滌，得到濃縮物； (2) 對步驟1制得的濃縮物采用高效液相色譜法進(jìn)行分離純化，流動相為甲醇-異丙 醇-水，其中甲醇與異丙醇的體積比為80 : 10~85 : 5 異丙醇與水的體積比為5 : 15~10 : 得到的洗脫液合并后減壓濃縮，然后經(jīng)薄膜蒸發(fā)，得到濃縮物； (3) 對步驟2所制得的濃縮物進(jìn)行二級分子蒸餾，其中一級蒸餾是在80°C ~100°C、壓力 小于IOPa條件下進(jìn)行，二級蒸餾是在120°C ~140°C、壓力小于IOPa條件下進(jìn)行，得到高純 度EPA乙酯濃縮物。
[0011] 所述步驟1使用的乙醇是95%乙醇。
[0012] 所述步驟1的反應(yīng)時間為0· 5~2h。
[0013] 所述步驟1中尿素與原料魚油的重量比(下文簡稱為尿酯比）是I : 1~2.5 : 1 g:g，乙醇與原料魚油的重量比(下文簡稱為醇酯比)是4 : 1~10 : I g:g;優(yōu)選為尿酯比是 1.2 : I g:g,醇酯比是8 : I g:g。
[0014] 所述步驟1優(yōu)選將魚油加到尿素的乙醇溶液中，在45°C~78°C下攪拌溶解至澄清， 反應(yīng)0. 5~24h后，先在KTC結(jié)晶lh，然后在(TC結(jié)晶3h，最后在-5°C結(jié)晶2h。
[0015] 所述步驟2使用的色譜柱為DAC色譜柱，填料為Kromasil C1S。
[0016] 所述步驟2使用的流動相甲醇-異丙醇-水優(yōu)選按如下方法進(jìn)行梯度洗脫：
[0017] 所述步驟3優(yōu)選為一級分子蒸餾是在90°C、壓力小于等于5Pa條件下進(jìn)行，二級分 子蒸餾在130°C、壓力小于等于5Pa條件下進(jìn)行。
[0018] 為了得到反式EPA及氧化產(chǎn)物含量較低的高純度EPA乙酯濃縮物，本發(fā)明申請人 參考了眾多文獻(xiàn)方法，如CN102391112A實施例提供的工業(yè)化生產(chǎn)EPA乙酯的方法，包括 ： (1)將EPA乙酯重量百分含量為68%~72%的原料魚油在溫度106°C，壓力0. 05mbr下進(jìn)行 二級分子蒸餾，收集餾分；（2)將分子蒸餾后的樣品溶于乙醇，氮氣保護(hù)下分批加入氫氧化 鈉，25°C下攪拌20h至反應(yīng)完成，緩慢攪拌降溫至-20°C并放置24h，析出固體，抽濾，冰乙 醇洗滌濾餅，抽干后固體用IN稀鹽酸調(diào)節(jié)PH=5,正庚烷萃取兩次，合并有機層，飽和食鹽水 洗滌，旋干。（3)將經(jīng)過鹽沉淀法得到的樣品注入液相制備系統(tǒng)，色譜柱為DAC-HB800,填料 YMC-Pack 0DS-AQ，流動相甲醇-水(體積比88 : 12 ml:ml，并加入流動相總體積0. 1%的 TFA)等度洗脫，收集洗脫液濃縮即得。本發(fā)明申請人按照上述方法制備得到重量百分含量 為97%的EPA乙酯濃縮物，經(jīng)檢測其5種反式EPA的含量為0. 24%~0. 92%，濃縮物過氧化值 為3. 6,茴香胺值為8. 9。
[0019] 本發(fā)明申請人又參考文獻(xiàn)方法（Grima，E. M·，Medina, A. R. et al·，1996. Gram-scale purification of eicosapentaenoic acid (EPA, 20 : 5n 3) from wet Phaeodactylum tricornutum UTEX640 biomass. J. Appl. Phycol. 8: 359 - 367),為了 減少色譜分離時使用的有機溶劑的量并降低對色譜填料的損耗，以含重量百分含量為70% 的EPA乙酯的魚油為起始原料,按上述文獻(xiàn)方法先使用尿素-甲醇溶液進(jìn)行包合,尿酯比為 4 : I g:g，包合溫度65°C~70°C，于28°C過夜結(jié)晶，濾液濃縮后注入液相制備系統(tǒng)，色譜柱 為C18柱，流動相為甲醇-水(體積比80 : 20 并加入流動相總體積1