牙鲆神經(jīng)肽及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白表達應用技術領域，具體設及一種牙解神經(jīng)膚及其應用。
【背景技術】
[0002] 脊椎動物青春期的完成W生殖能力的獲得為標志，而青春期的啟動始于下丘腦脈 沖性促性腺激素釋放激素（GnRH)分泌的提高。在魚類中性腺的發(fā)育和成熟受到了下丘 腦-垂體-性腺軸中各種性激素信號的嚴格控制。作為該軸的關鍵因子，GnRH通過刺激促 性腺激素（促黃體激素（LH)和卵泡雌激素（FSH))的合成和釋放刺激性腺進行配子發(fā)生W 及類固醇的合成，完成機體性成熟。
[0003] 自2001年W來，越來越多的研究表明Kissp巧tin/GPR54系統(tǒng)是調節(jié)下丘腦GnRH 釋放的重要信號。Kisspeptin是一種由kiss基因編碼的神經(jīng)膚類激素，在哺乳動物中可 成熟的內源性片段kissp巧tin54，kissp巧tinl4，kissp巧tinl3，kissp巧tinlO等 形式存在并發(fā)揮作用。大量研究表明在脊椎動物，包括人、哺乳動物和鳥類中，外源性的 kisspeptin刺激會促進GnRH的釋放。王海蓮等人用kisspeptin對雌性大鼠進行皮下注 射，結果表明注射能在明顯提前青春期的發(fā)生的同時促進各項指標明顯上升。在禽類中， 倪迎冬等人用kisspeptin注射蛋雞種蛋則明顯提高蛋雞的出產(chǎn)蛋率W及公雞的性成熟提 前。但是運些研究中用到的kisspeptin多是經(jīng)過公司化學合成的kisspeptinlO短膚，并 且在C末端進行了酷胺化的蛋白修飾。在使用該神經(jīng)膚進行動物實驗時，多采用逐個個體 注射的方法。運對于在群體數(shù)量較大的魚類養(yǎng)殖中進行則可操作性難度較大。目前的報道 中還沒有過對神經(jīng)膚進行體外表達并得到有生物活性的神經(jīng)膚的案例。因此，如何經(jīng)濟、大 量地獲得功能性的kisspeptin神經(jīng)膚，如何方便地在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程使用該神經(jīng)膚進行人 工控制性成熟將具有重要的意義。
[0004] 魚類的性腺發(fā)育是外部環(huán)境和內部神經(jīng)、內分泌系統(tǒng)協(xié)調作用的結果，但養(yǎng)殖條 件下，往往缺少自然狀態(tài)下環(huán)境因子的誘導?；痮athna等（2001)曾報道幾乎所有的養(yǎng)殖魚 類都呈現(xiàn)出一些生殖障礙，如雌魚不能達到卵母細胞最后成熟、排卵和產(chǎn)卵，雄魚精液少， 粘稠且質量低，究其原因乃是養(yǎng)殖環(huán)境條件變化使養(yǎng)殖魚類性腺的發(fā)育受阻。在運種情況 下運用魚自身生理過程的啟動因子對性腺發(fā)育進行調控則具有良好的可行性。而且在養(yǎng)殖 條件下，多數(shù)魚類的性成熟需要經(jīng)歷較長時間，在運種情況下人工縮短性成熟所需要的時 間對于節(jié)約生產(chǎn)成本、增加經(jīng)濟效益而言具有重要的意義，同時實現(xiàn)對于養(yǎng)殖魚類的性腺 發(fā)育控制具有重要的科研意義。
[0005] 原核表達系統(tǒng)具有培養(yǎng)體系簡單、周期短、發(fā)酵成本低廉等優(yōu)點，因此常被用來進 行工程菌株的構建。但是原核表達過程中也經(jīng)常會遇到表達的蛋白不具備生物學活性的情 況，特別是像一些短膚，在原核表達體系中和標簽蛋白形成融合蛋白，標簽蛋白的存在可能 會導致短膚被包裹而無法發(fā)揮其活性的情況。因此一直W來都鮮有對內分泌神經(jīng)短膚進行 體外表達的成功報道。因此，如何通過基因功能技術生產(chǎn)出能產(chǎn)生具有活性、有功能的神經(jīng) 膚工程菌，并通過簡單的方式作用，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)W及各種禽畜動物飼養(yǎng)將具有廣闊的 前景和生產(chǎn)意義。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種牙解神經(jīng)膚，即能在體外重組表達的，有生物活性的小 片段神經(jīng)膚，及其在控制魚類性腺發(fā)育過程中的應用。
[0007] 本發(fā)明首先提供一種牙解神經(jīng)膚，其氨基酸序列為SEQIDNO: 1 ;
[0008] 編碼上述牙解神經(jīng)膚的基因，其一種核巧酸序列為SEQIDNO:2 ;
[0009] 本發(fā)明還提供一種重組表達載體，所述的表達載體中插入了用于重組表達氨基酸 序列為SEQIDNO:1的神經(jīng)膚的全部或部分片段，
[0010] 本發(fā)明的表達載體優(yōu)選為原核表達載體祀T32a(+);
[0011] 本發(fā)明再一個方面提供一種重組宿主菌，是轉化/轉染有上述重組表達載體的宿 主菌，例如大腸桿菌；
[0012] 獲得的產(chǎn)生重組神經(jīng)膚用于制備飼料添加劑、獸藥或醫(yī)藥產(chǎn)品中的任一種。
[0013] 制備的重組宿主菌用于作為提供神經(jīng)膚的組分添加到飼料中來使用。
[0014] 本發(fā)明克隆得到牙解神經(jīng)膚的編碼序列，并建立和篩選出能有效地進行神經(jīng)膚重 組表達的載體及工程菌，實現(xiàn)了牙解神經(jīng)膚在原核生物體內的融合表達，與傳統(tǒng)的多膚合 成方法及從天然資源提取多膚的方法相比，本發(fā)明的制備方法使得神經(jīng)膚大批量、低成本 的規(guī)?；a(chǎn)成為可能。本發(fā)明得到的工程菌可W直接作為飼料添加劑使用，并利用魚類 自身的腸激酶作用釋放神經(jīng)膚發(fā)揮其功能，因此可應用于海洋養(yǎng)殖魚類、養(yǎng)殖禽畜類的飼 料添加劑和獸藥，解決了養(yǎng)殖業(yè)長期存在的難W安全有效地人工控制養(yǎng)殖品種性成熟過程 的問題，并W高科技帶動了養(yǎng)殖業(yè)及養(yǎng)殖飼料工業(yè)的行業(yè)技術進步。
【附圖說明】
[0015] 圖1:牙解神經(jīng)膚重組載體結構示意圖。
[0016] 圖2牙解神經(jīng)膚54融合蛋白結構示意圖。
[0017] 圖3 :牙解神經(jīng)膚融合蛋白的誘導表達分析結果。
[0018] 圖4 :純化牙解神經(jīng)膚54刺激細胞后GnRH的變化。
[0019] 圖5:飼喂牙解重組神經(jīng)膚神經(jīng)膚工程菌后牙解后血漿GnRH的變化。
【具體實施方式】
[0020] 實施例1牙解神經(jīng)膚的篩選及序列分析
[0021] 1、牙解神經(jīng)膚的篩選
[0022] 申請人對本實驗室獲得的牙解基因組文庫數(shù)據(jù)進行序列分析，探究編碼小膚的核 巧酸序列，然后對編碼的氨基酸序列進行BLAST比對，從中篩選出感興趣的神經(jīng)內分泌系 統(tǒng)相關蛋白。通過篩選我們發(fā)現(xiàn)了一個核巧酸，其序列為SEQIDN0:2,可編碼氨基酸序列 為SEQIDN0:1的小分子蛋白質，對該含127個氨基酸的蛋白進行bias化分析，發(fā)現(xiàn)其與 NCBI中報道的相比，相似性最高為78%。后續(xù)根據(jù)其表現(xiàn)出的功能將其命名為牙解神經(jīng) 膚。
[002引實施例2重組表達載體的構建、鑒定W及神經(jīng)膚的表達
[0024] 重組質粒的構建與鑒定：根據(jù)牙解神經(jīng)膚的cDNA序列（SEQIDNO:2)，利用一對 特異引物P1和P2擴增牙解神經(jīng)膚的編碼序列。在P1引物的5'端引入限制性內切酶位點 化nI和編碼腸激酶酶切位點的序列，在P2引物的5'端引入限制性內切酶位點SacI和終 止密碼子編碼序列TCA，兩個引物序列分別為： 陽0巧]P1:GGTACCGACGACGACGACAAGGCAACAGGATCTGTCCTCTCTGC
[0026]P2：GAGCTCTCAAAAGCGAAGGGTTAACGGGTTGTAGTTG；
[0027]PCR反應體積為 25ul，擴增條件：94°C5min;94°C30s，68°C30s，72°C30s共 35 個 循環(huán)；72°C7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后，對目標產(chǎn)物片段回收并與PMD19-T載體進 行TA克隆連接，轉化Tran巧a并在LB(Amp+)平板培養(yǎng)。經(jīng)菌落PCR反應挑取克隆，測序 確定陽性克隆并提取質粒。將該質粒與祀T32a(+)質粒均用化nI和SacI雙酶切后，分 別回收酶切產(chǎn)物，并進行T4DNA連接酶連接，得到成功導入含有目的基因的牙解神經(jīng)膚的 載體（圖1)。重組蛋白的序列