在被孢霉屬微生物內(nèi)顯示高表達活性的啟動子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供在被抱霉（Modierella)屬微生物細胞內(nèi)顯示高表達活性的啟動子、 含有該啟動子的載體、導(dǎo)入了該啟動子的非人轉(zhuǎn)化體W及使用該啟動子或轉(zhuǎn)化體的蛋白 質(zhì)、脂質(zhì)或脂肪酸的制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002] -直W來開發(fā)并實用化了通過微生物代謝來生產(chǎn)有用化合物的技術(shù)（廣義的發(fā) 酵技術(shù)）。例如，高山被抱霉（Mcxrtierellaalpina)等被抱霉屬的菌類，是已知的生產(chǎn)W花 生四締酸為主的高度不飽和脂肪酸（PUFA)且在工業(yè)上特別有用的菌類（專利文獻1)。 在利用運種菌類方面，已做了育種工作，即把有用生物的遺傳性改良為更理想的特性 (進行品種改良）。尤其在發(fā)酵技術(shù)中，從提高由微生物生產(chǎn)有用化合物的生產(chǎn)效率W及降 低該化合物的制造成本等的觀點出發(fā)，育種已變得非常重要。 為了培育具有更優(yōu)選特性的有用生物，已利用了介由轉(zhuǎn)化的方法。運種情況下，為了獲 得目標(biāo)性狀，將編碼必需蛋白質(zhì)的DNA片段導(dǎo)入到想要培育的有用生物（宿主）中，W使其 在適當(dāng)?shù)幕騿幼拥目刂葡逻M行表達，從而獲得轉(zhuǎn)化體集團。此后，從中篩選理想的品種 (菌株）。此時，適應(yīng)于成為宿主的生物種且適應(yīng)于想要改變的特性的恰當(dāng)?shù)幕騿幼邮?必需的。 關(guān)于屬于被抱霉屬的菌類的絲狀菌的轉(zhuǎn)化方法，已有多種技術(shù)被報導(dǎo)。另外，已獲得了 多種與被抱霉屬菌類的脂質(zhì)生產(chǎn)能力相關(guān)且參與脂質(zhì)合成系統(tǒng)的酶基因。然而，針對用于 將運些有用的酶基因?qū)氡槐箤賰?nèi)，并使之W高水平表達的必需的基因啟動子，至今幾 乎未報導(dǎo)。 現(xiàn)有技術(shù)文獻 [000引專利文獻 專利文獻1日本國特開昭63-044891公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 在如上所述的狀況下，尋求高效地生產(chǎn)有用脂質(zhì)的菌株的育種，為此，適于被抱霉 屬的菌類的基因啟動子必不可少。
[0005] 本發(fā)明者不斷深入研究的結(jié)果，成功克隆了在高山被抱霉（Ealpina)中高表達 的基因的啟動子，從而完成了本發(fā)明。即本發(fā)明提供W下多核巧酸、表達載體、轉(zhuǎn)化體、使用 該多核巧酸W及轉(zhuǎn)化體的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或脂肪酸的制造方法。
[0006] 具體而言，本發(fā)明如下。
[1] 一種多核巧酸，其特征在于，是選自W下（a)~（C)中的任意一項所述的多核巧 酸： (a)多核巧酸，其含有選自序列號1~28中的任意一個的堿基序列； 化）多核巧酸，其含有相對于選自序列號1~28中的任意一個的堿基序列有90%W上 的同一性的堿基序列，且在屬于被抱霉屬的微生物細胞內(nèi)顯示啟動子活性；w及 (C)多核巧酸，其為與由選自序列號1~28中的任意一個的堿基序列的互補堿基序列 組成的多核巧酸在嚴謹條件下雜交的多核巧酸，且為在屬于被抱霉屬的微生物細胞內(nèi)顯示 啟動子活性。 凹根據(jù)山所述的多核巧酸，其特征在于，所述啟動子活性是指在屬于被抱霉屬的微 生物細胞內(nèi)表達GUS報告基因時，至少500nmol/(mg?分鐘）的GUS蛋白質(zhì)活性被確認。
[3] 根據(jù)[1]所述的多核巧酸，其特征在于，含有選自序列號1~28中的任意一個的堿 基序列。
[4] 根據(jù)[1]或[2]所述的多核巧酸，其特征在于，為DNA。
[引一種載體，其特征在于，含有[1]~[4]中任一項所述的多核巧酸。
[6] -種非人轉(zhuǎn)化體，其特征在于，導(dǎo)入了 [1]~[4]中任意一項所述的多核巧酸。
[7] -種非人轉(zhuǎn)化體，其特征在于，導(dǎo)入了 [引所述的載體。 閒根據(jù)[7]或閒所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體為脂質(zhì)生產(chǎn)菌。
[9]根據(jù)[引所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述脂質(zhì)生產(chǎn)菌為高山被抱霉（Modierella 曰Ipin曰）D
[0007] 將本發(fā)明的多核巧酸用作啟動子時，可使目標(biāo)基因在屬于被抱霉屬的微生物細胞 內(nèi)高效表達。
【附圖說明】
[0008] 圖1是表示用于評價本發(fā)明的啟動子的載體的例子的圖。將化sP序列替換為本 發(fā)明的啟動子而使用。 圖2是表示用各種培養(yǎng)基（灰色柱：GY培養(yǎng)基，白色柱：大豆粉培養(yǎng)基）培養(yǎng)由本發(fā)明 的啟動子序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體時的啟動子活性的圖。用10ml各培養(yǎng)基在28°C、300rpm下培 養(yǎng)5天。 圖3是表示啟動子GAL10-化的活性的圖。表示通過半乳糖添加而誘導(dǎo)的啟動子活性。 圖4是表示啟動子PP7p及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養(yǎng)基在28°C、 300巧m下培養(yǎng)5天。 圖5是表示啟動子CITlp及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養(yǎng)基在28°C、 300巧m下培養(yǎng)3天。 圖6是表示啟動子PP化及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養(yǎng)基在28°C、 300;rpm下培養(yǎng)10天。 圖7是表示啟動子PP化及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養(yǎng)基在28°C、 300巧m下培養(yǎng)5天。 圖8是表示啟動子服C8化及其截短型啟動子的活性的圖。用lOmlGY培養(yǎng)基在28°C、 300巧m下培養(yǎng)5天。 圖9是表示啟動子SSA化及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養(yǎng)基在28°C、 300巧m下培養(yǎng)5天。 圖10是表示啟動子GA巧及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養(yǎng)基在28°C、 300巧m下培養(yǎng)5天。 圖11是表示啟動子GALIO-化及其截短型啟動子的活性的圖。 圖12A是表示源自大腸桿菌巧.coli)的GUS基因（CDS序列：序列號29,氨基酸序列： 序列號30)與將源自大腸桿菌的GUS基因的密碼子的使用變?yōu)楸槐箤俚奈⑸镉玫腉USm 基因仰S序列：序列號31，氨基酸序列：序列號32)的比對圖。 圖12B是圖12A的繼續(xù)。
【具體實施方式】
[0009] W下詳細說明本發(fā)明。W下的實施方式是用于說明本發(fā)明的例示，并不意味著將 本發(fā)明僅限于此實施方式。本發(fā)明只要不脫離其主旨，可W各種方式實施。 另外，本說明書中引用的全部文獻及公開公報、專利公報、其它專利文獻已作為參照編 入本說明書中。此外，本說明書包含2013年3月27日申請的成為本申請優(yōu)先權(quán)主張的基 礎(chǔ)的日本國專利申請（特愿2013-066265號）的說明書及圖面中所述的內(nèi)容。
[0010] 本說明書中在未特別記載的情況下，堿基序列記載為5'末端在左側(cè)，3'末端在右 側(cè)。
[0011] 1.啟動子 如后述實施例中的詳細記載，本發(fā)明者首次成功地從作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌的M.alpina中 克隆了多種啟動子序列。此外，本發(fā)明者也確認了由運些啟動子表達的蛋白質(zhì)顯示其生物 活性。 本發(fā)明的啟動子為PP7p、Cmp、PP3p、PP化、PP6ps、服C8化、SSA化、GAL10-化和/或 它們的部分序列（截短型）。運些啟動子區(qū)序列及其截短型序列示于下表。 W下，將上述表格中所示堿基序列即選自序列號1~28中的任意一個序列統(tǒng)稱為"本 發(fā)明的啟動子序列"。
[001引[表U表1
[0013] 在此，作為在屬于被抱霉屬的微生物細胞內(nèi)顯示高表達活性的啟動子，本發(fā)明提 供W下多核巧酸。 選自W下（a)~（C)中任意一項所述的多核巧酸： (a)多核巧酸，其含有本發(fā)明的啟動子序列； 化）多核巧酸，其含有相對于本發(fā)明的啟動子序列有90%W上同一性的堿基序列，且 在屬于被抱霉屬的微生物細胞內(nèi)顯示啟動子活性；W及 (C)多核巧酸，其為與由本發(fā)明的啟動子序列的互補堿基序列組成的多核巧酸在嚴謹 條件下雜交的多核巧酸，且為在屬于被抱霉屬的微生物細胞內(nèi)顯示啟動子活性的多核巧 酸。
[0014] W下，將上述（a)~（C)中記載的多核巧酸稱為"本發(fā)明的多核巧酸"。 另外，本發(fā)明中，"含有"本發(fā)明的啟動子序列是指"包含"本發(fā)明的啟動子序列。因此， 本發(fā)明的啟動子序列W外的附加的序列，例如增強子序列等也可附加在本發(fā)明的啟動子序 列的上游（5'末端側(cè)）或下游（3'末端側(cè)）。運樣的附加的序列可在與本發(fā)明的啟動子 序列之間介由1~l〇〇〇bp、l~900bp、l~800bp、l~700bp、l~600bp、l~500bp、l~ 400bp、l~300bp、l~200bp、l~100bp、l~75bp、l~50bp、l~25bp、l~lObp的堿基 序列進行附加，或者也可直接連接到本發(fā)明的啟動子序列上（即介于本發(fā)明的啟動子序列 與附加的序列之間的核巧酸殘基數(shù)為0)。
[001引本說明書中，"多核巧酸"是指DNA或RNA。 本說明書中，"在嚴謹條件下雜交的多核巧酸"是指，例如將由本發(fā)明的啟動子 序列的互補堿基序列組成的多核巧酸的全部或一部分作為探針，采用菌落雜交法、隧 菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核巧酸。作為雜交的方法，例如，可利用 "Sambrook&Russell，MolecularCloning：ALaboratoryManualVol.3，ColdSpring Harbor，LaboratoryPress2001" 及"Ausubel，CurrentProtocolsinMolecular Biology,JohnWiley&Sonsl987-1997"等中所記載的方法。
[0016] 本說明書中，"高嚴謹條件"例如為（l)5XSSC、5XDenhar化溶液、0. 5%SDS、50% 甲酯胺、50°C，（2)0. 2XSSC、0. 1%SDS、60°C，（3)0. 2XSSC、0. 1%SDS、62°C，（4)0. 2XSSC、 0. 1%SDS、65°C，或巧)0. 1XSSC、0. 1%SDS、65°C的條件，但不限于此。在運些條件中，越提 高溫度越能期待高效地得到具有高序列同一性的DNA。但是，認為作為影響雜交的嚴謹度的 因素，有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種因素，只要是本領(lǐng)域技術(shù) 人員，即可通過適當(dāng)選擇運些因素來實現(xiàn)同樣的嚴謹度。
[0017] 另夕F，當(dāng)使用市售的試劑盒進行雜交時，例如可W使用AlkphosDirect L油ellingandDetectionSystem(GEHealthcare)。此時，按照試劑盒中附帶的操作指南， 與標(biāo)記的探針解育過夜后，在55°C的條件下使用含有0. 1% (w/v)SDS的最初的洗涂緩沖液 將膜洗涂后，即可檢測出雜交的DNA。或基于本發(fā)明的啟動子序列的互補堿基序列的全部 或一部分制備探針時，使用市售的試劑（例如，PCR標(biāo)記混合物（羅氏診斷有限公司（Roche Diagnostics公司））等）將該探針進行地高辛值IG)標(biāo)記的情況下，可使用DIG核酸檢測 試劑盒（RocheDia即ostics公司）來檢測雜交。
[0018] 作為除上述W外可雜交的多核巧酸，在通過FASTA、BLAST等同源性檢索軟件使用