一種金屬離子協(xié)同選擇性調(diào)控全細(xì)胞共催化合成多種糖酸的方法
【專利說明】
一、技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物催化糖合成糖酸的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種金屬離子協(xié)同選擇性調(diào)控全細(xì)胞共催化合成多種糖酸的方法。
二、【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖酸和木糖酸作為多羥基有機(jī)酸類生物基化學(xué)品可以作為食品、飼料添加劑、水泥減水劑、分散劑、緩釋劑、混凝土黏接劑、增塑劑、玻璃清洗劑、冶金除銹劑、金屬離子螯合劑、紡織助漂劑、農(nóng)藥懸浮劑和鞣革劑和水體穩(wěn)定劑等，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料養(yǎng)殖、化工和環(huán)保等多種行業(yè)。糖酸的制備生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)法及生物法，其中化學(xué)法一般需要采用無機(jī)催化劑、反應(yīng)條件較苛刻、存在副產(chǎn)物和環(huán)境污染較大，相比而言生物法工藝條件溫和，生產(chǎn)過程綠色環(huán)保，具有更加廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]目前，利用經(jīng)定向馴化的氧化葡萄糖酸桿菌株(Gluconobacter oxydans)NL71，在通氧加壓全細(xì)胞催化反應(yīng)條件下可以高效、快速催化單一的C6糖類(包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖)、C5糖類(包括木糖、阿拉伯糖)碳骨架上的Cl醛基轉(zhuǎn)化成羧酸根生成對應(yīng)的糖酸(鹽)，最高糖酸產(chǎn)品濃度、單位體積生產(chǎn)速率和底物轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到600g/L、3.72g/(L.h)和 99% 以上(CN201310167758.X ;Zhou Xin, et al，B1chemical Engineering Journal,2015)，達(dá)到了很高的生產(chǎn)水平。
[0004]在木質(zhì)纖維素尤其是草類和闊葉材原料的水解液中同時含有以葡萄糖和木糖為多種糖組分，利用全細(xì)胞共催化技術(shù)直接合成葡萄糖酸和木糖酸產(chǎn)品有望實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維資源糖組分的高效、全值化轉(zhuǎn)化與利用。但是，在多種糖組分共存的反應(yīng)體系中，氧化葡萄糖酸桿菌優(yōu)先快速催化葡萄糖生成葡萄糖酸，包括木糖在內(nèi)的其它糖類的生物氧化均會受到葡萄糖不同程度抑制而產(chǎn)生延滯效應(yīng)，同時生成的葡萄糖酸也會被細(xì)胞迅速進(jìn)一步分解代謝而大量消耗，最終造成葡萄糖酸產(chǎn)品得率的嚴(yán)重?fù)p失(Zhou Xin, et al, B1resources,2015 ；Zhou Xin, et al, B1chemical Engineering Journal，2015)，因此直接以氧化葡萄糖酸桿菌全細(xì)胞催化木質(zhì)纖維素水解液難以實(shí)現(xiàn)多種糖組分共催化同步高效合成糖酸的目的。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:在含有葡萄糖組分的多種糖共存反應(yīng)體系中，添加適量的二價鋅和三價鐵離子，利用兩種金屬離子的協(xié)同作用對氧化葡萄糖酸桿菌細(xì)胞中葡萄糖酸分解代謝反應(yīng)途徑進(jìn)行選擇性抑制，阻遏并減少細(xì)胞對葡萄糖催化產(chǎn)品葡萄糖酸的消耗，但同時兩種離子對細(xì)胞的葡萄糖和木糖催化脫氫反應(yīng)幾乎沒有抑制作用，從而實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素水解液多種糖組分高效共催化同時制取葡萄糖酸(鹽)和木糖酸(鹽)產(chǎn)品的目的。
[0006]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]—種金屬離子協(xié)同選擇性調(diào)控全細(xì)胞共催化合成多種糖酸的方法，包括以下步驟:
[0008](I)在含有100g/L%?300g/L葡萄糖和木糖的混合糖液或者木質(zhì)纖維素水解液中，接入細(xì)胞濃度為lg/L?10g/L的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)細(xì)胞作為生物催化劑，控制反應(yīng)體系的溶氧濃度等于或不低于lmg/L，pH值等于或不低于3.0 ;
[0009](2)在步驟(I)的基礎(chǔ)上，添加含有二價鋅和三價鐵離子至兩種金屬離子的總濃度為5g/L?20g/L，其中鋅離子的濃度占比不低于30%。利用兩種金屬離子的協(xié)同作用選擇性地抑制細(xì)胞葡萄糖酸的分解代謝途徑，而對細(xì)胞催化木糖和葡萄糖脫氫生成對應(yīng)糖酸的反應(yīng)影響較??；
[0010](3)采用步驟(I)和(2)使反應(yīng)體系中的葡萄糖和木糖均被完全利用，葡萄糖酸的得率達(dá)到70%，木糖酸的得率達(dá)到92%，產(chǎn)品葡萄糖酸(鹽)和木糖酸(鹽)的總濃度可達(dá)到30% (質(zhì)量濃度)。
[0011]所述的所述反應(yīng)體系中的底物為所有含有葡萄糖，木糖或任意組合型反應(yīng)底物。
[0012]所述的金屬離子調(diào)控物為所有含有二價鋅和三價鐵離子或任意組合型的化合物，添加形式為含有兩種離子的金屬鹽固體或溶液。
[0013]所述的生物催化劑為氧化葡萄糖酸桿菌或以它為宿主菌的基因重組菌株或其它遺傳改良菌株。
[0014]有益效果:本發(fā)明通過添加一定濃度的金屬離子鋅和鐵的協(xié)同作用，在不影響細(xì)胞對木糖和葡萄糖催化氧化制取木糖酸和葡萄糖酸前提下，選擇性地抑制氧化葡萄糖酸桿菌細(xì)胞葡萄糖酸分解代謝途徑，以阻遏和減少細(xì)胞對葡萄糖酸酸的利用，達(dá)到細(xì)胞共催化多種糖組分高效合成葡萄糖酸和木糖酸的效果。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，能夠顯著提高細(xì)胞共催化多種糖組分同步合成葡萄糖酸(鹽)和木糖酸(鹽)的產(chǎn)品得率，同時縮短反應(yīng)時間，有效提高整體生產(chǎn)效益。
四、【附圖說明】
[0015]圖1是未添加二價鋅和三價鐵離子全細(xì)胞共催化葡萄糖和木糖合成糖酸的反應(yīng)歷程圖；圖中，橫座標(biāo)表示反應(yīng)時間(h)，主縱座標(biāo)表示單糖及對應(yīng)糖酸的濃度(g/L)，次縱座標(biāo)表示糖酸的產(chǎn)品得率);
[0016]圖2是添加氧化鋅和三氧化二鐵(4.5g/L鋅離子和3.5g/L鐵離子)全細(xì)胞共催化葡萄糖和木糖合成有機(jī)酸的反應(yīng)歷程圖；圖中，橫座標(biāo)表示反應(yīng)時間(h)，主縱座標(biāo)表示糖及糖酸的濃度(g/L)，次縱座標(biāo)表示糖酸的產(chǎn)品得率(％ )。
五、【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施案例I
[0018]在3.0L機(jī)械通風(fēng)式反應(yīng)罐中，加入1.5L的葡萄糖和木糖混合液，其中葡萄糖和木糖的初始濃度分別為75g/L和25g/L。通入氧氣并密封罐體維護(hù)氣壓在0.01?0.lOMPa，接入氧化葡萄糖酸桿菌至細(xì)胞濃度1.0g/L進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)。采用pH電極監(jiān)測并以30%(w/w)氫氧化鈉溶液在線自動流加調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值3.0?6.00采用溶氧電極監(jiān)測并控制反應(yīng)液中的溶氧濃度不低于lmg/L。添加8/L氧化鋅固體和12g/L三氧化二鐵固體。反應(yīng)直至葡萄糖和木糖消耗完全時停止反應(yīng)獲得葡萄糖酸鈉和木糖酸鈉產(chǎn)品液。產(chǎn)品中葡萄糖酸和木糖酸的濃度分別達(dá)到58.6g/L和25.7g/L，對應(yīng)的產(chǎn)品得率分別達(dá)到71.7%和92.
[0019]實(shí)施案例2
[0020]在1L機(jī)械通風(fēng)式反應(yīng)罐中，加入7.0L木質(zhì)纖維素水解液濃縮液，其中葡萄糖和木糖的濃度分別為202g/L和95g/L。通入氧氣并密封罐體維護(hù)氣壓在010?0.lOMPa，接入氧化葡萄糖酸桿菌至細(xì)胞濃度10g/L進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)。采用pH電極監(jiān)測并以30%(w/w) NaOH溶液在線自動流加調(diào)節(jié)反應(yīng)體液的pH值5.0。采用溶氧電極監(jiān)測并結(jié)合攪拌速率調(diào)節(jié)以控制反應(yīng)液中的溶氧濃度不低于lmg/L。添加氯化鋅和三氯化鐵濃溶液至反應(yīng)體系中兩種金屬鹽濃度分別達(dá)到10g/L氯化鋅和20g/L三氯化鐵。反應(yīng)直至葡萄糖和木糖消耗完全時停止反應(yīng)獲得葡萄糖酸鈉和木糖酸鈉產(chǎn)品液。產(chǎn)品中葡萄糖酸和木糖酸的濃度分別達(dá)到163.5g/L和99.8g/L，對應(yīng)的產(chǎn)品得率分別達(dá)到74.3%和94.9%。
【主權(quán)項】
1.一種金屬離子協(xié)同選擇性調(diào)控全細(xì)胞共催化合成多種糖酸的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)在含有100g/L?300g/L萄糖和木糖的混合糖液或者木質(zhì)纖維素水解液中，接入細(xì)胞濃度為lg/L?10g/L的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobac ter oxydans)細(xì)胞作為生物催化劑，控制反應(yīng)體系的溶氧濃度等于或不低于lmg/L，pH值等于或不低于3.0 ; (2)在步驟(I)的基礎(chǔ)上，添加含有正二價鋅離子和正三價鐵離子的金屬鹽至兩種離子的總濃度為5g/L?20g/L，其中鋅離子占比不低于30%。利用兩種金屬離子的協(xié)同作用選擇性地抑制細(xì)胞葡萄糖酸的分解代謝途徑，而對細(xì)胞催化木糖和葡萄糖脫氫生成對應(yīng)糖酸的反應(yīng)影響較?。? (3)采用步驟(I)和(2)使反應(yīng)體系中的葡萄糖和木糖均被完全催化轉(zhuǎn)化，葡萄糖酸的得率超過70 %，木糖酸的得率超過92%，產(chǎn)品葡萄糖酸(鹽)和木糖酸(鹽)的總濃度可以達(dá)到30% (質(zhì)量濃度)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬離子選擇性調(diào)控全細(xì)胞共催化合成多種糖酸的方法，其特征在于:反應(yīng)體系指所有含有木糖、葡萄糖或者任意組合型的反應(yīng)基質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬離子協(xié)同選擇性調(diào)控全細(xì)胞共催化合成多種糖酸的方法，其特征在于:反應(yīng)體系指所有含有二價鋅、三價鐵元素或者任意組合型的化合物固體或溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬離子協(xié)同選擇性調(diào)控全細(xì)胞共催化合成多種糖酸的方法，其特征在于:所述的催化產(chǎn)物是指包括木糖酸(鹽)、葡萄糖酸(鹽)或者任意組合型的化合物。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬離子協(xié)同選擇性調(diào)控全細(xì)胞共催化合成多種糖酸的方法，其特征在于:所述微生物菌株為氧化葡萄酸桿菌Gluconobacter Oxydans及任何以它為宿主菌的基因重組菌株或者遺傳改良菌株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金屬離子協(xié)同選擇性調(diào)控全細(xì)胞共催化合成多種糖酸的方法，涉及生物催化糖合成糖酸的技術(shù)領(lǐng)域。主要特征：在含有葡萄糖和木糖的混合糖液或者木質(zhì)纖維素水解液中，以1g/L～10g/L氧化葡萄糖酸桿菌為生物催化劑，在供氧條件下共催化葡萄糖和木糖合成糖酸。添加一定濃度含鋅離子和三價鐵離子的金屬鹽以選擇性抑制細(xì)胞對葡萄糖酸的分解代謝作用，而對木糖和葡萄糖的脫氫催化反應(yīng)幾乎沒有影響，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞共催化高效合成葡萄糖酸(鹽)和木糖酸(鹽)產(chǎn)品的效果，并且有效縮短反應(yīng)時間。采用本方法，葡萄糖和木糖的利用率達(dá)到100％，葡萄糖酸的得率超過70％，木糖酸的得率超過92％，產(chǎn)品葡萄糖酸(鹽)和木糖酸(鹽)的總濃度可以超過30％(質(zhì)量濃度)。
【IPC分類】C12P7/58
【公開號】CN105132476
【申請?zhí)枴緾N201510615816
【發(fā)明人】徐勇, 周雪蓮, 周鑫, 余世袁, 勇強(qiáng), 朱均均
【申請人】南京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月23日