單細(xì)胞中的靶蛋白和靶核酸的同時檢測的制作方法
【專利說明】單細(xì)胞中的靶蛋白和靶核酸的同時檢測
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請?zhí)?1/799,559的權(quán)益，該臨時 申請為了所有目的通過引用并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及對于在單細(xì)胞中檢測核酸，例如RNA是足夠靈敏的基于擴增的檢測系 統(tǒng)。該方法可與用于蛋白檢測的鄰近延伸測定（proximity extension assay)組合使用以 提供檢測核酸和蛋白兩者的多重測定。
[0004] 背景
[0005] 由單獨的細(xì)胞檢測和定量蛋白和核酸是令人期望的，但因為單細(xì)胞中存在的材料 微量而難以實現(xiàn)。此外，不像大塊樣品（bulk sample)，單細(xì)胞不可劃分為部分以分別分析 蛋白和核酸水平。盡管單分子檢測技術(shù)或質(zhì)譜可提供用于實現(xiàn)單細(xì)胞分析的方法，這些方 法是昂貴的。最近，已開發(fā)了一種測定，鄰近延伸測定（PEA)，其足夠靈敏以檢測皮克量的蛋 白（參見，例如，Lundberg 等人，Nucl. Acids Res. 2011 Aug ;39 (15): el02;epub 2011 Jun 6,通過引用并入本文）。在一種方法中，PEA采用各具有附著至它的寡核苷酸的一對抗體。 寡核苷酸包含彼此互補的區(qū)域。當(dāng)抗體結(jié)合至靶蛋白時，寡核苷酸足夠緊密鄰近，使得來自 各寡核苷酸的互補區(qū)域彼此雜交。DNA聚合酶的添加導(dǎo)致雜交的寡核苷酸的延伸。然后可 檢測或定量延伸產(chǎn)物。
[0006] 發(fā)明簡述
[0007] 在各個方面，本發(fā)明包括，但不限于，以下的實施方案。
[0008] 在一個方面，本發(fā)明提供了在樣品中檢測靶核酸，通常為RNA，的方法，該方法包括 (a)在反應(yīng)混合物中孵育：i)包含靶核酸的樣品；和ii)包含第一和第二探針的一對鄰近 探針，其中：第一探針包含與靶核酸的第一靶（T)區(qū)段雜交的靶結(jié)合（TB)區(qū)段，和在該探針 的3'末端處的相互作用（I)區(qū)段，其中I區(qū)段與在第二探針的3'末端處的I區(qū)段互補；且 第二探針包含與緊密鄰近（in close proximity)該第一 T區(qū)段的革E核酸的第二、非重疊T 區(qū)段雜交的TB區(qū)段，和在3'末端處的I區(qū)段，其中該3'序列與該第一探針的I區(qū)段互補， 其中
[0009] 將反應(yīng)混合物在其中第一探針的TB區(qū)段與靶核酸的第一 T區(qū)段雜交且第二探針 的TB區(qū)段與靶核酸的第二T區(qū)段雜交的條件下孵育，由此允許第一探針的I區(qū)段與第二探 針的I區(qū)段雜交以形成包含第一和第二探針的I區(qū)段的雙鏈體；
[0010] (b)添加DNA聚合酶并在其中延伸第一和/或第二探針的條件下保持反應(yīng)混合物 以獲得第一延伸產(chǎn)物；
[0011] (c)在包含擴增第一延伸產(chǎn)物、或其亞區(qū)的一對擴增引物的擴增反應(yīng)混合物中擴 增延伸產(chǎn)物、或其亞區(qū)；
[0012] (d)檢測（C)中獲得的擴增子。
[0013] 在一些實施方案中，檢測擴增子的步驟包括使用例如qPCR反應(yīng)定量擴增子。
[0014] 在一些實施方案中，樣品是單細(xì)胞。
[0015] 在一些實施方案中，鄰近對的成員中的一個在3'末端被封閉，以在步驟（b)中延 伸僅一個探針。
[0016] 在一些實施方案中，在延伸步驟中應(yīng)用的DNA聚合酶具有3'核酸外切酶活性。在 一些實施方案中，用于擴增步驟的聚合酶與用于延伸步驟的聚合酶不同。例如，用于擴增步 驟的聚合酶可以是熱穩(wěn)定的，而用于延伸步驟聚的合酶可不是熱穩(wěn)定的。
[0017] 在一些實施方案中，該方法還包括檢測樣品中的靶蛋白。在這樣的實施方案中，該 方法還包括：
[0018] 將（a)的反應(yīng)混合物中的樣品與包含第一和第二蛋白檢測鄰近探針 (protein-detecting proximity probes)的一對蛋白檢測鄰近探針孵育，其中：
[0019] 第一蛋白檢測探針包含與靶蛋白結(jié)合的第一抗體，所述第一抗體與第一多核苷酸 連接，所述第一多核苷酸包含與第二探針的3'末端上的I區(qū)段互補的3'末端上的I區(qū)段； 且
[0020] 第二蛋白檢測探針包含與靶蛋白結(jié)合的第二抗體，所述第二抗體與第二多核苷酸 連接，所述第二多核苷酸包含與第一多核苷酸的3'末端上的I區(qū)段互補的I區(qū)段；
[0021] 其中第一抗體與靶蛋白的結(jié)合和第二抗體與靶蛋白的結(jié)合允許第一蛋白鄰近探 針的I區(qū)段與第二蛋白鄰近探針的I區(qū)段雜交以形成步驟（b)中延伸的雙鏈體，以提供第 二延伸產(chǎn)物；
[0022] 使用擴增第二延伸產(chǎn)物或其亞區(qū)的一組引物在（c)的擴增反應(yīng)中擴增第二延伸 產(chǎn)物、或其亞區(qū)；以及
[0023] 檢測來自第二延伸產(chǎn)物或其亞區(qū)的擴增的擴增子的量。
[0024] 在一些實施方案中，檢測該量的步驟包括使用例如qPCR反應(yīng)定量擴增子的量。
[0025] 在一些實施方案中，反應(yīng)是在其中檢測多種RNA的多重反應(yīng)。
[0026] 在另外的方面，本發(fā)明包括鄰近探針對用于檢測/定量樣品中的靶核酸的用途； 或鄰近探針對用于檢測/定量樣品中的靶核酸和蛋白的用途。在一些實施方案中，本發(fā)明 提供了鄰近探針對用于檢測/定量樣品中的靶核酸的用途；或鄰近探針對用于檢測/定量 樣品中的靶核酸和蛋白的用途，其中鄰近探針對的成員的一個被封閉。
[0027] 附圖簡述
[0028] 圖1示出了檢測靶RNA的核酸鄰近延伸測定的一個實施方案。在該實施方案中， 探針對的各成員的3'末端是可延伸的。
[0029] 圖2示出了檢測靶RNA的核酸鄰近延伸測定的另一個實施方案。在該實施方案中， 探針中的一個的3'末端被封閉。
[0030] 詳細(xì)說明
[0031] 1.宙2和術(shù)語
[0032] 如本文所用，"序列"意指多核苷酸的核酸堿基序列。除非另外指明或從上下文明 顯，當(dāng)堿基或序列元件在多核苷酸中出現(xiàn)時，它們以順序5'至3'呈現(xiàn)。
[0033] "多核苷酸"或"核酸"包括RNA或DNA的任何形式，包括例如，基因組DNA ;互補 DNA (cDNA)，其是信使RNA (mRNA)的DNA表示，通常通過mRNA的逆轉(zhuǎn)錄獲得；以及合成或通 過擴增產(chǎn)生的DNA分子。多核苷酸可包括包含非標(biāo)準(zhǔn)堿基（例如，肌苷）的嵌合分子和核 酸。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的。
[0034] 術(shù)語"寡核苷酸"在本文中用于指是相對短的，通常短于200個核苷酸，更特別地， 短于100個核苷酸或短于50個核苷酸的核酸。通常，寡核苷酸是單鏈DNA分子。
[0035] "靶多核苷酸"或"靶核酸"是包含靶序列的多核苷酸。在雙鏈靶多核苷酸中，靶序 列在一條鏈上且靶序列的互補序列（complement)在另一條鏈上。"靶RNA"是包含靶序列 的 RNA0
[0036] 術(shù)語"區(qū)段"是指多核苷酸中的序列或亞序列，諸如具有特定功能的區(qū)段，例如，探 針結(jié)合區(qū)段、引物結(jié)合區(qū)段、索引序列，本文還稱為"標(biāo)簽序列"以及本文所列出的其他區(qū) 段。單獨的區(qū)段可具有與它們的預(yù)期功能一致的任何長度，諸如，但不限于，在10-100個核 苷酸、10-70個核苷酸、14-50個核苷酸、14-35個核苷酸的范圍內(nèi)的長度。
[0037] "靶序列"是在測定中檢測的核酸序列。在大多數(shù)情況下，感興趣的靶序列是預(yù)定 義的（即，分析之前序列已知）。在其他情況下，完整的靶序列是未知的，而是被定義為由 已知序列的引物擴增的序列。靶序列可在DNA(包括基因組的、線粒體的、病毒的、合成的和 cDNA)，在RNA、或其可擴增的合成類似物中發(fā)現(xiàn)。
[0038] 如本文所用，術(shù)語"互補"是指兩個核苷酸之間精確配對的能力。即，如果核酸的 給定位置上的核苷酸能夠與另一個核酸的核苷酸氫鍵鍵合，則這兩個核酸被認(rèn)為在該位置 上彼此互補。"互補序列"可以是完全互補或部分互補的序列。兩個單鏈核酸分子之間的互 補性可以是"部分的"，其中僅一些核苷酸結(jié)合，或當(dāng)在單鏈分子之間存在總互補性（total complementarity)時，它可以是完整的。當(dāng)存在足夠互補性使得序列在測定條件下雜交 (形成雙鏈區(qū)域）時，認(rèn)為兩種寡核苷酸具有"互補"序列。核酸鏈之間的互補性程度對核 酸鏈之間雜交的效力和強度具有顯著效應(yīng)。部分互補的兩條序列可具有，例如，在至少7個 核苷酸的序列上，更通常在10-30個核苷酸的序列上，通常在14-25個核苷酸的序列上，且 有時在更長序列（例如，26-100個核苷酸長度）上的至少90%同一性、或至少95%、96%、 97%、98%、或99%同一性序列。將理解，引物序列的3'堿基將可期望與靶核酸序列的相 應(yīng)堿基完全互補以允許引發(fā)發(fā)生。當(dāng)由第一序列組成的多核苷酸與由第二序列組成的多核 苷酸足夠互補以特異性雜交時，第一序列或區(qū)段與第二序列或區(qū)段"基本上互補"。為了便 于說明，雜交條件是小于約1.0 M鈉離子，通常約0.0 lM至1.0 M鈉離子的鹽濃度，在pH 7. 0 至8. 3,和用于10個至50個核苷酸長度的多核苷酸的至少約30°C及用于更長探針（例 如，大于50個核苷酸）的至少約60°C的溫度。通常，當(dāng)在至少14個-25個核苷酸的延伸 (stretch)上存在至少約55%堿基互補、優(yōu)選地至少65%、更優(yōu)選地至少75%、更優(yōu)選地至 少85%、更優(yōu)選地至少90%、和最優(yōu)選地至少95%時，特異性雜交將發(fā)生。引號[']用于 指不完全或基本互補序列。
[0039] 提及兩條多核苷酸序列、區(qū)段或鏈的術(shù)語"退火"、"雜交"或"結(jié)合"，可互換使用， 并具有本領(lǐng)域的通常含義。兩條互補序列（例如，DNA和/或RNA)通過與互補堿基形成氫 鍵來退火或雜交，以產(chǎn)生雙鏈多核苷酸或多核苷酸的雙鏈區(qū)域。
[0040] 如果不存在隔開多核苷酸中的兩個序列或區(qū)段的插入序列或非核苷酸連接體，則 它們是"相鄰的（adjacent)"或"鄰近的（contiguous)"。在一些情況下，"不相鄰"是指兩 條探針結(jié)合序列通過插入靶序列彼此分離。
[0041] "引物"是包含與靶序列、或其互補序列互補，并能夠雜交的序列的寡核苷酸或多 核苷酸。通常，"引物"意指可引發(fā)模板依賴