一種用于檢測(cè)xy染色體異常的fish探針、試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)XY染色體異常的FISH探針、試 劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 焚光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH)是在 20 世紀(jì) 80 年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)，以 熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法.FISH的基本原理是將DNA(或 RNA)探針用特殊的核苷酸分子或者熒光素分子偶聯(lián)標(biāo)記，然后將探針直接雜交到染色體 或DNA纖維切片上，通過與靶序列的特異性結(jié)合來進(jìn)行DNA的定性、定位、相對(duì)定量分析， FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長(zhǎng)期保存、能同時(shí)顯示多種顏色等優(yōu)點(diǎn)。
[0003] 自1971年巴黎國(guó)際染色體命名會(huì)議以來，已發(fā)現(xiàn)人類染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)畸 變3000余種，目前已確認(rèn)染色體病綜合征100余種，智力低下和生長(zhǎng)發(fā)育遲滯是染色體病 的共同特征。
[0004] 最常見的染色體疾病Down綜合征（Down' ssyndrome)的新生兒發(fā)病率為1/700~ 1/600。除Down綜合征之外，13三體綜合征（trisomyl3syndrome)的活嬰發(fā)病率為1/2000， 女性多于男性，患兒母親平均生育年齡為31歲。18三體綜合征（trisomyl8syndrome)的 活嬰發(fā)病率為1/4000女性多見患者母親平均生育年齡為34歲。脆性X染色體綜合征 (fragile-Xsyndrome)估計(jì)可使1/1500的男嬰受累由于女性具有兩條X染色體，受累率為 50%，程度較輕Klinefelter綜合征（Klinefelter' ssyndrome)的染色體表型為XXY，僅見 于男性。Turner綜合癥的染色體為X0(45X)型，僅見于女性。Williams綜合征的新生兒 發(fā)病率為1/2萬，Prader-Willi綜合征的新生兒發(fā)病率為1/2萬，Rett綜合征的發(fā)病率為 1/1. 5萬~1/1萬，僅見于女性。
[0005] 骨髓移植是各種血液腫瘤及某些先天性免疫缺乏癥的根治方法。是將正常骨髓由 靜脈輸入患者體內(nèi)，取代病變骨髓，重建患者的造血功能和免疫功能。異性骨髓移植中，會(huì) 出現(xiàn)血液細(xì)胞性染色體的變化，因此，XY染色體檢測(cè)能夠用于性染色體錯(cuò)配的骨髓移植的 效果監(jiān)測(cè)。
[0006] 常規(guī)FISH雜交時(shí)間在10~24小時(shí)，需過夜進(jìn)行檢測(cè)。基于BAC的雜交探針包含 除重復(fù)片段外的長(zhǎng)片段序列，序列的復(fù)雜性導(dǎo)致雜交時(shí)間長(zhǎng)，雜交背景高，易受外界條件影 響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)XY染色體異常 的FISH探針，用于染色體異常的檢測(cè)。
[0008] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0009]一種用于檢測(cè)XY染色體異常的FISH探針，該FISH探針以人類全基因組為模板， 利用X引物對(duì)和Y引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)而得，所述X引物對(duì)和Y引物對(duì)的序列如下：
[0010] X引物對(duì)序列為，
[0011] F : 5 ' -AAACAGTGTTTCCAAACTGCTGA-3'，
[0012] R :5'-TTGTAGAATCTGCGAAGGGACAT-3'；或
[0013] F : 5 ' -TTCTTTCTAGTTTTTATCTGGGGAT-3'，
[0014] R :5' -CTATCTGAGAAACTGCTTTGTGATG-3;或
[0015] F :5，-AAGGAAAAGGCTTGTAATTTCCCAT-3，，
[0016] R :5'-AATCAAAAGGAGGGTTCAACTGTGT-3'；
[0017] Y引物對(duì)序列為：
[0018] F :5' -TCTGAGACACTTCTTTGTGGTAT-3，，
[0019] R :5'-CTCAAAATATCCACTTTCACATT-3'；或
[0020] F : 5 ' -GAGACACTTCTTTGTGGTATGTGC-3'，
[0021] R :5'-ACAATGGGCCTCAAAGTGCT-3'；或
[0022] F :5, -ACTTTGAGGCCCATTGTGGA-3,；
[0023]R : 5，-CGCTCAAAATATCCACTTTCACAT-3，。
[0024]作為優(yōu)選的方案，用于檢測(cè)XY染色體異常的FISH探針中，所述X引物對(duì)為
[0025] F : 5，-AAGGAAAAGGCTTGTAATTTCCCAT-3，，
[0026]R :5,-AATCAAAAGGAGGGTTCAACTGTGT-3,；
[0027] Y引物對(duì)為：
[0028] F : 5 ' -TCTGAGACACTTCTTTGTGGTAT-3，，
[0029]R: 5，-CTCAAAATATCCACTTTCACATT-3，。
[0030]一種用于檢測(cè)XY染色體異常的FISH探針的制備方法，該制備方法的步驟如下：
[0031] 1)片段篩選：通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Xpll. 1-qll. 1和Ypll. 1-qll. 1區(qū)段，標(biāo)記出 satellite DNA；
[0032] 2)引物設(shè)計(jì)：將上述標(biāo)記出satellite DNA重復(fù)序列導(dǎo)入引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物 設(shè)計(jì)，并人工合成X引物對(duì)和Y引物對(duì)，序列為SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0. 12 ;
[0033] 3) PCR擴(kuò)增：以人類基因組DNA為模板，X引物對(duì)和Y引物對(duì)，分別在PCR體系中進(jìn) 行體外擴(kuò)增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行分析，確認(rèn)PCR的特異性的擴(kuò)增 產(chǎn)物；
[0034] 4)克隆質(zhì)粒的制備：將上述擴(kuò)增產(chǎn)物純化后得到目的產(chǎn)物，將純化后的目的產(chǎn)物 與載體PMD18-T連接，制備出包含目的片段的克隆質(zhì)粒pMD18-T-X，pMD18-T-Y ;
[0035] 5)制備探針：以上述包含目的片段的克隆質(zhì)粒為模板，制備熒光素標(biāo)記的FISH探 針。
[0036] 具體地，步驟3)所述PCR體系為：
[0037]
[0038] 總體積為50 y L ;
[0039] PCR反應(yīng)條件為：
[0040] 95 °C 3 分鐘；
[0041] 94°C 30 秒，58 °C 30 秒，72 °C 45 秒，40 個(gè)循環(huán)；
[0042] 72 °C 10 分鐘。
[0043] 進(jìn)一步的，步驟5)探針的制備方法如下：以包含目的片段的質(zhì)粒為模板，使用熒 光素標(biāo)記的dUTP直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物標(biāo)記熒光，避光、-20 °C儲(chǔ)存。
[0044] 步驟5)所述的PCR擴(kuò)增中PCR反應(yīng)體系：
[0045]
[0046] 進(jìn)一步的，步驟5)探針的制備方法如下：以包含目的片段的質(zhì)粒為模板，使用熒 光素標(biāo)記的dUTP利用切口平移方法進(jìn)行反應(yīng)，將質(zhì)粒標(biāo)記熒光，避光、_20°C儲(chǔ)存。
[0047] 本發(fā)明的另一目的在于將上述FISH探針用于制備檢測(cè)XY染色體異常的試劑或試 劑盒中。
[0048] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)XY染色體異常的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明所 述的FISH探針。
[0049] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0050] 1.相對(duì)于傳統(tǒng)的BAC FISH，本發(fā)明所述的FISH探針包含特異的高度重復(fù)序列片 段，反應(yīng)體系中不需使用封閉DNA，背景更低；探針中所包含的短片段在進(jìn)行雜交時(shí)較長(zhǎng)片 段（如基于BAC細(xì)菌人工染色體）所需的時(shí)間更短；
[0051] 2.本發(fā)明所述的FISH探針可以很好檢測(cè)出XY染色體異常，具有快速的特點(diǎn)，可夠 應(yīng)用于快速檢測(cè)中；
[0052] 3.本發(fā)明所述的試劑盒具有反應(yīng)靈敏、快速等特點(diǎn)。
[0053] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0054] 圖1為PCR產(chǎn)物的電泳圖；
[0055] 圖2中期或間期染色體DNA，熒光原位雜交后的熒光信號(hào)圖；
[0056] 圖3羊水樣本檢測(cè)結(jié)果圖（陰性）；
[0057] 圖4羊水樣本檢測(cè)結(jié)果圖（陽(yáng)性）；
[0058] 圖5骨髓移植中的應(yīng)用結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0059] -種用于檢測(cè)XY染色體異常的FISH探針，一種用于檢測(cè)XY染色體異常的FISH 探針，該FISH探針以人類全基因組為模板，利用X引物對(duì)和Y引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng) 而得，所述乂引物對(duì)的序列為觀〇10勵(lì).1-5￡〇10勵(lì).6，所述￥引物對(duì)的序列為5￡〇10 NO. 7-SEQ ID NO. 12〇
[0060] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于檢測(cè)XY染色體異常的FISH探針的制備方 法，該制備方法的步驟如下：
[0061] 1)片段篩選：通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Xpll. 1-qll. 1和Ypll. 1-qll. 1區(qū)段，標(biāo)記出 satellite DNA ；
[0062] 2)引物設(shè)計(jì)：將上述標(biāo)記出satellite DNA重復(fù)序列導(dǎo)入引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物 設(shè)計(jì)，并人工合成X引物對(duì)和Y引物對(duì)，序列為SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0. 12 ;
[0063] 3) PCR擴(kuò)增：以人類基因組DNA為模板，X引物對(duì)和Y引物對(duì)，分別在PCR體系中進(jìn) 行體外擴(kuò)增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行分析，確認(rèn)PCR的特異性的擴(kuò)增 產(chǎn)物；
[0064] 4)克隆質(zhì)粒的制備：將上述擴(kuò)增產(chǎn)物純化后得到目的產(chǎn)物，將純化后的目的產(chǎn)物 與載體PMD18-T連接，制備出包含目的片段的克隆質(zhì)粒pMD18-T-X，pMD18-T-Y ;
[0065] 5)制備探針：以上述包含目的片段的克隆質(zhì)粒為模板，制備熒光素標(biāo)記的FISH探 針。
[0066] 具體的，步驟5)探針的制備方法如下：以包含目的片段的質(zhì)粒為模板，使用熒光 素標(biāo)記的dUTP直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物標(biāo)記熒光，避光、-20 °C儲(chǔ)存。
[0067] 具體地，步驟5)探針的制備方法如下：以包含目的片段的質(zhì)粒為模板，使用熒光 素標(biāo)記的dUTP利用切口平移方法進(jìn)行反應(yīng)，將質(zhì)粒標(biāo)記熒光，避光、-20°C儲(chǔ)存。
[0068] 本發(fā)明的另一目的在于將上述FISH探針用于制備檢測(cè)XY染色體異常的試劑或試 劑盒中。
[0069] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)XY染色體異常的試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明所 述的FISH探針。
[0070] 以下是本發(fā)明具體的實(shí)施例，在下述實(shí)施例中除了FISH探針以外，其余的試劑均 可以通過市售途徑獲取。
[0071] 實(shí)施例1
[0072] 1)片段篩選：NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Xpll. 1-qll. 1和Ypll. 1-qll. 1區(qū)段，標(biāo)記出 satellite DNA；
[0073] 2)引物設(shè)計(jì)：將上述標(biāo)記出satellite DNA重復(fù)序列導(dǎo)入引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物 設(shè)計(jì)，并人工合成X引物對(duì)和Y引物對(duì)，
[0074] 從以下所述X引物對(duì)序列中選擇一組上、下游序列：
[0075] F：5, -AAACAGTGTTTCCAAACTGCTGA-3, (SEQ ID NO. 1),
[0076] R :5' -TTGTAGAATCTGCGAAGGGACAT-3'（SEQ ID NO. 2);或
[0077] F :5' -TTCTTTCTAGTTTTTATCTGGGGAT-3'（SEQ ID NO. 3)，
[0078] R :5' -CTATCTGAGAAACTGCTTTGTGATG-3(SEQ ID NO. 4);或
[0079] F :5' -AAGGAAAAGGCTTGTAATTTCCCAT-3，（SEQ ID NO. 5)，
[0080] R：5, -AATCAAAAGGAGGGTTCAACTGTGT-3, (SEQ ID NO. 6)；
[0081] 從以下Y引物對(duì)序列中選擇一組上、下游序列：
[0082] F :5' -TCTGAGACACTTCTTTGTGGTAT-3'（SEQ ID N0. 7)，
[0083] R :5' -CTCAAAATATCCACTTTCACATT-3'（SEQ ID NO. 8);或
[0084] F :5'-GAGACACTTCTTTGTGGTATGTGC-3'（SEQ ID NO. 9)，
[0085] R :5' -ACAATGGGCCTCAAAGTGCT-3'（SEQ ID NO. 10);或
[0086] F :5' -ACTTTGAGGCCCATTGTGGA-3'（SEQ ID NO. 11);
[0087] R :5' -CGCTCAAAATATCCACTTTCACAT