重組系統(tǒng)的制作方法
【專利說(shuō)明】重組系統(tǒng) 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及在靶位點(diǎn)進(jìn)行重組的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 不同的細(xì)胞類型可以用于不同的工業(yè)目的。例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞系用于抗體生產(chǎn)； 真菌細(xì)胞是生產(chǎn)多肽和次級(jí)代謝物的優(yōu)選生物；細(xì)菌細(xì)胞優(yōu)選用于小的代謝物和抗體的生 產(chǎn)；植物細(xì)胞優(yōu)選用于口味和風(fēng)味化合物。
[0004] 重組技術(shù)廣泛用于這樣的細(xì)胞和/或使用這樣的細(xì)胞的方法的生產(chǎn)力的最優(yōu) 化。這可涉及大量的選擇，包括但是不限于過(guò)表達(dá)感興趣的基因，競(jìng)爭(zhēng)途徑的缺失或失 活，改變酶的區(qū)室化（compartmentalization)，增加蛋白或代謝物分泌，增加細(xì)胞器含量 (organelle content)等。
[0005] 就絲狀真菌而言，可獲得的可選擇標(biāo)記有限使新細(xì)胞系的構(gòu)建復(fù)雜化。典型地，靶 序列在體外被改變以產(chǎn)生帶有插入的抗生素抗性標(biāo)記的突變等位基因。然而，鑒于大規(guī)模 使用攜帶抗性基因的生產(chǎn)菌株將這種基因擴(kuò)散到生物圈的潛在風(fēng)險(xiǎn)，大多數(shù)國(guó)家的監(jiān)管機(jī) 構(gòu)反對(duì)使用抗生素抗性標(biāo)記。此外，適用于絲狀真菌的可選擇標(biāo)記數(shù)量有限。因此，可需要 除去可選擇標(biāo)記基因以使生產(chǎn)菌株可以在商業(yè)上使用和/或以使同樣的標(biāo)記基因可以在 連續(xù)的菌株修飾中再循環(huán)利用。
[0006] 發(fā)明概沐
[0007] 本發(fā)明涉及在例如革巴基因組內(nèi)在革巴位點(diǎn)（target locus)或多個(gè)革巴位點(diǎn)（target loci)進(jìn)行重組的方法。本發(fā)明所述的重組方法導(dǎo)致靶位點(diǎn)的改變，例如在靶位點(diǎn)插入核酸 序列?？蓪?shí)施所述的方法以使在靶位點(diǎn)插入新的序列并伴隨從靶位點(diǎn)除去現(xiàn)存的序列。也 就是說(shuō)，所述方法可被用于將靶位點(diǎn)上的序列替換為替代性序列。所述方法可方便地在宿 主細(xì)胞體內(nèi)實(shí)施。
[0008] 典型地，當(dāng)在體內(nèi)實(shí)施時(shí)，不對(duì)人類或動(dòng)物細(xì)胞實(shí)施本發(fā)明所述的方法。也就是 說(shuō)，典型地不以治療方法的形式實(shí)施本發(fā)明所述的方法?？梢噪x體或體外方式實(shí)施本發(fā)明 所述的方法。術(shù)語(yǔ)離體或體外應(yīng)被理解為包括對(duì)微生物（對(duì)完整活細(xì)胞或非細(xì)胞物質(zhì)二 者）實(shí)施的方法，但排除對(duì)人類或動(dòng)物實(shí)施的方法。
[0009] 典型地，實(shí)施所述方法使至少部分插入在靶位點(diǎn)的序列隨后被移除。如果實(shí)施所 述的方法以在靶位點(diǎn)替換序列并隨后移除插入的序列，那么結(jié)果可以是使靶位點(diǎn)的序列缺 失。
[0010] 因此，可實(shí)施本發(fā)明所述的方法以改變靶位點(diǎn)的序列。這種改變可以是，例如添加 新的序列、置換現(xiàn)存的序列和/或缺失/去除現(xiàn)存的序列。
[0011] 典型地，本發(fā)明在宿主細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行。宿主細(xì)胞可以優(yōu)選地是生產(chǎn)感興趣的化合 物的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以在應(yīng)用本發(fā)明方法之前能夠生產(chǎn)感興趣的化合物。在這種情況下， 本發(fā)明的方法可以用于修飾靶位點(diǎn)以使通過(guò)宿主細(xì)胞的感興趣的化合物的生產(chǎn)改變，例如 可以增加產(chǎn)量。或者，宿主細(xì)胞可以是由于應(yīng)用本發(fā)明的方法而生產(chǎn)感興趣的化合物的細(xì) 胞。
[0012] 因此根據(jù)本發(fā)明，提供了在靶位點(diǎn)進(jìn)行重組的方法，該方法包括：
[0013] -提供兩種或更多種核酸，它們總共包含：(a)能夠與靶位點(diǎn)側(cè)翼序列同源重組的 序列；(b)兩個(gè)或更多個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)；和（C)編碼識(shí)別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的重組 酶的序列，
[0014] 其中所述兩種或更多種核酸能夠相互同源重組從而產(chǎn)生單一核酸，并且
[0015] 其中所述兩種或更多種核酸中的至少兩種各包含編碼無(wú)功能的部分重組酶的序 列；以及
[0016] -使所述兩種或更多種核酸相互重組以及與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列重組，以在靶位點(diǎn) 插入編碼有功能重組酶的連續(xù)核酸序列，所述編碼重組酶的序列的側(cè)翼是至少兩個(gè)位點(diǎn)特 異性重組位點(diǎn)以及所述位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的側(cè)翼是能夠與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組 的序列。
[0017] 附圖簡(jiǎn)沐
[0018] 圖1闡述了通過(guò)直接整合的ICLl移除以及分開(kāi)的ere重組酶（split-cre recombinase)構(gòu)建體的體內(nèi)重組的原理。Cre-重組酶的表達(dá)受到GALl啟動(dòng)子的調(diào)控。
[0019] 圖 2 闡述了 pMA Cre-I 和 pMA Cre-2(pSUC225)的質(zhì)粒圖。pMA Cre-I 包含 1οχ66 位點(diǎn)，GALl啟動(dòng)子和失活的Cre重組酶開(kāi)放閱讀框5'部分，pSUC225包含Cre重組酶開(kāi)放 閱讀框的3'失活部分、CYCl終止子和1οχ71位點(diǎn)。
[0020] 圖3闡述了 pSUC227的質(zhì)粒圖。所述質(zhì)粒包含1οχ66位點(diǎn)，kanMX標(biāo)記盒，GALl啟 動(dòng)子和失活的Cre重組酶開(kāi)放閱讀框5'部分。
[0021] 圖4闡述了利用引物對(duì)DBC-03670和DBC-03761擴(kuò)增ICLl基因的基因組位點(diǎn)的 PCR反應(yīng)，在野生型情況下產(chǎn)生3449bp PCR片段，和在標(biāo)記被1οχ66和1οχ71的重組移除的 KO情況下產(chǎn)生1812bp PCR片段。
[0022] 圖5闡述了質(zhì)粒pEPO-US的示意圖，其包含用于失活在A. niger和E. coli質(zhì)粒 DNA中的印〇基因的置換盒的部分。該置換盒包含用于靶向的印〇側(cè)翼區(qū)域，突變IoxP位 點(diǎn)，功能性hygB標(biāo)記盒和可誘導(dǎo)的ere重組酶表達(dá)盒。更多pEPO-US的細(xì)節(jié)可以在實(shí)施例 部分找到（見(jiàn)下）。
[0023] 圖6闡述了質(zhì)粒EPO-DS的示意圖，其包含用于失活在A. niger和E. coli質(zhì)粒DNA 中的epo基因的置換盒的部分。該置換盒包含用于靶向的epo側(cè)翼區(qū)域，ere重組酶表達(dá) 盒，突變IoxP位點(diǎn)。更多EPO-DS的細(xì)節(jié)可以在實(shí)施例部分找到（見(jiàn)下）。
[0024] 圖7闡述了 5'分開(kāi)的CRE片段和3'分開(kāi)的CRE片段的片段產(chǎn)生以及如何在 A. niger的轉(zhuǎn)化和靶向重組中使用這些重疊的片段的可行設(shè)計(jì)的示意圖。上圖表示待靶向 基因的基因組DNA組成。中間圖顯示通過(guò)PCR擴(kuò)增的" 5 '分開(kāi)的CRE "和" 3 '分開(kāi)的CRE " 片段的生成。下圖顯示通過(guò)基因組中5'分開(kāi)的CRE和3'分開(kāi)的CRE的同源重組的A. niger 轉(zhuǎn)化。
[0025] 序列表描沐
[0026] SEQ ID NO :1闡述了 Cre-I合成片段的核酸序列。
[0027] SEQ ID NO :2闡述了 Cre-2合成片段的核酸序列。
[0028] SEQ ID NO :3闡述了 pMA Crel完全的核酸序列。
[0029] SEQ ID NO :4 闡述了 pMA Cre2(pSUC225)完全的核酸序列。
[0030] SEQ ID NO :5闡述了 pUG7-EcoRV完全的核酸序列。
[0031] SEQ ID NO :6闡述了引物DBC-02738的核酸序列。
[0032] SEQ ID NO :7闡述了引物DBC-02739的核酸序列。
[0033] SEQ ID NO :8闡述了帶有kanMX標(biāo)記PCR片段的pCR-Blunt II-TOPO載體的核酸 序列。
[0034] SEQ ID NO :9 闡述了 pSUC227 的核酸序列。
[0035] SEQ ID NO : 10闡述了 ICLl基因上游的5'側(cè)翼片段的核酸序列。
[0036] SEQ ID NO :11闡述了引物DBC-03754的核酸序列。
[0037] SEQ ID NO :12闡述了引物DBC-03755的核酸序列。
[0038] SEQ ID NO : 13闡述了 ICLl基因下游的3'側(cè)翼片段的核酸序列。
[0039] SEQ ID NO :14闡述了引物DBC-03758的核酸序列。
[0040] SEQ ID NO :15闡述了引物DBC-03759的核酸序列。
[0041] SEQ ID NO :16 闡述了 "Cre-1-kanMX" 片段的核酸序列。
[0042] SEQ ID NO :17闡述了引物DBC-03756的核酸序列。
[0043] SEQ ID NO :18闡述了引物DBC-03373的核酸序列。
[0044] SEQ ID NO : 19闡述了 Cre-2片段的核酸序列。
[0045] SEQ ID NO :20闡述了引物DBC-03374的核酸序列。
[0046] SEQ ID NO :21闡述了引物DBC-03757的核酸序列。
[0047] SEQ ID NO :22闡述了引物DBC-03760的核酸序列。
[0048] SEQ ID NO :23闡述了引物DBC-03761的核酸序列。
[0049] SEQ ID NO :24闡述了 DBC-03760和DBC-03761野生型ICLl的產(chǎn)物的核酸序列。
[0050] SEQ ID NO :25 闡述了 DBC-03760 和 DBC-03761 ICLl 缺失和 kanMX 標(biāo)記和 Cre 重 組酶外重組的產(chǎn)物的核酸序列。
[0051] SEQ ID NO :26闡述了引物DBC-07072和引物DBC-08586的產(chǎn)物的核酸序列。
[0052] SEQ ID NO :27闡述了引物DBC-08585和引物DBC-04415的產(chǎn)物的核酸序列。
[0053] SEQ ID NO :28闡述了引物DBC-07072的核酸序列。
[0054] SEQ ID NO :29闡述了引物DBC-08586的核酸序列。
[0055] SEQ ID NO :30闡述了引物DBC-08585的核酸序列。
[0056] SEQ ID NO :31闡述了引物DBC-04415的核酸序列。
[0057] 發(fā)明詳沐
[0058] 在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書通篇中，詞語(yǔ)"包括"、"包含"和"具有"應(yīng)被解釋為 包括性的。也就是說(shuō)，在上下文允許時(shí)，這些詞語(yǔ)旨在表達(dá)可能包括未明確指出的其他要素 或整體。
[0059] 不使用數(shù)量詞時(shí)表示一個(gè)或多于一個(gè)（即一個(gè)或至少一個(gè)）的客體。例如，"要素" 可表示一個(gè)要素或多于一個(gè)要素。
[0060] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法被用于在靶位點(diǎn)實(shí)施重組。重組指的是核酸的分子被打斷 然后被連上不同核酸分子的過(guò)程。本發(fā)明的重組過(guò)程典型地涉及人工和有目的地重組不同 核酸分子（其可來(lái)自于相同或不同生物體）以創(chuàng)造重組的核酸。
[0061] 術(shù)語(yǔ)"重組"的意思是，例如核酸序列是通過(guò)人工組合兩種否則分開(kāi)的序列區(qū)段 (例如通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)用基因工程技術(shù)處理分離的核酸）得到的。
[0062] 本發(fā)明所述的方法依賴于同源重組和位點(diǎn)特異性重組的結(jié)合。
[0063] "同源重組"指的是具有包含相似核苷酸序列的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的核苷酸序列（即同源序 列）之間的反應(yīng)，通過(guò)所述反應(yīng)分子能夠相互作用（重組）以形成新的、重組的核酸序列。 相似核苷酸序列的位點(diǎn)在本文中被分別稱為"同源序列"。典型地，同源重組的頻率隨著同 源序列的長(zhǎng)度的增加而增加。因此，雖然同源重組能夠在不完全相同的兩種核酸序列之間 發(fā)生，但隨著兩種序列之間的差異的增加，重組頻率（或效率）下降。可使用將被結(jié)合的兩 種分子的每一種上的一種同源序列以實(shí)現(xiàn)重組，從而產(chǎn)生"單交換"的重組產(chǎn)物。或者，兩 種同源序列可被放置將被重組的兩種分子的每一種上。供體上的兩種同源序列和靶標(biāo)上的 兩種同源序列之間的重組產(chǎn)生"雙交換"的重組產(chǎn)物。
[0064] 如果供體分子上的同源序列的側(cè)翼是將被操作的序列（例如感興趣的序列），那 么與靶分子的雙交換重組將產(chǎn)生這樣的重組的產(chǎn)物，其中感興趣的序列置換本來(lái)位于靶分 子上的同源序列之間的DNA序列。
[0065] "位點(diǎn)特異性重組"（也被稱為保守的位點(diǎn)特異性重組）是核酸鏈的交換發(fā)生在僅 具有有限程度的序列同源性的區(qū)段之間的一類重組。位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別和結(jié)合短DNA 序列（位點(diǎn)），在此處切割DNA骨架、交換參與的兩種DNA螺旋并重新連接DNA鏈，從而使核 酸區(qū)段重新排列。在一些位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)中，僅僅具有重組酶連同重組位點(diǎn)就足以執(zhí) 行所有這些反應(yīng)；在另一些系統(tǒng)中，可能還需要一些輔助蛋白和輔助位點(diǎn)。
[0066] 所述方法可被用于在靶位點(diǎn)實(shí)施重組以導(dǎo)致靶位點(diǎn)的修飾。因此，本發(fā)明可被用 于添加、缺失或以另外的方式改變靶位點(diǎn)。靶位點(diǎn)可以是編碼序列或非編碼序列?？衫帽?發(fā)明所述的方法以使這種編碼或非編碼序列可被破壞和/或部分或完全缺失和/或置換。 因此，本發(fā)明所述的方法可被用于置換靶位點(diǎn)的序列，例如用編碼標(biāo)記的序列。
[0067] 典型地，在宿主細(xì)胞（例如微生物的細(xì)胞）體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞可 產(chǎn)生感興趣的化合物。所述宿主細(xì)胞可以在應(yīng)用本發(fā)明所述的方法之前能夠產(chǎn)生感興趣的 化合物。在這種情況下，本發(fā)明所述的方法可被用于修飾靶位點(diǎn)以使所述宿主細(xì)胞的感興 趣的化合物的生產(chǎn)改變，例如可以增加產(chǎn)量?；蛘?，所述宿主細(xì)胞可以由于應(yīng)用本發(fā)明所述 的方法而產(chǎn)生感興趣的化合物。
[0068] 因此，本發(fā)明可被用于，例如最優(yōu)化宿主細(xì)胞的生產(chǎn)力和/或使用它們的工藝?；?者，本發(fā)明可被用以，例如引入新的核酸以使宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生感興趣的新化合物。本發(fā)明 可被連續(xù)使用以引入多個(gè)新的核酸序列至宿主細(xì)胞，從而引入全新的通路代謝通路。
[0069] 靶位點(diǎn)可以是待修飾的任何核酸序列。典型地，靶位點(diǎn)可以是基因組（生物體的 完整遺傳物質(zhì)）內(nèi)的序列，例如染色體上的位點(diǎn)。這種染色體可以是線型或環(huán)形的染色體。 然而，靶位點(diǎn)可以在染色體外，例如質(zhì)粒、微型染色體或人工染色體上的位點(diǎn)。靶位點(diǎn)可以 位于質(zhì)粒、噬菌體或任何其它能夠在體外或在宿主細(xì)胞中復(fù)制或者被復(fù)制的核酸序列。
[0070] 本發(fā)明的方法可以在體外，離體或體內(nèi)進(jìn)行。
[0071] 本發(fā)明的方法包括：
[0072] -提供兩種或更多種核酸，它們總共包含：(a)能夠與靶位點(diǎn)側(cè)翼序列同源重組的 序列；(b)兩個(gè)或更多個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)；和（C)編碼識(shí)別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的重組 酶的序列，
[0073] 其中所述兩種或更多種核酸能夠相互同源重組從而產(chǎn)生單一核酸，并且
[0074] 其中所述兩種或更多種核酸中的至少兩種各包含編碼無(wú)功能的部分重組酶的序 列；以及
[0075] -使所述兩種或更多種核酸相互重組以及與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列重組，以在靶位點(diǎn) 插入編碼有功能重組酶的連續(xù)核酸序列，所述編碼重組酶的序列的側(cè)翼是至少兩個(gè)位點(diǎn)特 異性重組位點(diǎn)以及所述位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的側(cè)翼是能夠與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組 的序