阿司匹林抵抗相關(guān)的p2y1基因多態(tài)性位點(diǎn)及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)疾病治療藥物選擇領(lǐng)域，具體涉及阿司匹林抵抗相關(guān)的P2Y1基 因多態(tài)性位點(diǎn)及應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 隨著我國人口老齡化，腦血管病發(fā)病率逐年攀升，最新調(diào)查結(jié)果表明從2010年起 腦血管病已成為超越腫瘤危害中國人健康的第一大殺手，每年我國新發(fā)病例200萬，缺血 性腦血管病占70~80%，復(fù)發(fā)患者占27%，70%的患者留有神經(jīng)功能缺損，腦血管病的高 致死率、致殘率和復(fù)發(fā)率已造成了極大的社會(huì)負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?？寡“逅幬铮ㄓ绕涫前?司匹林）在腦血管病的防治中起著至關(guān)重要的作用，但是目前的調(diào)查結(jié)果表明很多腦血管 病患者即使服用了抗血小板藥物，仍然反復(fù)再發(fā)卒中，這種現(xiàn)象稱為抗血小板藥物抵抗。
[0003] 抗血小板藥物抵抗與諸多因素相關(guān)，如腦血管病相關(guān)危險(xiǎn)因素（性別、糖尿病、吸 煙、代謝綜合征、急性冠脈綜合征、既往心血管事件、肝腎功能異常、血液系統(tǒng)疾病等），患者 依從性或藥物劑量，藥物相互作用及基因多態(tài)性等。其中基因多態(tài)性是目前研宄熱點(diǎn)。既 往研宄發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)影響阿司匹林作用的多個(gè)環(huán)節(jié)的因子存在基因多態(tài)性，這種多態(tài)性直 接影響其功能，從而使得不同個(gè)體服用阿司匹林后對(duì)血小板的反應(yīng)不同。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，臨 床阿司匹林抵抗的患者高達(dá)40%，但是因?yàn)橛绊懓⑺酒チ肿饔玫陌悬c(diǎn)眾多，到目前為止，阿 司匹林抵抗相關(guān)的基因多態(tài)性還不確定。但是阿司匹林作為缺血性腦血管疾病二級(jí)預(yù)防的 重要藥物，盡快明確阿司匹林抵抗相關(guān)基因多態(tài)性至關(guān)重要。
[0004] P2Y1是血小板表面G蛋白偶聯(lián)受體，ADP通過P2Y1和P2Y12受體刺激血小板的激 活和聚集。基于申請(qǐng)人最近的研宄，申請(qǐng)人明確了一個(gè)與阿司匹林抵抗相關(guān)的P2Y1基因多 態(tài)性位點(diǎn)：P2Y1 (A745G)，該位點(diǎn)可用于為缺血性卒中患者選擇抗血小板藥物，降低阿司匹 林抵抗及卒中復(fù)發(fā)率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了阿司匹林抵抗相關(guān)的P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)：A745G。該 位點(diǎn)位于人P2Y1基因全長(zhǎng)的第745位，其堿基為A或G，攜帶有P2Y1突變體745G等位基因 的患者與野生型A745患者相比，更易出現(xiàn)阿司匹林抵抗。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了檢測(cè)阿司匹林抵抗相關(guān)P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn) A745G的引物。
[0007] 本發(fā)明最后一個(gè)目的在于提供了基于P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)A745G的引物在制備 篩選阿司匹林抵抗患者試劑盒中的應(yīng)用。該試劑盒可用于篩選阿司匹林抵抗患者，以便更 好的為缺血性卒中患者選擇抗血小板藥物，降低阿司匹林抵抗及卒中復(fù)發(fā)率。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0009] 與阿司匹林抵抗相關(guān)的P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)，該位點(diǎn)是在人P2Y1基因的745位 發(fā)生了 A - G的突變，經(jīng)檢測(cè)攜帶有P2Y1突變體745G的患者更容易發(fā)生阿司匹林抵抗?；?于P2Y1基因的A745G位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，然后對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。
[0010] 本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容還包括檢測(cè)阿司匹林抵抗相關(guān)P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)A745G的 引物，該引物只要是基于P2Y1基因的A745G位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物，并能成功擴(kuò)增出包括P2Y1基 因的A745G的DNA片段的，均為本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容。
[0011] 優(yōu)選的，根據(jù)上述P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)A745G設(shè)計(jì)的引物為：
[0012] 正義鏈：5 '-CACGGGTGGCCATGTCGC-3'
[0013] 反義鏈：5 '-TACCAGGTAAATCGATTT-3' ；
[0014] 或
[0015] 正義鏈：5 '-CACATGGGGGAGTTCAGG-3'
[0016] 反義鏈：5 '-AACAGTCAGTACAATGAT-3' ；
[0017] 或
[0018] 正義鏈：5 '-ACAAAGACTGTACGTAGT-3' ；
[0019] 反義鏈：5 '-GTCACCTGATACGTGGCA-3'。
[0020] 基于P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)A745G的引物在制備篩選阿司匹林抵抗患者試劑盒中 的應(yīng)用，包括利用P2Y1 (A745G)位點(diǎn)引物對(duì)缺血性卒中患者的DNA進(jìn)行檢測(cè)，若檢測(cè)到攜帶 有P2Y1突變體745G的患者，則該患者有更易產(chǎn)生阿司匹林抵抗的趨勢(shì)，檢測(cè)方法包括但不 限于目前已有的針對(duì)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù)。
[0021] 包括利用本發(fā)明提供的P2Y1 (A745G)位點(diǎn)引物，與其他阿司匹林抵抗相關(guān)的多態(tài) 性位點(diǎn)引物結(jié)合組成的試劑盒，對(duì)患者的DNA進(jìn)行檢測(cè)，來篩選更易產(chǎn)生阿司匹林抵抗的患 者。所述的其他與阿司匹林抵抗相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)為：人COX-I基因多態(tài)性位點(diǎn)（A842G)， 引物為：正義鏈：5 ' -AAGCCTTATTAGAGGGTA-3 '，反義鏈：5 ' -TACTTTGACGCCGGTGGG-3 ' ；和 人GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)（C807T)，引物：正義鏈：5'-TTCCTTAACTGTTACTTC-3'，反義鏈： 5 '-CTGTGCCATCTCCTATTT-3'。
[0022] 所述的其他與阿司匹林抵抗相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)或?yàn)椋喝薌P I a基因多態(tài)性位點(diǎn) (C807T)，引物：正義鏈：5 '-TTCCTTAACTGTTACTTC-3'，反義鏈：5 '-CTGTGCCATCTCCTATTT-3' 和人GP III a基因多態(tài)性位點(diǎn)（A1166C)，引物：正義鏈：5 '-TGTCAGACACTACACTCA-3'，反義 鏈：5 '-GGATAATCCTAGGAAAAT-3'。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：
[0024] 1)本發(fā)明提供的P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)（A745G)與阿司匹林抵抗相關(guān)，意在為缺血 性卒中患者更好的選擇抗血小板藥物，降低卒中復(fù)發(fā)率。
[0025] 2)本發(fā)明提供的針對(duì)檢測(cè)P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)A745G的引物，意在制備篩選阿司 匹林抵抗的患者的試劑盒。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說 明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案。
[0027] 實(shí)施例1 :
[0028] 與阿司匹林抵抗相關(guān)的P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)（A745G)的發(fā)掘：
[0029] 從卒中數(shù)據(jù)庫中調(diào)取2010~2014年卒中患者數(shù)據(jù)，根據(jù)缺血性卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)，篩 選確診為缺血性卒中患者，并且進(jìn)一步選取明確服用阿司匹林作為二級(jí)預(yù)防（二級(jí)預(yù)防是 針對(duì)已經(jīng)有腦卒中癥狀或已發(fā)生卒中后的患者而言，這些人需要預(yù)防再次發(fā)生腦卒中）的 患者為研宄對(duì)象作為總樣本（共5033人）。
[0030] 1.明確總樣本中卒中復(fù)發(fā)的人數(shù)，探討總樣本中P2Y1(A745G)基因的多態(tài)性與卒 中復(fù)發(fā)的關(guān)系（表2);
[0031] 2.總樣本中，回院復(fù)診患者（包括已復(fù)發(fā)的和未復(fù)發(fā)的患者，共3429人），采集患 者外周血，采用VerifyNow儀器檢測(cè)阿司匹林反應(yīng)單元（ARU)，確定ARU彡550的人數(shù)，探討 P2Y1 (A745G)基因的多態(tài)性與ARU彡550的關(guān)系（表1)。
[0032] 本發(fā)明實(shí)施例中中，以下兩種情況任意一種發(fā)生均視為發(fā)生阿司匹林抵抗：
[0033] 1.若患者服用阿司匹林期間，仍然發(fā)生卒中，則定義為阿司匹林抵抗；
[0034] 2.采用VerifyNow儀器檢測(cè)阿司匹林反應(yīng)單元（ARU)，如果ARU彡550,則定義為 血小板高反應(yīng)性，表明這個(gè)患者存在阿司匹林抵抗。
[0035] 結(jié)果表明，服用阿司匹林進(jìn)行二級(jí)預(yù)防的缺血性卒中患者中，與野生型患者相比， P2Y1 (A745G)突變型組患者阿司匹林反應(yīng)單元ARU值明顯高，且ARU彡550患者人數(shù)明顯高 于野生型組（表1);同時(shí)卒中復(fù)發(fā)率也明顯高（表2)。
[0036] 本實(shí)施例中針對(duì)P2Y1 (A745G)基因的多態(tài)性的檢測(cè)通過以下方法實(shí)現(xiàn)：
[0037] 針對(duì)P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)（A745G)設(shè)計(jì)引物如下：
[0038] 正義鏈：5 '-CACGGGTGGCCATGTCGC-3'
[0039] 反義鏈：5 '-TACCAGGTAAATCGATTT-3'。
[0040] 以患者總DNA為模板，利用常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為350bp，測(cè)序，檢測(cè) 擴(kuò)增片段的第185個(gè)堿基。野生型患者的DNA序列為SEQ ID NO. 1所示，突變型患者的DNA 序列為SEQ ID NO. 2所示。采用該對(duì)引物擴(kuò)增出的序列中第185個(gè)堿基對(duì)應(yīng)P2Y1基因中 的第745位點(diǎn)。
[0041] 表1 P2Y1 (A745G)野生型患者與突變型患者ARU值
[0042]
[0043] 表2 P2Y1(A745G)野生型患者與突變型患者卒中復(fù)發(fā)率
[0044]
[0045] 結(jié)果表明，基于該位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物可用于P2Y1(A745G)突變型患者的篩選，以便 更好的為缺血性卒中患者選擇抗血小板藥物，降低阿司匹林抵抗及卒中復(fù)發(fā)率。
[0046] 實(shí)施例2 :
[0047] 與阿司匹林抵抗相關(guān)P2Y1基因多態(tài)性位點(diǎn)（A745G)引物在制備篩選阿司匹林抵 抗患者試劑盒中的應(yīng)用：
[0048] 對(duì)所有首次發(fā)生缺血性卒中患者，給予阿司匹林進(jìn)行二級(jí)預(yù)防，3個(gè)月后對(duì)患者進(jìn) 行隨訪，檢測(cè)每個(gè)患者ARU，及卒中復(fù)發(fā)情況。同時(shí)取患者外周血通過基因測(cè)序檢測(cè)患者是 否存在P2Y1 (A745G)多態(tài)性，分析突變型和野生型患者阿司匹林抵抗發(fā)生率。
[0049] 從2013年8月開始研宄，病例納入截止時(shí)間為2014年8月，根據(jù)缺血性卒中診斷 標(biāo)準(zhǔn)，選取確診為缺血性卒中患者作為研宄對(duì)象，完成以下工作：
[0050] 1.根據(jù)缺血性卒中二級(jí)預(yù)防指南，給予所有患者阿司匹林進(jìn)行二級(jí)預(yù)防；
[0051] 2.所有患者在啟動(dòng)二級(jí)預(yù)防90天時(shí)進(jìn)行隨訪，檢測(cè)隨訪研宄對(duì)象的ARU及卒中復(fù) 發(fā)情況；
[0052] 3.采取患者外周血，利用本發(fā)明提供的引物（正義鏈： 5 ' -AAGCCTTATTAGAGGGTA-3 ' ；反義鏈：5 ' -TACTTTGACGCCGGTGGG-3 '，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，測(cè)序， 擴(kuò)增出的片段全長(zhǎng)350bp，其中第185位堿基對(duì)應(yīng)P2Y1基因的第745位點(diǎn)。因此，通過對(duì)擴(kuò) 增的序列第185位堿基進(jìn)行判斷，檢測(cè)患者是P2Y1(A745)野生型還是P2Y1(745G)突變型。
[0053] 4.分析突變型和野生型患者ARU值和卒中復(fù)發(fā)率。
[0054] 結(jié)果表明，服用阿司匹林進(jìn)行二級(jí)預(yù)防的缺血性卒中患者中，與P2Y1(A745)野生 型患者相比，P2Y1 (745G)突變型組患者ARU值更高，且ARU彡550患者人數(shù)明顯高于野生 型組（表3)，卒中復(fù)發(fā)率也明顯高（表4)。
[0055] 表3 P2Y1 (A745G)野生型患者與突變型患者ARU值
[0056]
[0057] 表4 P2Y1(A745G)野生型患者與突變型患者卒中復(fù)發(fā)率
[0058]
[0059] 實(shí)施例3 :
[0060] 與阿司匹林抵抗相關(guān)其他基因多態(tài)性位點(diǎn)的發(fā)掘：
[0061] 1)與阿司匹林抵抗相關(guān)的COX-I基因多態(tài)性位點(diǎn)（A842G)的發(fā)掘：
[0062] 以實(shí)施例1同樣的卒中數(shù)據(jù)庫，血液樣本和方法，檢測(cè)總樣本（共5033人，與實(shí)施 例1相同）中COX-I (A842G)基因的多態(tài)性與卒中復(fù)發(fā)的關(guān)系（表6);及回院復(fù)診患者（包 括已復(fù)發(fā)的和未復(fù)發(fā)的患者，共3429人，與實(shí)施例1相同）中COX-I (A842G)基因的多態(tài)性 與ARU彡550的關(guān)系（表5)。
[0063] 結(jié)果表明，服用阿司匹林進(jìn)行二級(jí)預(yù)防的缺血性卒中患者中，與野生型患者相比， COX-I (A842G)突變型組患者阿司匹林反應(yīng)單元ARU值明顯高，且ARU彡550患者人數(shù)明顯 高于野生型組（表5);同時(shí)卒中復(fù)發(fā)率也明顯高（表6)。
[0064] 本實(shí)施例中針對(duì)COX-1 (A842G)基因的多態(tài)性的檢測(cè)通過以下方法實(shí)現(xiàn)：
[0065] 針對(duì)C0X-1基因多態(tài)性位點(diǎn)（A842G)設(shè)計(jì)引物如