一種雙特異性抗體cd19xcd3的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及免疫學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本申請?jiān)O(shè)及雙特異性抗體的構(gòu)建和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙特異性抗體化ispecificantibody,BiAb)是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的 人工抗體，能在祀細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，產(chǎn)生導(dǎo)向性的效應(yīng)功能。BiAb在 生物醫(yī)學(xué)中，特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過BiAb介導(dǎo)細(xì)胞毒作用 殺死腫瘤細(xì)胞是當(dāng)前免疫治療應(yīng)用研究的熱點(diǎn)，其主要特點(diǎn)是BiAb能同時結(jié)合腫瘤相關(guān) 抗原和免疫效應(yīng)細(xì)胞上的祀分子，直接觸發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。W下 是針對所研究的免疫細(xì)胞抗原和腫瘤細(xì)胞抗原，W及相關(guān)技術(shù)發(fā)展的一些【背景技術(shù)】介紹。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4個亞基組成；5、e、丫、C，其分子質(zhì)量分別為18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其長度分別有171、207、182、164個氨基酸殘基。它們一起組成6條膚鏈， 常與T細(xì)胞受體（Tcellrec巧tor，TCR)緊密結(jié)合形成含有8條膚鏈的TCR-CD3復(fù)合體，結(jié) 構(gòu)示意圖見圖1。此復(fù)合體具有T細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，穩(wěn)定TCR結(jié)構(gòu)的功能。CD3胞質(zhì)段含免 疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)，TCR 識別并結(jié)合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原膚，導(dǎo)致CD3的 ITAM的保守序列的酪氨酸殘基被T細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶p561ck磯酸化，然后可募集其 他含有甜2(Scrhomology2)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM的磯酸化和 與ZAP-70的結(jié)合是T細(xì)胞活化信號傳導(dǎo)過程早期階段的重要生化反應(yīng)之一。因此，CD3分 子的功能是轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR識別抗原所產(chǎn)生的活化信號。
[0005] 2.CD19
[0006] CD19在正常及惡性B淋己細(xì)胞中均有表達(dá)，被視為B細(xì)胞發(fā)育過程中一個涵蓋階 段較長的最為可靠的表面標(biāo)記物。在正常淋己組織中，CD19表達(dá)于生發(fā)中屯、的B細(xì)胞和濾 泡樹突狀細(xì)胞、套細(xì)胞、濾泡間T細(xì)胞區(qū)的樹突狀大細(xì)胞，與CD20和CD22染色模式基本相 同，但同CD20相比，CD19在前B細(xì)胞中也表達(dá)。此外，通過流式細(xì)胞學(xué)檢測方法，CD19在 人體組織分離得到的漿細(xì)胞中可W檢測到。通常來說CD19在B淋己細(xì)胞瘤中表達(dá)，其中包 括B淋己細(xì)胞淋己瘤、小淋己細(xì)胞淋己瘤、套細(xì)胞淋己瘤、濾泡淋己瘤、Burkitt淋己瘤、邊 緣區(qū)淋己。
[0007] 3.雙特異性抗體技術(shù)發(fā)展
[000引雙特異性抗體，一個抗體分子中的兩個抗原結(jié)合部位可分別結(jié)合兩種不同的抗原 表位的抗體。
[0009] 抗體藥物是W細(xì)胞工程技術(shù)和基因工程技術(shù)為主體的抗體工程技術(shù)制備的生物 大分子藥物，具有特異性高、性質(zhì)均一、可針對特定祀點(diǎn)定向制備等優(yōu)點(diǎn)。單克隆抗體在臨 床上主要應(yīng)用于W下=個方面：腫瘤治療、免疫性疾病治療W及抗感染治療。其中腫瘤的治 療是目前單抗應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域，目前已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)和上市的單抗產(chǎn)品中，用于腫 瘤治療的產(chǎn)品數(shù)量占比大概為50%。單克隆抗體治療腫瘤是一種針對病變細(xì)胞特異祀點(diǎn)刺 激免疫系統(tǒng)來殺傷祀細(xì)胞的免疫療法，為了增強(qiáng)抗體的效應(yīng)功能，特別是殺傷腫瘤細(xì)胞的 效果，人們嘗試多種方法改造抗體分子，雙特異性抗體是改善抗體治療效果的發(fā)展方向之 一，現(xiàn)已成為抗體工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
[0010] 用于免疫治療的雙特異性抗體是含有2種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人工抗體，能在 祀細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，在腫瘤的免疫治療 中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0011] 4.雙特異性抗體制備
[0012] 雙特異性抗體可通過多種途徑獲得，其制備方法主要有：化學(xué)偶聯(lián)法、雜交一雜交 瘤法和基因工程抗體制備法?；瘜W(xué)偶聯(lián)法是將2個不同的單克隆抗體用化學(xué)偶聯(lián)的方式連 接在一起，制備出了雙特異性單克隆抗體，該是最早的雙特異性單克隆抗體概念。雜交一雜 交瘤法是通過細(xì)胞雜交法或者=元雜交瘤的方式產(chǎn)生雙特異性單克隆抗體，該些細(xì)胞雜交 瘤或者=元雜交瘤是通過建成的雜交瘤融合，或者建立的雜交瘤和從小鼠得到的淋己細(xì)胞 融合而得到的，只能生產(chǎn)出鼠源的雙特異性抗體，它的應(yīng)用受到了極大的限制。而隨著分子 生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了基因工程雙特異性抗體的多種構(gòu)建模式，并主要分為雙特 異性微抗體，雙鏈抗體，單鏈雙價抗體，多價雙特異性抗體四類。目前，國際上已有數(shù)種基因 工程雙特異性抗體藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并顯示有較好的應(yīng)用前景。
[0013] 5.腫瘤的過繼免疫治療
[0014] 腫瘤的過繼免疫治療是將自體或異體的免疫活性細(xì)胞經(jīng)過體外擴(kuò)增后輸入患者 體內(nèi)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，主要包括LAK細(xì)胞、TIL細(xì)胞、激活 的T淋己細(xì)胞和CIK細(xì)胞的免疫治療。而免疫療法只能清除少量的、零散的腫瘤細(xì)胞，對于 晚期的實(shí)體腫瘤療效有限。故常將其作為一種輔助療法與手術(shù)、化療、放療等常規(guī)方法聯(lián)合 應(yīng)用。先用常規(guī)方法清掃大量的腫瘤細(xì)胞后，再用免疫療法清除殘存的腫瘤細(xì)胞，可提高腫 瘤綜合治療的效果。其中，過繼免疫治療作為腫瘤綜合治療中的一個新方法，已經(jīng)與常規(guī)手 術(shù)治療、放療、化療及其他細(xì)胞和分子治療得到廣泛配合，在多種腫瘤的治療中展示了廣泛 的應(yīng)用前景。然而，一種更理想的方式應(yīng)該是，雙特異性抗體一端可W結(jié)合培養(yǎng)好的免疫細(xì) 胞的表面抗原CD3,并隨之一起輸入體內(nèi)，而雙特異性抗體的另一端能很好地結(jié)合腫瘤細(xì) 胞的表面抗原；該樣，雙特異性抗體就能在體內(nèi)架起腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的橋梁，使免 疫細(xì)胞集中在腫瘤細(xì)胞周圍，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。通過該種方法可有效解決腫瘤細(xì) 胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，克服了手術(shù)、放化療S大傳統(tǒng)治療方式后的"不徹底、易轉(zhuǎn)移、副作用大" 等弊端。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 術(shù)語和縮略語
[0016] BiAb:雙特異性抗體化ispecificantibody)
[0017] TA:腫瘤抗原（tumorantigen)
[0018] VH:重鏈可變區(qū)化eavychainvari油leregion)。
[0019] VL:輕鏈可變區(qū)（li曲tchainvari油leregion)。
[0020]CL;輕鏈恒定區(qū)（^constantregionofli曲tchain)。
[0021] CDR;是英文Complementaritydeterminingregions(CDRs)的縮寫，是指抗體的 抗原互補(bǔ)決定區(qū)。
[002引ScFv;單鏈可變區(qū)抗體片段（single-chainvari油lefragment)，又稱為單鏈抗 體。
[002引 化D:細(xì)胞系開發(fā)（celllinedevelopment)
[0024] FACS;巧光激活細(xì)胞分選（Fluorescence-activatedcellsorting)，也稱為流式 細(xì)胞分選術(shù)。
[0025] 本發(fā)明針對常規(guī)單克隆抗體的不足之處，通過基因工程和抗體工程的方法進(jìn)行的 新分子-雙特異性抗體的創(chuàng)制，在傳統(tǒng)單克隆抗體主要通過CDC，ADCC和調(diào)亡能力來殺傷腫 瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上，增加了介導(dǎo)T細(xì)胞的免疫療法，大大提高了免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的功 效。
[0026] 具體地，本發(fā)明提供了W下的技術(shù)方案：
[0027] 在一種實(shí)施方式中，提供一種雙特異性抗體，其特征在于，該抗體包含；(a)單鏈 單元A，為融合膚，該融合膚包含單鏈可變片段ScFv和具有較鏈區(qū)、C肥結(jié)構(gòu)域和C冊結(jié)構(gòu) 域的Fc片段，其中該融合膚針對腫瘤細(xì)胞表面抗原具有特異性結(jié)合能力，優(yōu)選地該腫瘤細(xì) 胞表面抗原是CD19、CD20、CD30和CD133,更優(yōu)選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是CD19 ;和化）單 鏈單元B，為融合膚，該融合膚包含單鏈可變片段ScFv和具有較鏈區(qū)、C肥結(jié)構(gòu)域和C冊結(jié) 構(gòu)域的化片段，其中該融合膚針對的免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、NKT細(xì)胞或CIK細(xì)胞；優(yōu)選地， 該融合膚對免疫細(xì)胞表面抗原CD3具有特異性結(jié)合能力。
[002引在一種實(shí)施方式中，所述單鏈單元A和所述單鏈單元B的C肥結(jié)構(gòu)域位于ScFv片 段和C冊結(jié)構(gòu)域之間。
[0029] 在一種實(shí)施方式中，所述單鏈單元A和所述單鏈單元B的單鏈可變片段由輕 鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域組成，它們分別都祀向于抗原表位CD19和抗原表位CD3 ; 單鏈單元A單鏈可變片段的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)由佑GGG巧3的短膚進(jìn)行連接，如 VH-佑GGG巧3-VL;單鏈單元B單鏈可變片段的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)佑GGG巧3的短膚進(jìn) 行連接，如VH-佑GGG巧3-VL。
[0030] 在一種實(shí)施方式中，所述單鏈單元A的較鏈區(qū)和所述單鏈單元B的較鏈區(qū)通過通 過一個或多個二硫鍵相連接。
[0031] 在一種實(shí)施方式中，單鏈單元A包括針對人源CD19的抗體抗-CD19;單鏈單元B包 括針對人源CD3的抗體抗-CD3 ;
[0032] 優(yōu)選地，所述抗-CD19ScFv-化的氨基酸序列為序列號1所示的氨基酸序列，W及 所述抗-CD3ScFv-化的氨基酸序列為序列號3所示的氨基酸序列；所述抗-CD19重鏈在265 和268位點(diǎn)