一種CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因多態(tài)性檢測領(lǐng)域，具體涉及一種CYP2C19*17基因多態(tài)性 SNaPshot檢測方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝臟是人體重要的解毒器官，許多藥物都經(jīng)肝臟代謝，細(xì)胞色素 P450 (cytochrome P450 )是主要的肝細(xì)胞I相代謝酶之一。在CYP2C亞家族中，CYP2C19亞型 對藥物反應(yīng)起著關(guān)鍵性的作用，因?yàn)樗鼈兊幕钚源嬖陲@著的個體差異，表現(xiàn)為遺傳多態(tài)性， 從而產(chǎn)生血藥濃度的個體差異。CYP2C19酶廣泛分布于肝、腎、腦、皮膚、肺、胃腸道及胎盤等 組織器官，主要在肝臟。其參與多種外源性物質(zhì)代謝如：藥物、酒精、抗氧化劑、有機(jī)溶劑、染 料、環(huán)境污染物質(zhì)等。從理論上講，所有的藥物代謝酶都具有遺傳多態(tài)性。絕大多數(shù)藥物代 謝酶的多態(tài)性是一種單基因多態(tài)性，是由于同一基因位點(diǎn)上具有多個等位基因引起的。遺 傳學(xué)的改變使CYP450酶表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，并且具有明顯個體、種族或地域差異。
[0003] 等位基因編碼的代謝酶具有不同的代謝能力：正常野生型表現(xiàn)為快代謝型（EM); 絕大多數(shù)突變型等位基因，因堿基的突變、插入或缺失而造成酶代謝能力降低，表現(xiàn)為慢代 謝型（PM)，這對治療的個體反應(yīng)和藥物毒副作用都產(chǎn)生重要影響。
[0004] CYP2C19至少存在14種突變基因和18種等位基因突變。編碼正常酶活性的基因是 CYP2C19*1，CYP2C19 等位基因主要是 *1，*2，*3......*17。而 CYP2C19*2 和 CYP2C19*3 等位 基因占東方人弱代謝表型（PM)的99%以上。*2, *3等位基因編碼的酶無活性，CYP2C19*2 等位基因變異的外顯子5第681位處的堿基發(fā)生變異（G/A)形成了一個異常剪接點(diǎn)，使得 轉(zhuǎn)錄時在外顯子5的始端丟失了 40個堿基對（643-682bp)，從而在翻譯時丟失了 215-227 位氨基酸，使215位氨基酸開頭的閱讀框架發(fā)生移動，因此在215位氨基酸下游第20個氨 基酸處提前產(chǎn)生1個終止密碼，使蛋白合成過早被終止，結(jié)果使這一截短的含234個氨基酸 的蛋白質(zhì)喪失了催化活性。由此導(dǎo)致的慢代謝在中國人中的發(fā)生率約為30%。CYP2C19*3 等位基因是在外顯子4第636位發(fā)生G/A突變，產(chǎn)生了提前的終止密碼，蛋白合成終止，使 CYP2C19酶活性喪失。通過該酶代謝的藥物(如質(zhì)子泵抑制劑，抗驚厥藥等）隨患者基因型 不同，其療效和副作用也有明顯不同。
[0005] 目前常用的對基因多態(tài)性位點(diǎn)檢測的方法有Sanger測序及AS-PCR+瓊脂糖凝膠 電泳，Sanger測序的方法檢測基因多肽性位點(diǎn)成本相對較高，AS-PCR+瓊脂糖凝膠電泳的 方法檢測多態(tài)性位點(diǎn)靈敏性相對較低。因此需要開發(fā)一種成本相對較低，同時靈敏性好，準(zhǔn) 確度與精密度高的基因多態(tài)性位點(diǎn)檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于為了克服以上現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種CYP2C19*17基因多 態(tài)性SNaPshot檢測方法與應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法，其包括如下步驟：首先提取血液基 因組DNA，將其稀釋至100 μ g/mL后通過PCR擴(kuò)增6???1/訴17的序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后 將對應(yīng)的序列進(jìn)行SNaPshotPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后通過毛細(xì)管電泳法檢測熒光信號并 通過軟件分析SNP位點(diǎn)，通過不同的熒光檢測結(jié)果確定檢測SNP位點(diǎn)處堿基變化確定基因 型。
[0008] 作為本發(fā)明所優(yōu)選的一種實(shí)施方式，所述的檢測方法，具體包括如下步驟： DDNA提?。禾崛》椒▍⒄誘IANampBloodDNAkit (購自Tiagen，貨號DP318)的說明書， 提取完畢的DNA計算其濃度并稀釋至100 μ g/mL ; 2) PCR擴(kuò)增6???1/訴17的序列：PCR反應(yīng)體系中組分及體積份數(shù)分別為Q5? Master Mixl2. 5份，雙蒸水8. 5份，，wardl份，Reversel份；準(zhǔn)確量取PCR反應(yīng)體系23 μ L，向其中 加入2 μ L稀釋后DNA模板；置PCR管放于PCR儀上并將反應(yīng)程序設(shè)置如下：1 :98°C，3 min ; 2:98°C，10 sec;3:58°C，30 sec;4:72°C，l min;5:往復(fù)進(jìn)行 35 個循環(huán)；6:72°C，5 min; 7 ：25〇C ； 3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化：取2體積份的ExoSAP-IT和3體積份的ddH20混合配制酶混合 物，按5 μ L分裝到新的8連管中，每管加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μ L，混勻微離心，按以下程序進(jìn) 行反應(yīng)：1 :37°C，15 min ;2 :80°C，15 min 3 :4°C ; 4 ) SNaPshotPCR擴(kuò)增：SNaPshotPCR反應(yīng)體系中組分及體積份數(shù)分別為SnaPshot 1^已(15^1叉2.5份；5\86911611(3；[1^1311打61'1份；？1'；[1116『8]\^叉6『2份；(1(1!1203.5 份；其中引物 為SNE_CYP2C19*17 ;準(zhǔn)確量取SNaPshotPCR反應(yīng)體系9 μ L，向其中加入1 μ L步驟3)得到 純化產(chǎn)物，混勻微離，按以下程序進(jìn)行PCRl :96°C，10 sec ;2 :55°C，5 sec ;3 :60°C，30 sec ; 4 :往復(fù)進(jìn)行25個循環(huán)；5 :4°C ; 5) SNaPshotPCR產(chǎn)物純化：向SNaPshotPCR產(chǎn)物中加入1 μ LSAP酶，按以下程序進(jìn)行反 應(yīng)：1 :37°C，60 min ;2 :75°C，15 min ;3 :4°C ; 6) SNaPshot分析：步驟5)獲得的產(chǎn)物經(jīng)ABI 3100-XL基因分析儀毛細(xì)管電泳法檢測 熒光信號，通過GENEMAPPERIDV4. 1軟件分析確定SNP位點(diǎn)，通過不同的熒光檢測結(jié)果確定 檢測SNP位點(diǎn)處堿基變化確定基因型。
[0009] 所述的CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法，所述檢測位點(diǎn)為67/^67訴17: c. -806C>T(SNP:rsl2248560)。
[0010] 所述的CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法，所述PCR中擴(kuò)增CYP2C19*17 的引物對如下：正向引物：GCCCTTAGCACCAAATTCTC(SEQ ID NO. 1);反向引物為： ATTTAACCCCCTAAAAAAACACG(SEQ ID NO. 2)〇
[0011] 所述的CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法，SNaPshot中擴(kuò)增CYP2C19*17 的引物如下：TTTTTTTTTTCAAATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAG(SEQ ID N0.3)。
[0012] 以上所述的檢測方法在CYP2C19代謝相關(guān)藥物治療中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提供的CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法通過采用PCR對基因位 點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，本發(fā)明提供的檢測方法具有高靈敏性、高準(zhǔn)確度和高精密性的優(yōu)點(diǎn)，是一種便 捷可靠的CYP2C19*3基因多態(tài)性SNaPshot檢測方法。
[0014] 本發(fā)明提供的檢測方法能夠在CYP2C19代謝相關(guān)藥物治療前進(jìn)行67/^67訴17基 因多態(tài)性檢測，判定患者的藥物代謝速率類型，有助于醫(yī)生為患者正確選擇藥物并合理調(diào) 整藥物劑量。
【附圖說明】
[0015] 圖1為6?° 訴17基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序圖。
[0016] 圖 2 為 SNaPshot 法檢測 6?° 講17 圖。
【具體實(shí)施方式】： 實(shí)施例1 I. CYP2C19*17基因多態(tài)性SNaPshot檢測 本檢測方法是通過采用PCR法擴(kuò)增檢測位點(diǎn)所在基因片段后采用熒光標(biāo)記單堿基延 伸技術(shù)（SNaPshot)結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果采用GENEMPPERID V4. 1進(jìn)行 分析，根據(jù)峰的移動位置確定延伸產(chǎn)物對應(yīng)的SNP位點(diǎn)。
[0017] 本檢測用于檢測來源于EDTA抗凝外周血的DNA樣本，采用PCR擴(kuò)增檢測位點(diǎn)所在 基因片段后采用熒光標(biāo)記單堿基延伸技術(shù)（SNaPshot)結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測，檢 測結(jié)果采用GENEMPPERID V4. 1進(jìn)行分析，根據(jù)峰的移動位置確定延伸產(chǎn)物對應(yīng)的SNP位 點(diǎn)。
[0018] 本檢測的檢測位點(diǎn)為 67/^67講 17: c.-806C>T(SNP:rsl2248560)。
[0019] 主要試劑及儀器如下： (1) 引物 本檢測所用引物均由自行設(shè)計（見表1)，NCBI基因參考序列號如下：NC_000010. 10， NM_000769. 1。PCR引物序列見表1，所有引物序列均通過UCSC數(shù)據(jù)庫比對，無已知SNP位 點(diǎn)。
[0020] 表1 PCR引物序列
(2) 試劑 本檢測DNA提取采用Qiagen公司產(chǎn)品TIANamp Blood DNA Kit，貨號DP318 ; PCR擴(kuò)增采用NEB公司產(chǎn)品Q5?熱啟動超保真2X Master Mix，貨