一種通過肉眼觀察對硫酸鹽還原菌進行半定量檢測的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到硫酸鹽還原菌（SRB)的檢測，具體為一種通過肉眼觀察對SRB進行 半定量檢測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 硫酸鹽還原菌（SRB)是一類以乳酸或丙酮酸等有機物作為電子供體，在厭氧狀態(tài) 下，把硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等還原為硫化氫的細菌總稱，它產(chǎn)生的硫化氫可對接 觸金屬特別是碳鋼造成嚴(yán)重腐蝕危害是海洋工程中亟待克服的問題之一。正是因為SRB在 各類環(huán)境中廣泛的存在及它的危害，對環(huán)境中SRB的檢測和監(jiān)控顯得非常重要。
[0003] 生物傳感技術(shù)是利用生物材料（如酶類、抗體、蛋白、細胞、核酸等）將待測物質(zhì)濃 度的信息轉(zhuǎn)化為適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)、電學(xué)、熱力學(xué)或磁學(xué)信號的分析器件。而涉及到的檢測儀器 也十分廣泛，包括光學(xué)儀器（熒光光譜儀、紫外分光光度計、流式細胞儀等），電學(xué)儀器（電 化學(xué)工作站，極譜儀等），磁學(xué)信號檢測儀器（核磁共振儀、鐵磁共振儀及電子自選共振儀 等），而這些檢測儀器部分價格高昂，且不便于攜帶，這對SRB的實時快速檢測造成了一定 的障礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于保護一種通過肉眼觀察對硫酸鹽還原菌進行半定量檢測的方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 一種通過肉眼觀察對硫酸鹽還原菌進行半定量檢測的方法，利用基于溶菌酶-DNA 信號探針，磁性微球-捕獲探針對SRB特異性DNA片段進行檢測，通過觀察反應(yīng)前后溶液顏 色的變化，實現(xiàn)SRB的定性及半定量檢測。
[0007] 進一步的說，磁性微球-捕獲探針DNA1，溶菌酶-DNA2信號探針，及不同濃度SRB 特異性DNA片段按1: 1:1的質(zhì)量比混合，于37-40°C搖床孵育30-60分鐘；向孵育后得到 的溶液中加入溶菌酶顯色底物混合，于40-50°C，40mM磷酸鹽緩沖溶液（pH 5. 0)條件下反 應(yīng)10-15小時后加入硼酸鹽緩沖液pH 9. 3終止反應(yīng)，觀察對反應(yīng)后的溶液溶液顏色由無色 變?yōu)榈S色，由此對樣品中SRB的定性及半定量檢測。
[0008] 所述溶菌酶-DNA2信號探針為溶菌酶與DNA2信號探針雜交獲得；所述磁性微 球-捕獲探針DNAl為將親和素修飾的磁珠與生物素修飾的捕獲探針DNAl雜交獲得。
[0009] 所述磁性微球-捕獲探針DNAl與目標(biāo)檢測物DNA鏈部分片段結(jié)合形成雙鏈，目標(biāo) 檢測物DNA單鏈未結(jié)合部分與溶菌酶-DNA2信號探針結(jié)合。
[0010] 具體見圖4:
[0011] 例如 DNA I :biotin-AAAAAAAAATACGGATT(5' -3'），DNA2 :TCACTCCTAAAAAAAAA-ly sozyme (5' _3'）。
[0012] 所述基于溶菌酶-DNA2信號探針為取溶菌酶溶液與sulf〇-SMCC(4-(N-馬來酰亞 胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽）按8:1的質(zhì)量比混合，渦旋5-10分 鐘后與室溫孵育1-2個小時，反應(yīng)產(chǎn)物用bufferA超濾6-10次，得溶液A待用；
[0013] DNA活化，取巰基修飾的信號探針DNA2鏈與二硫蘇糖醇溶液按照1:10-1:100的 質(zhì)量比混合，并在室溫反應(yīng)2-3小時，反應(yīng)產(chǎn)物再用buffer A超濾6-10次，以出去多余的 DTT0
[0014] 將上述溶液A與活化的DNA按照1:1的體積比混合，并于室溫下孵育36-48小時 后再次用bufferA超濾6-10次，去除未結(jié)合的溶菌酶即得到基于溶菌酶-DNA信號探針，于 4°C保存以備使用。
[0015] 其中，二硫蘇糖醇溶液為二硫蘇糖醇溶解于磷酸鹽緩沖溶液（0. 1Μ，ρΗ8.0)中，濃 度為125mM ;
[0016] 溶菌酶溶液為溶菌酶溶解于緩沖液中，濃度為10mg/mL，緩沖液為0.1 M NaCl，0.1 M 磷酸鹽緩沖溶液，pH 5. 0 ;
[0017] buffer A 為 0.1 M NaCl, 0.1 M 磷酸鹽緩沖溶液，pH 7. 4。
[0018] 所述硫酸鹽還原菌為對SRB種群在25_40°C，隔絕空氣條件下進行富集，然后將 SRB進行清洗并利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA ;
[0019] 以利用SRB特異性引物對上述提取的細菌基因組DNA進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 擴增得到特異性DNA片段。
[0020] 所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用量為模板DNA，5. 0-6. 0 μ L ;超純水，10. 0-16. 0 μ L ; 聚合酶緩沖溶液，L 0-3. OyL;三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs)，0· 5-1. 0 μ L ;上游引 物，1. 0-2. 0 μ L ;下游引物，0. 5-2. 0 μ L ;耐熱DNA聚合酶，0. 2-0. 5 μ L ;或所述上下游引物 的用量相反；
[0021] 反應(yīng)條件為：復(fù)制起始（94°C，5-10min) ;35個循環(huán)變性（94°C，30-60s)，退火處 理（55°C，30-60s),延伸（94°C，30-60s);終止（72°C，7-10min)。
[0022] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0023] 該方法特異性強，不需要復(fù)雜的儀器，可在短時間內(nèi)對細菌進行半定量檢測，具有 很好的現(xiàn)場應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明實施例提供了基于溶菌酶-DNA信號探針對SRB進行顯色檢測的方 案圖。
[0025] 圖2溶菌酶催化底物進行顯色反應(yīng)的原理圖。
[0026] 圖3為本發(fā)明實施例提供了基于此方法對不同濃度SRB的DNA片段檢測的顯色 圖。（(a) I X 108,（b) : I X 107,（c) : I X 106,（d) : I X 105,（e) : I X 104,（f) : I X 103,（g) : I X IO2 CFU/mL SRB and Blank)。
[0027] 圖4為磁性微球-捕獲探針DNAl與目標(biāo)檢測物DNA鏈部分片段結(jié)合形成雙鏈，目 標(biāo)檢測物DNA單鏈未結(jié)合部分與溶菌酶-DNA2信號探針結(jié)合圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0029] 實施例1
[0030] 通過肉眼觀察對硫酸鹽還原菌（以食氨酸脫硫弧菌為例）進行肉眼半定量檢測的 方法
[0031] 1)提取食氨酸脫硫弧菌的特異性DNA片段
[0032] 取含有食氨酸脫硫弧菌的水溶液（4~6mL)加入到200mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3~4 天，將細菌進行離心分離（離心速度為8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間8-10分鐘）后，將 上層液吸出倒掉，取下層SRB細胞沉淀用細菌基因組DNA提取試劑盒處理。提取純化得 到的DNA依次與Taq DNA聚合酶及特異性引物混合進行PCR擴增反應(yīng)，用量如下：DNA模 板，5 μ L ;超純水，15. 8 μ L ;聚合酶緩沖溶液，2. 5 μ L ;dNTPs，0· 5 μ L ;引物1，0· 5 μ L ;弓丨 物2, 0. 5 μ L ;taq聚合酶，0. 2 μ L。熱循環(huán)溫度如下：預(yù)變性（94°C，5min) ;35循環(huán)，變性 (94°C，30s),退火（55°C，30s),伸展（94°C，30s);終止（72°C，7min)。
[0033] 2)磁性微球-寡聚核苷酸捕獲探針的構(gòu)建
[0034] 試驗中所用到的親和素修飾的磁性納米微球（1. 02 μ m, IOmg. ml/1)購買于挪威英 杰生命科技有限公，所需的人工合成寡聚核苷酸（DNA1，DNA2)由上海生工生物工程有限公 司合成。
[0035] 所述 DNA 序列為 DNA I :biotin-AAAAAAAAATACGGATT(5' -3'），DNA2 : TCACTCCTAAAAAAAAA-SH(5' -3' ）；
[0036] 首先，取IOuL