一種海洋褐潮生物群落結構的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及海洋微微型真核生物種類檢測的技術領域，特別涉及一種海洋褐潮生 物群落結構的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 褐潮國內(nèi)外相關研宄概況：褐潮是由微微型海藻引起的有害藻華，也可以理解為 微微型浮游生物的赤潮即為褐潮，與傳統(tǒng)赤潮相比其藻密度極高、耐低光、持續(xù)時間較長。 美國研宄機構將這種有害藻華命名為"褐潮"，以區(qū)別一般的"赤潮"，并為國際相關機構所 采納（Cosper EM，et al.，1990)。近幾年，中國渤海褐潮頻發(fā)，其主要致災種類為抑食金球 藻（Aureococcus anophagefferens)，屬于微微型藻類，該微藻對養(yǎng)殖業(yè)的危害極大，會使 貝類滯長甚至死亡。中國是繼美國和南非之后第三個出現(xiàn)褐潮的國家，對中國來說這是一 種新型的海洋生態(tài)災害，2009年至今已連續(xù)5年在渤海海域暴發(fā)由微微型藻抑食金球藻引 發(fā)的褐潮，大部分養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)扇貝滯長或者死亡現(xiàn)象。2010年褐潮給河北省造成直接經(jīng)濟 損失2. 05億元（中國海洋災害公報，2010)。2012年褐潮繼續(xù)向南部擴散，影響到山東沿海 地區(qū)，2013年7月5日在秦皇島-綏中附近海域發(fā)生的抑食金球藻褐潮持續(xù)時間較長，面積 達1450平方公里，占渤海赤潮發(fā)生面積的77% (2013年北海區(qū)海洋環(huán)境公報，2013)。
[0003] 傳統(tǒng)對浮游生物鑒定和檢測主要是依靠顯微鏡觀察形態(tài)學差異進行分類，然而在 實際應用中該方法存在著一定的局限性：首先，浮游生物，尤其是微型和微微型浮游生物， 其個體微小，不易觀察，實際操作困難，常規(guī)的鏡檢無法實現(xiàn)種類鑒定；其次，該方法依賴于 經(jīng)驗豐富的分類學研宄人員，需要有扎實的分類學功底，且費時費力，不適合大批量樣品的 研宄；最后，許多浮游生物形態(tài)學差異并不明顯，難以分辨容易造成人為誤差。
[0004] 美國早期對抑食金球藻的檢測主要使用免疫熒光法（Anderson DM，et al.，1993)，但是檢測周期較長、靈敏度較低。目前主要利用免疫流式細胞技術、定量聚合酶 鏈反應、色素組分分析和分子生物學等技術。
[0005] 免疫流式細胞技術（Stauffer BA，et al.，2008)利用共軛熒光素異硫氰酸酯 (FITC單克隆抗體）單克隆抗體標記抑食金球藻細胞表面進行檢測和計數(shù)。該方法可以在 很大的豐度范圍內(nèi)（IO 3-IO6Cells πιΓ1)對抑食金球藻的樣品進行快速準確的檢測和計數(shù)。 但是這種技術在細胞濃度低于5000cell S πιΓ1時靈敏度較低。
[0006] 定量聚合酶鏈反應（Popels LC, et al.，2003)，是基于抑食金球藻的一個獨特的 18SrDNA序列，開發(fā)一種TaqMan分子探針，在檢測系統(tǒng)中，實時定量PCR來檢測較低細胞水 平下抑食金球藻的濃度，靈敏度可以達到Icells πιΓ1。
[0007] 針對我國秦皇島海域發(fā)生的褐潮，孔凡洲（Kong FZ，et al.，2012)等對采集 到的浮游植物樣品分級過濾后，進行樣品色素組分分析，結果顯示其主要組分有19-丁 酰氧基巖藻黃素（?11(3(?3111：11；[11，？11(30)、娃甲藻黃素（0丨3(1；[11(?3111：11；[11，0丨3(1)和葉綠素 a(Chlorophylla, Chla)等，并且But-fuco色素的含量高，再根據(jù)藻華細胞數(shù)量高、細胞個 體小、對貝類攝食具有抑制效應等，確定藻華原因種為抑食金球藻。
[0008] 宏基因組學和高通量測序技術的出現(xiàn)，加速了微微型生物鑒定技術的步伐。該方 法主要是通過從環(huán)境樣品中提取全部生物的基因組DNA，構建宏基因組文庫，研宄環(huán)境樣品 中全部生物的遺傳組成及其群落功能。具體的是對環(huán)境中全部生物的總DNA進行克隆，采 用構建宏基因組文庫和篩選等手段獲得新的生理活性物質(zhì)；或者根據(jù)rDNA數(shù)據(jù)庫進行引 物設計，通過系統(tǒng)發(fā)生學分析得到該環(huán)境中生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)學信息。高通量 測序技術操作簡單、成本低廉，能快速高通量得到特定的DNA片段，較之前的分子生物學方 法能更全面展示生物群落的組成結構，極大地推動了浮游生物多樣性的研宄。
[0009] 然而目前有關褐潮的鑒定方法都是針對抑食金球藻這一種微微型生物，而褐潮 不僅僅是這一種，還有很多微微型生物都有可能發(fā)生褐潮，上述的定量聚合酶鏈反應和定 量聚合酶鏈反應方法對于鑒定已知種類是有用的，但檢測未知種類的褐潮卻有很大的局限 性，因為導致褐潮暴發(fā)的種類并非一種，及時了解自然水體中各種微微型生物的種類及比 例變化規(guī)律是預報褐潮的關鍵，其中褐潮生物群落結構的檢測顯得尤為重要。
[0010] 但目前沒有針對褐潮生物設計的引物序列，也沒有專門檢測褐潮生物群落結構的 方法。
[0011] 褐潮其實是從赤潮中分離出來的一個生態(tài)學概念，特指微微型真核生物暴發(fā)產(chǎn)生 的赤潮。傳統(tǒng)意義上的赤潮種類鑒定方法一般用顯微鏡直接觀察計數(shù)（粒徑一般都大于 3 ym)，根據(jù)鑒定種類及其數(shù)量即可研宄群落結構。由于褐潮種類為小于3 μπι的微微型生 物，利用顯微鏡鑒定等一般方法無法鑒定其種類，上述所有鑒定方法都是針對抑食金球藻 這一種微微型生物，而褐潮不僅僅是這一種，還有很多微微型生物都有可能發(fā)生褐潮，而利 用DNA測序技術檢測目標水域微微型生物18S rDNA，將得到的DNA片段序列輸入GenBank 進行檢索比對，查找對應種類拉丁文及中文名，進而可以鑒定褐潮生物的種類，目前尚未見 到針對褐潮生物設計的專有引物序列，也沒有將18S rDNA測序比對方法利用在褐潮生物群 落結構分析中，本發(fā)明是將這種方法進行擴展的同時，專門設計并驗證了針對褐潮生物設 計的引物序列，利用克隆測序出現(xiàn)的概率統(tǒng)計各種微微型生物的優(yōu)勢度、群落多樣性指數(shù)、 均勻度指數(shù)等參數(shù)。
[0012] 2010. 11. 24公開的發(fā)明專利《一種浮游植物群落結構的檢測方法》（【申請?zhí)枴?201010184810)是利用變性梯度凝膠電泳（DGGE)技術研宄浮游植物群落結構的檢測方法， 但該方法不能鑒定具體種類，只能根據(jù)電泳條帶統(tǒng)計生物多樣性等參數(shù)，卻無法了解優(yōu)勢 種類名稱及其優(yōu)勢度等。而本方法可以鑒定出目標水域中褐潮生物的具體種類及優(yōu)勢度， 根據(jù)具體優(yōu)勢度和多樣性指數(shù)可以初步判斷褐潮暴發(fā)的概率，一般當褐潮生物優(yōu)勢度大于 0. 2,并且多樣性指數(shù)低于3. 0或均勻度指數(shù)低于0. 8或物種豐度指數(shù)低于1. 0,基本可以判 定即將暴發(fā)該種褐潮，而針對具體優(yōu)勢種類可以開展針對性的防治措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明為了解決【背景技術】中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種新的海洋褐潮 生物群落結構的檢測方法。該方法首次設計并驗證了針對褐潮生物設計的引物序列（序列 如SEQ ID No: 1~2)，將18S rDNA高通量測序比對技術運用到褐潮生物的鑒定中，并運用 該技術對褐潮生物多樣性、優(yōu)勢度、均勻度進行分析，進而了解褐潮生物群落的優(yōu)勢生物， 建立了海洋褐潮生物群落結構的檢測方法。
[0014] 本發(fā)明的目的是通過如下技術方案來實現(xiàn)的：
[0015] 一種海洋褐潮生物群落結構的檢測方法，該方法包括利用SEQ ID Nol~2所述的 核苷酸序列分別作為上游引物和下游引物，以海水表層微微型生物樣品中分離得到的18S rDNA為模板，進行PCR擴增反應的步驟。
[0016] 本發(fā)明所述的海洋褐潮生物群落結構的檢測方法，其優(yōu)選的技術方案包括如下步 驟：
[0017] (1)利用SEQ ID Nol~2所述的核苷酸序列分別作為上游引物和下游引物，以海 水表層微微型生物樣品中分離得到的18S rDNA為模板，進行PCR擴增反應；
[0018] (2)對于PCR擴增產(chǎn)物，構建DNA文庫，對于構建的DNA文庫，使用Illumina MiSeq 測序平臺PE300測序方案進行測序；
[0019] ⑶測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過濾，得到OTUs (Operational Taxonomic Units)；
[0020] (4)將每個OUTs和物種注釋結合，對OTUs進行多樣性、均勻度、豐度、優(yōu)勢度指數(shù) 分析，同時對物種注釋在各個分類水平上進行海洋褐潮生物群落結構的統(tǒng)計分析。
[0021] 上述所述的海洋褐潮生物群落結構的檢測方法，其優(yōu)選的技術方案還包括如下步 驟：統(tǒng)計同期水樣中小型浮游植物種類和數(shù)量，根據(jù)測序樣品中該中小型浮游植物與其他 某種微微型真核生物種類間的序列數(shù)比例，測算出該種微微型真核生物的數(shù)量，參照《海洋 赤潮監(jiān)測技術規(guī)程》(HY/T 069-2005)中赤潮判別與生物量分級標準，微微型真核生物數(shù)量 >1〇7個/升（赤潮生物體長<1〇μπι)時即判為褐潮。其中所述統(tǒng)計同期水樣中小型浮游植 物種類和數(shù)量的方法為：取同期水樣，利用顯微鏡鑒定可鑒定計數(shù)的中小型浮游植物優(yōu)勢 種和數(shù)量。
[0022] 本發(fā)明還公開了本發(fā)明所述的檢測方法在在判斷即將或已經(jīng)暴發(fā)褐潮中的應用。 所述應用的具體方法為：根據(jù)海洋褐潮生物群落結構的統(tǒng)計分析，