一種檢測(cè)水體重金屬鉛的微生物學(xué)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)重金屬鉛的微生物學(xué)方法，具體涉及利用基因工程技術(shù)改造 的大腸埃希氏菌的構(gòu)建方法及其檢測(cè)水體環(huán)境中鉛方法的建立。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，很多含有鉛離子的污染物排放入江河湖泊中，污染土壤、水源 甚至是日常食用的糧食蔬菜。環(huán)境中的鉛主要來(lái)源于各種油漆、涂料、蓄電池、冶煉、五金、 機(jī)械、電鍍、化妝品、染發(fā)劑、釉彩碗碟、餐具、燃煤、膨化食品、自來(lái)水管等。研宄發(fā)現(xiàn)過(guò)量的 重金屬鉛對(duì)于所有的生命體都是有毒的，人體吸收過(guò)量的鉛后，可蓄積于人體重要器官肝、 腎、腦等。它是通過(guò)皮膚、消化道、呼吸道進(jìn)入體內(nèi)與多種器官親和，主要毒性效應(yīng)是貧血 癥、神經(jīng)機(jī)能失調(diào)和腎損傷，易受害的人群有兒童、老人、免疫低下人群。鉛對(duì)水生生物的安 全濃度為0. 16mg/L，用含鉛0. 1~4. 4mg/L的水灌溉水稻和小麥時(shí)，作物中鉛含量明顯增 加。人體內(nèi)正常的鉛含量應(yīng)該在〇. lmg/L，如果含量超標(biāo)，容易引起貧血，損害神經(jīng)系統(tǒng)。而 幼兒大腦受鉛的損害要比成人敏感得多，一旦血鉛含量超標(biāo)，應(yīng)該采取積極的排鉛毒措施。 兒童可服用排鉛口服液或借助其他產(chǎn)品進(jìn)行排鉛。
[0003] 目前監(jiān)測(cè)和檢測(cè)重金屬污染物主要有兩種方法：（1)物理化學(xué)分析法，如電感耦 合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS)等，其優(yōu)點(diǎn)是具備 高檢測(cè)靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，最 重要的一點(diǎn)是，傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法主要是對(duì)環(huán)境重金屬總量進(jìn)行測(cè)定，不能檢測(cè)重金屬 的生物可利用度；（2)微生物法，其優(yōu)勢(shì)是成本低廉、操作簡(jiǎn)易，可以直接反映污染物對(duì)生 物有機(jī)體的毒性及影響。除此，該方法常用的模式生物（如大腸埃希菌）繁殖及生存能力 強(qiáng)，易儲(chǔ)存和穩(wěn)定性高，以其為生物學(xué)感應(yīng)元件的微生物細(xì)胞傳感器可以極大簡(jiǎn)化傳感器 的制作過(guò)程，提高傳感器的檢測(cè)效率。
[0004] 但是，目前關(guān)于鉛在大腸埃希菌的具體耐受機(jī)制仍未見(jiàn)報(bào)道。然而根據(jù)Rensing C 等在文獻(xiàn) Pb (II)-translocating P-type ATPases. J Biol Chem. 1998Dec 4 ;273 (49): 32614-7,已發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌中負(fù)責(zé)編碼將鉛離子泵出的P-Type ATPase基因 zntA及其 調(diào)節(jié)蛋白基因 zntR ;但是zntA基因的啟動(dòng)子對(duì)鉛并非完全特異，它還能被鋅、鎘等離子非 特異性啟動(dòng)，故其啟動(dòng)子不能作為鉛檢測(cè)的特異性元件。據(jù)Hobman幾 ，Julian DJ等在 Cysteine coordination of Pb (II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter，PpbrA，from Cupriavidus metallidurans CH34. BMC Microbiol. 2012Jun 18 ;12 :109 和 Wei Wei 等在文獻(xiàn) Simple Whole-Cell Biodetection and Bioremediation of Heavy Metals Based on an Engineered Lead-Specific Operon. Environ Sci Technol.2014Mar 18 ;48(6) :3363-71 報(bào)道，貪銅菌屬中 PbrR 的啟動(dòng)子能被 鉛離子特異性啟動(dòng)表達(dá)下游基因，其對(duì)鉛離子的特異性已得到證實(shí)。
[0005] 2008 年，Aparna Chaudhari 等在文獻(xiàn) GFP expressing bacterial biosensor to measure lead contamination in aquatic environment. Research Communications. 2008Mar 25 ;(94) :800-805 中以大腸埃希菌 DH5a 為宿主菌， Cupriavidus metallidurans CH34中PbrR及其啟動(dòng)子PbrO/P為感應(yīng)元件，RFP作為報(bào)告 基因檢測(cè)地表水中的鉛。據(jù)該文獻(xiàn)報(bào)道，在LB培養(yǎng)基中，37°C經(jīng)過(guò)12h的培養(yǎng)，可檢測(cè)的鉛 離子濃度范圍是50-400 μ M ;鉛離子濃度為250 μ M，紅色熒光蛋白表達(dá)達(dá)到峰值，若鉛濃度 的再升高，紅色熒光蛋白熒光強(qiáng)度反而呈降低趨勢(shì)。
[0006] 構(gòu)建檢測(cè)鉛離子的以質(zhì)粒為載體、細(xì)菌為宿主的微生物法，存在以下問(wèn)題：⑴鉛 是一種常見(jiàn)的劇毒性環(huán)境污染重金屬，大部分細(xì)菌存在一套對(duì)有害重金屬泵出機(jī)制，對(duì)鉛 的沉淀物或者活性形式都有抗性，故其敏感性不高。Aparna中檢測(cè)的鉛離子濃度范圍是 50-400 μ Μ，遠(yuǎn)高于《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》GB3838-2002中II類水源對(duì)鉛的限值0.0 lmg/ L (0. 05 μ Μ)、III類水源限值0. 05mg/L (0. 25 μ Μ)。（2)研宄是基于質(zhì)粒作為熒光表達(dá)載體， 質(zhì)粒傳代過(guò)程可能出現(xiàn)拷貝數(shù)不一、丟失和高本底等缺陷致使檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。Aparna中 檢測(cè)鉛離子需在LB培養(yǎng)基中，37°C經(jīng)過(guò)12h的培養(yǎng)，周期過(guò)長(zhǎng)，時(shí)效性差，不利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)基因敲除和基因敲入技術(shù)構(gòu)建了一株大腸埃希菌生物 檢測(cè)菌株，進(jìn)而建立特異、穩(wěn)定檢測(cè)水體中重金屬鉛的方法。本發(fā)明的大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)WMC_008p，已于2014年9月29日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCC (地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微 生物研宄所，郵編100101)保藏，分類命名為大腸埃希氏菌（Escherichia coli)，保藏編號(hào) 為 CGMCC No. 9748。
[0008] 本發(fā)明E. coli WMC-008p CGMCC No. 9748生物菌株的構(gòu)建及應(yīng)用方法如下：
[0009] L構(gòu)建Δ zntA Δ zntR雙基因突變菌株
[0010] PCR擴(kuò)增含zntA和zntR上下游各50bp同源臂帶FRT位點(diǎn)的氯霉素抗性基因；將 擴(kuò)增的氯霉素抗性基因轉(zhuǎn)入含Red重組酶的菌株中；選擇氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體；FLP重組酶消 除氯霉素抗性基因；雙敲為在單敲除菌基礎(chǔ)上重復(fù)上述操作。
[0011] 2· E. coli WMC-008P CGMCC No. 9748 的構(gòu)建
[0012] 2. 1 融合基因 PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 的構(gòu)建
[0013] PCR分別擴(kuò)增人工合成的pbrR基因及其啟動(dòng)子PpbrA片段和pbrA基因 啟動(dòng)子和報(bào)告基因 DsRed-expresd片段，再通過(guò)交叉PCR技術(shù)將兩片段連接，形成 PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 融合報(bào)告基因。
[0014] 2. 2pK0V法將融合基因敲入AzntA AzntR雙基因突變菌株基因組
[0015] 將 pKOV-PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 轉(zhuǎn)化入 E. coli Δ zntA Δ zntR，pKOV 通過(guò)溫度及鹿糖的選擇，發(fā)生兩次同源重組，最后將PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 報(bào)告基因置換到zntA編碼基因位置，篩選獲得能夠特異、敏感和快速檢測(cè)鉛的大腸埃希菌 生物檢測(cè)菌株E. coli WMC-008p。
[0016] 3.建立本發(fā)明檢測(cè)水體中重金屬鉛的微生物學(xué)方法
[0017] 3.1培養(yǎng)基的配制：
[0018] lg/L胰蛋白胨、0· 5g/L酵母膏、lg/LNaCl，先加50ml MilliQ H20,振蕩至完全融解 后加 MilliQ H2O定容至80ml，高壓蒸汽滅菌，再加入10ml 400mM無(wú)菌MOPS緩沖液，混勾。
[0019] 3. 2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：
[0020] 把鉛單元素標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌MilliQ級(jí)的純水稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻取?br>[0021] 3. 2. 1從步驟2. 2獲得的甘油保存菌E. coli WMC-008p菌株中取5-10 μ 1接入步 驟3. 2. 1配制的新鮮5ml步驟3. 1配制的LB培養(yǎng)基，37°C，250rpm過(guò)夜培養(yǎng)；
[0022] 3. 2. 2取5-10 μ 1步驟3. 2. 1的E. coli WMC-008p過(guò)夜菌加入到LB培養(yǎng)基中， 37°C，250rpm，恒溫震蕩培養(yǎng)至OD6J直在0· 5-0. 6,取90-900 μ 1菌液分裝至96孔透明底黑 色微孔板或15Χ 150_規(guī)格的檢測(cè)管內(nèi)，同時(shí)在每個(gè)檢測(cè)孔或檢測(cè)管內(nèi)加入鉛離子使終濃 度分別為 〇· 05、0· 25、0· 50、1· 00、5· 00、7· 50、10· 00、12· 50、15· 00 以111〇1/1，37。〇、250卬111振 蕩孵育3-5h ;
[0023] 3. 2. 3將步驟3. 2. 2菌液4, OOOrpm，水平離心10min，棄上清，收獲的菌體重懸于 Iml 含 500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20 μ g/ml 氯霉素 、pH 8. ODB 緩沖液中，制成菌懸液；
[0024] 3. 2. 4將步驟3. 2. 3重懸菌液稀釋20倍，使E. coli WMC-008p全細(xì)胞懸浮液的 0D600 < 0. 2,混勻，分別測(cè)量其稀釋液熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為550nm，發(fā)射波長(zhǎng)為570nm，并測(cè) 其OD6J直；
[0025] 3. 2. 5數(shù)據(jù)處理：
[0026] 相對(duì)焚光值（Relative fluorescence unit，RFU) :RFUM = FM/0D6(i(iM，F(xiàn)M為與鉛單 元素標(biāo)準(zhǔn)品孵育E. coli WMC-008p菌懸液的熒光值，0D_M為與鉛單元素標(biāo)準(zhǔn)品孵育E. coli WMC-008p菌懸液的吸光度；RFUW = FW/0D_W，F(xiàn)W為與MilliQ級(jí)純水孵育E.coliWMC-008p 菌懸液的背景熒光值，OD6tltlW為與MilliQ級(jí)純水孵育E. coli WMC-008p菌懸液的吸光度；
[0027] 絕對(duì)焚光值（Absolutee fluorescence unit，AFU) :AFU = RFUM-RFUW，RFUM 為與 鉛單元素標(biāo)準(zhǔn)品孵育E. coli WMC-008p菌懸液的相對(duì)熒光值，RFUW為與MilliQ級(jí)純水孵 育E. coli WMC-008p菌懸液的相對(duì)背景熒光值。
[0028] 3. 3樣品檢測(cè)：
[0029] 用移液槍吸取E. coli WMC-008p CGMCC No. 9748過(guò)夜菌種子液加入到含有 終濃度為40mM MOPS緩沖成分的LB培養(yǎng)基中，使起始菌液OD6cJ直為0. 5-0. 6,分裝至 15 X 150_規(guī)格的無(wú)菌試管或康寧公司的96孔透明底黑色微孔板中，并在開(kāi)始接菌時(shí)即加 入1/1000-1/100體積不同濃度的Pb 2+溶液或待檢測(cè)環(huán)境水體樣品，另加等體積無(wú)菌Mi 11 iQ H2O作為陰性對(duì)照，每種濃度或樣品各做3個(gè)平行管或3個(gè)平行孔，37°C、250rpm振蕩孵育 3h，4,000rpm，水平離心10min，棄上清，收獲的菌體重懸于Iml DB中，然后將重懸