一種獲得轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法及其專用表達(dá)載體cpb-lar-gfp的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獲得轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法及其專用表達(dá)載體CPB-LAR-GFP。
【背景技術(shù)】
[0002]紅豆草(Onobrychis viciaefolia)為多年生草本植物，其地上部分粗蛋白質(zhì)及氨基酸含量豐富，含有一定數(shù)量的粗脂肪、多種維生素和礦物質(zhì)及其他化學(xué)物質(zhì)。紅豆草的種子產(chǎn)量和產(chǎn)草量高，結(jié)實(shí)性能較好，營養(yǎng)物質(zhì)全面而豐富，適口性優(yōu)良[陳寶書.中國草原，1983, (2):36-45.]。甘肅紅豆草(Onobrychis viciifolia cv.Gansu)是由普通紅豆草和高加索紅豆草自由雜交多次混合授粉的植株中單株選擇培育成的[陳寶書.紅豆草[M].蘭州:甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1992.]。選育目的是為我國干旱半干旱地區(qū)建立人工草地。其產(chǎn)草量接近或超過早熟、速生、抗病蟲害、高產(chǎn)、耐旱的紫花苜蓿品種。
[0003]可溶性蛋白含量高是苜蓿引起家畜臌脹病的主要原因[Howarth R E, etal.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1977，25 (I): 175-179.]?？s合單寧能夠與可溶性蛋白質(zhì)作用生成沉淀，避免引起臌脹病，然而紫花苜蓿葉片不含縮合單寧，只在種皮中少量存在。紅豆草在各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期葉片都能生產(chǎn)高濃度的縮合單寧[吳自立等.中國草地學(xué)報(bào)，1993，(5):25-27.] ο家畜飼用有大分子縮合單寧的紅豆草后不會(huì)患臌脹病，普遍認(rèn)為紅豆草是在遺傳資源創(chuàng)新途徑和飼草利用方式解決紫花苜蓿引起牲畜臌脹病發(fā)生的一種理想牧草[(I)McMahon L R, et al.Canadian Journal of PlantScience, 2000，80:469 - 485 ； (2)王玉萍等.草地學(xué)報(bào)，2000，8 (2): 126-131.]。在遺傳資源創(chuàng)新方向，從紅豆草中鑒定和分離縮合單寧合成酶基因，進(jìn)而利用基因工程技術(shù)將此基因?qū)氲杰俎Ｖ腥?，不失為一條改善苜蓿品質(zhì)和適口性的有效途徑。
[0004]縮合單寧合成途徑主要由公共苯丙烷途徑、核心類黃酮-花青素途徑、縮合單寧特異途徑完成，其中縮合單寧特異途徑最終決定其積累[Xie DY, et al.Science, 2003, 299(5605):396-399.]。縮合單寧特異生成途徑中有兩個(gè)關(guān)鍵酶分別是無色花青素還原酶(Leucoanthocyanidin reductase, LAR)和花青素還原酶(Anthocyanidinreductase, ANR)[(I)Xie DY,et al.Science, 2003, 299(5605):396-399 ；(2)Bogs J, etal.Plant Phys1logy, 2005，139(2):652-663.]。LAR 和 ANR 為單寧的生成提供了兩條不同的途徑和不同的前體物質(zhì)，然而前者的底物無色花青素又是經(jīng)花青素合成酶合成的花青素成為后者的底物，LAR在縮合單寧特異合成途徑中尤為重要[Yuan L, et al.Journalof Experiment Botany, 2012，63 (7): 2513-2524.]。一些研宄證實(shí) LAR 基因的表達(dá)與縮合單寧的累積正相關(guān)[Paolocci F，et al.Plant phys1logy, 2007，143 (I): 504-516.]。調(diào)控LAR基因的表達(dá)水平可以改變CT的積累。最早克隆的LAR基因來自豆科植物--金錢草(Desmodium uncinatum)，該基因編碼的蛋白可催化產(chǎn)生兒茶素，證明了 LAR 為單寧合成途徑中的限速酶[Tanner GJ, et al.Journal of B1logy Chemistry, 2003, 278:31647-31656.]。在感染葉銹病的雜交楊(P.trichocarpaXP.Deltoides)中，單寧合成途徑中關(guān)鍵酶基因LAR的轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，單寧含量顯著升高[Miranda M, etal.Molecular Plant-Microbe Interact1ns, 2007，20:816-831]。
[0005]抗廣譜除草劑草丁膦的bar (bialaphos resistance gene)基因具有較好的抗除草劑抗性[(I)孟靈真等.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2013，36 (4):265-268 ; (2) De Block M, etal.EMBO J, 1987,6(9):2513-2518 ;楊竹平等，生物技術(shù)與可持續(xù)農(nóng)業(yè)[Μ].上海:上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2000.]，既針對(duì)植物蟲害和大量使用除草劑給植物所帶來的負(fù)面影響，又可降低在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的人力和財(cái)力投入。bar基因也是常用的選擇標(biāo)記基因之一，將它與其它目的基因構(gòu)建到同一載體上，選擇培養(yǎng)基中加入一定的量就能篩選到含目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。它克服了抗生素篩選的局限性，細(xì)胞產(chǎn)生的假轉(zhuǎn)化體很少。
[0006]綠色焚光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)是一類存在于水母、水媳和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白，無需再加任何底物和輔助因子，在紫外或藍(lán)光激發(fā)下就能發(fā)射綠色熒光[楊明瑜等.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，27 (2):98-102.]。作為基因選擇，GFP在植物中主要有2個(gè)作用:監(jiān)測(cè)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的定位；并且能作為轉(zhuǎn)基因植物的分子標(biāo)記，代替 GUS 的作用[Jim H, Brad A.Technical Focus, 1995，8 (11): 10-11.]。GFP作為選擇標(biāo)記基因用來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因效率，將其連接到目的基因的啟動(dòng)子之后，通過測(cè)定GFP的熒光強(qiáng)度就可以對(duì)該基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。作為轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)告分子GFP，最大的優(yōu)點(diǎn)是，在不破環(huán)細(xì)胞和化學(xué)染色的情況下直接成像，檢測(cè)極為方便[Chalfie M, etal.Science, 1994, (263):802-805。]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了獲得轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法及其專用表達(dá)載體CPB-LAR-GFP。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:用于獲得一種轉(zhuǎn)基因苜蓿的植物表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體為具有綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記基因和抗除草劑bar基因的縮合單寧合成酶LAR基因植物表達(dá)載體CPB-LAR-GFP。
[0009]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述的用于獲得一種轉(zhuǎn)基因苜蓿的植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0010]I)紅豆草無色花青素還原酶LAR基因的克隆:
[0011 ] 選擇甘肅紅豆草葉片提取RNA并純化RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，PCR擴(kuò)增LAR基因；將回收的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)；挑選陽性克隆子搖菌，采用插入失活、滯后質(zhì)粒篩選、質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，限制酶切圖譜鑒定，測(cè)序；將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析；確定縮合單寧合成酶LAR基因，得到重組子為:pMD-LAR ；
[0012]2)綠色熒光蛋白GFP基因的亞克隆:
[0013]挑取pBI121-Lyz_GFP菌株的單菌落(pBI121_Lyz_GFP菌株的獲得，可參見《pBI121-Lyz-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建及其在和田苜蓿愈傷組織中的轉(zhuǎn)化》，柴燕文等，《農(nóng)業(yè)技術(shù)生物學(xué)報(bào)》2008年05期)，搖菌、提取質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增GFP基因，將回收的GFP目的片段與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)；挑選陽性克隆子搖菌，采用插入失活、滯后質(zhì)粒篩選、質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，限制酶切圖譜鑒定，測(cè)序，得到重組子為:pMD-GFP ；
[0014]3) CPB-LAR-GFP植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定:
[0015]對(duì)pMD-GFP進(jìn)行BamH I和Sma I雙酶切，切下GFP基因；對(duì)pMD_LAR進(jìn)行Sma I和Sac I雙酶切，切下LAR基因；對(duì)載體CPB進(jìn)行BamH I和Sac I雙酶切，通過T4DNA連接酶將具有粘性末端的載體和基因，16°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5 α，挑選陽性克隆子搖菌，采用插入失活、滯后質(zhì)粒篩選、質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，限制酶切圖譜鑒定，得到CPB-LAR-GFP植物表達(dá)載體。
[0016]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了獲得一種轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法，是將上述的CPB-LAR-GFP植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入苜蓿中，得到具有抗除草劑性質(zhì)和縮合單寧含量高的轉(zhuǎn)基因苜蓿。
[0017]進(jìn)一步的，上述的獲得一種轉(zhuǎn)基因苜蓿的方法，是采用凍融法將植物表達(dá)載體CPB-