用于輔助評(píng)價(jià)待測(cè)者食管癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)性的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于輔助評(píng)價(jià)待測(cè)者食管癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)性的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的2%。全世界每年約 有20萬(wàn)人死于食管癌，我國(guó)是食管癌高發(fā)區(qū)，因食管癌死亡者僅次于胃癌居第二位，發(fā)病 年齡多在40歲以上，男性多于女性，但近年來40歲以下發(fā)病者有增長(zhǎng)趨勢(shì)。食管癌的發(fā)生 與亞硝胺慢性刺激、炎癥與創(chuàng)傷，遺傳因素以及飲水、糧食和蔬菜中的微量元素含量有關(guān)。
[0003] 基因測(cè)序是一種新型基因檢測(cè)技術(shù)，能夠從血液或唾液中分析測(cè)定基因全序列， 預(yù)測(cè)罹患多種疾病的可能性，從而實(shí)現(xiàn)提前預(yù)防和治療。
[0004] 中國(guó)專利申請(qǐng)200810039260. 4提供了一種檢測(cè)食管癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試 劑盒包括檢測(cè)細(xì)胞色素 P4501A1基因（CYPlAl)、細(xì)胞色素 P4502E1基因（CYP2E1)、谷胱甘 肽硫轉(zhuǎn)移酶Ml基因（GSTMl)、5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因（MTHFR)、還原型輔酶I醌 類氧化還原酶基因（NQOl)、腫瘤蛋白53基因（P53)、X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因 I(XRCCl)、著 色性干皮病互補(bǔ)組A基因（XPA)上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及特異性 熒光探針對(duì)、熒光定量PCR常規(guī)組件、PCR反應(yīng)組件等。
[0005] 上述技術(shù)方案的缺陷在于，相關(guān)基因的獨(dú)立性差，存在連鎖不平衡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于輔助評(píng)價(jià)待測(cè)者食管 癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)性的試劑盒，以及其檢測(cè)結(jié)果的評(píng)估方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種用于輔助評(píng)價(jià)待測(cè)者食管癌遺傳風(fēng)險(xiǎn) 性的試劑盒，該試劑盒包括：
[0008] 針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs738722的引物，以及
[0009] 針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs100 58728的引物。
[0010] 本發(fā)明的試劑盒通過檢測(cè)與食管癌發(fā)生密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，來評(píng) 估受試者食管癌患病風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并最終根據(jù)每個(gè)受試者的基因檢測(cè)結(jié)果，從基因?qū)用嬷笇?dǎo) 受試者有針對(duì)性地預(yù)防和早期診斷食管癌，降低食管癌的發(fā)病率，進(jìn)行早期治療，提高生存 率。
[0011] 本發(fā)明所選取的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在亞洲人群中具有顯著相關(guān)性，并且彼此獨(dú) 立，不存在連鎖不平衡，因此本發(fā)明的位點(diǎn)選擇具有代表性、獨(dú)立性和風(fēng)險(xiǎn)值可積累性。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn) rs9288520 的引物。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs738722的引物包括：
[0014] rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG(SEQ ID ΝΟ:1);
[0015] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG(SEQ ID NO:2)。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs100 58728的引物包 括：
[0017] rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT(SEQ ID NO:3);
[0018] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT(SEQ ID N0:4)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs9288520的引物包 括：
[0020] rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC(SEQ ID NO:5);
[0021] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC(SEQ ID NO:6)。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rsl7761864的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rsl7761864的引物包括，例如， rsl7761864 上游引物：AGGCATGTGCTACTGTGT(SEQ ID NO:7) ;rsl7761864 下游引物： CACCCAATATTTTCTTTAGACT(SEQ ID NO:8)〇
[0023] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs2847281的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2847281的引物包括，例如， rs2847281 上游引物：TGGTCCTTGCCTCCTTGT(SEQ ID NO:9) ;rs2847281 下游引物： TCATTGGGTATTTCCTCTACAC(SEQ ID N0:10)。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs8030672的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs8030672的引物包括，例如， rs8030672 上游引物：CGTCAAAGTGCAGAAATCAG(SEQ ID NO:ll) ;rs8030672 下游引物： CAGCTCAGAACTCAGAGACTC(SEQ ID NO:12)。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rsl0484761的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rsl0484761的引物包括，例如， rsl0484761 上游引物：TGCAACGCTGTTAGAAGT(SEQ ID NO:13) ;rsl0484761 下游引物： TCTTGTCTCTATTCACTATTCC(SEQ ID N0:14)。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs2239612的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2239612的引物包括，例如， rs2239612 上游引物：TGGTCACACAGCGTCATCAT(SEQ ID NO:15) ;rs2239612 下游引物： CATTGGCTGATTGATGGAGT(SEQ ID NO:16)。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs6503659的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs6503659的引物包括，例如， rs6503659 上游引物：GCTCACTGGGTTTGCTTC(SEQ ID NO:17) ;rs6503659 下游引物： CAAGGCAGGCTCAGATACTA(SEQ ID NO:18)。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs100 52657的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs100 52657的引物包括，例如， rs 10052657 上游引物：AAGGCTCTTAATGGGAAACC(SEQ ID NO: 19) ;rs 10052657 下游引物： ATGCATCGCACATTAATACC(SEQ ID N0:20)。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs2274223的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2274223的引物包括，例如， rs2274223 上游引物：GGTGACTTTGATCCCTTTTG(SEQ ID N0:21) ;rs2274223 下游引物： CATCCATCACCTAGCTACAAC(SEQ ID N0:22)。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs4785204的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4785204的引物包括，例如， rs4785204 上游引物：TTCAGTAGTACCTGGATTGA(SEQ ID NO:23) ;rs4785204 下游引物： GATGAAATAAGAGCTTCTACC(SEQ ID NO:24)。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs2014300的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2014300的引物包括，例如， rs2014300 上游引物：TCACCATGAAGACGGCAA(SEQ ID NO:25) ;rs2014300 下游引物： CATTCATAACAGTCCCTGTCTG(SEQ ID NO:26)。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rs2074356的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs2074356的引物包括，例如， rs2074356 上游引物：TCAGGAGAGACTCATCTAATG(SEQ ID NO:27) ;rs2074356 下游引物： ATCAGGGAACAGTGAGAGAC(SEQ ID NO:28)。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒進(jìn)一步包括針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位 點(diǎn)rsl229984的引物。該針對(duì)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rsl229984的引物包括，例如， rsl229984 上游引物：GGAATAGTAGGGATTAGTAGC(SEQ ID NO:29) ;rsl229984 下游引物： AAATCCTGGATGGTGAAC(SEQ ID N0:30)。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明另一【具體實(shí)施方式】，試劑盒的組分和含量包括：PCR反應(yīng)體系、PCR產(chǎn) 物純化體系、測(cè)序反應(yīng)體系。其中，前述引物屬于PCR反應(yīng)體系；PCR產(chǎn)物純化體系用于PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化；測(cè)序反應(yīng)體系用于DNA測(cè)序，進(jìn)而確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。例 如，PCR反應(yīng)體系包括10XPCR反應(yīng)緩沖液2. 5ul ;25mM dNTP混合液0. 2ul ;5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul ;20uM引物對(duì)，每條引物0. 25ul ;ddH20 19. 175ul。例如，PCR產(chǎn)物純化體系 包括：lU/ul SAP 酶 0· 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0· 375ul ;ddH20 3. 875ul。例如，測(cè)序反應(yīng)體系 包括：25% BigDye mix Iul ;3. 2uM DNA 測(cè)序引物 Iul ;125mM EDTA 溶液 Iul ;100% 乙醇溶 液15ul ;70%乙醇溶液30ul ;HIDI溶液8ul ;ddH202ul。值得注意的是，這里的DNA測(cè)序引 物可為現(xiàn)有技術(shù)已公開或披露的多種引物，在此不再贅述。
[0035] 另一方面，本發(fā)明提供了上述試劑盒的檢測(cè)結(jié)果的評(píng)估方法，其包括如下步驟：
[0036] A、將單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs738722、rs100 58728、rs9288520的不同基因型進(jìn)行 風(fēng)險(xiǎn)度賦值；
[0037] B、提取受檢者的DNA ;
[0038] C、使用以下引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
[0039] (I) rs738722 上游引物：CCTGAAACTAAACAAAAAAGGAAG ;
[0040] rs738722 下游引物：TGAAGTGGAAGGCAATAGAAG ;
[0041] (2)rs100 58728 上游引物：CATGTCTTGATATTTACCAAT ;
[0042] rs100 58728 下游引物：TGTATTATGTGTGGGACTCT ;
[0043] (3) rs9288520 上游引物：TTCGAGCTCTGAGTTCTTC ;
[0044] rs9288520 下游引物：TGCTCTTGCTGTAAGGTATC ;
[0045] D、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化；
[0046] E、DNA測(cè)序，確定單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs738722、rs100 58728、rs9288520的基因 型；
[0047] F、根據(jù)步驟A，確定