一種乳液pcr體系的制作方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種乳液PCR體系?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]乳液PCR(emulsionPCR)技術(shù)利用油包水結(jié)構(gòu)作為PCR反應(yīng)的微反應(yīng)器，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。乳液PCR最大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其關(guān)鍵技術(shù)是"注水到油"，基本過(guò)程是在PCR反應(yīng)前，將包含PCR所有的反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的油相表面，水溶液瞬間形成數(shù)以萬(wàn)計(jì)個(gè)被油相包裹的小液滴。這些小液滴就形成了PCR反映空間。由于水相中的P2引物和磁珠表面的Pl引物所介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，這個(gè)DNA模板的拷貝數(shù)量呈指數(shù)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)結(jié)束后，Pl磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同源DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，每個(gè)片段擴(kuò)增后產(chǎn)生幾百萬(wàn)個(gè)相同的拷貝，這些拷貝也結(jié)合在磁珠上。整個(gè)文庫(kù)的DNA。[0003]基于油包水的乳液系統(tǒng)提出一個(gè)擴(kuò)增復(fù)雜DNA混合物的方案，目標(biāo)分子被分割在微小的乳液液滴中并進(jìn)行分別擴(kuò)增，這種方法能夠在低濃度目標(biāo)DNA和大量的PCR循環(huán)條件下進(jìn)行。每個(gè)獨(dú)立的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒(méi)有其他的競(jìng)爭(zhēng)性或污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合在磁珠上?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是一種乳液PCR體系，所述PCR體系為乳液體系，包括水相、油相、表面活性劑與助表面活性劑。[0005]所述水相與油相的體積比為4:9-4:7。[0006]所述油相為DC5225C、PGFE(三聚甘油單硬脂酸酯)、DC749和礦物油中的1種或幾種，優(yōu)選為PGFE和DC749。[0007]所述體系中還包括保護(hù)劑，保護(hù)劑為BSA(牛血清蛋白）、人血清蛋白和聚乙二醇中的一種或幾種，優(yōu)選為BSA。[0008]所述BSA為經(jīng)過(guò)乙?；?、分子生物學(xué)級(jí)別的BSA。[0009]所述表面活性劑為span80、TritonX-lOO、tween80、tween60和tween20中的一種或幾種，優(yōu)選為span80、TritonX-100、tween80和tween60;在微乳液制備時(shí)，span80、tween80、tween60和tween20溶于油相，TritonX-100溶于水相。[0010]所述表面活性劑占體系的體積比為span802.5-5%，TritonX-1000·4-1.0%，tween800·2_0·5%，tween600·3_0·5%、tween200·2_0·8%;優(yōu)選為span802·5_3·5%，TritonX-1000.7-0·9%，tween800.3-0·4%，tween600.4-0·5%和tween200.4-0·7%〇toon]所述助表面活性劑為聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一種或幾種。[0012]所述水相中含有emPCR助劑；還含有81^€61"、引物、0嫩聚合酶、(1階1\]\%2+和水。[0013]所述水相中還包括焦磷酸酶，焦磷酸酶為熱穩(wěn)定焦磷酸酶（thermostablepyrophosphatase)〇[0014]所述emPCR助劑包括betaine(甜菜堿)、D-(+)trehalose(右旋海藻糖)、L-carnitine(左旋肉堿)、NP-40(乙基苯基聚乙二醇）、DTT(二硫蘇糖醇）和DMSO(二甲基亞諷）中的一種或幾種，優(yōu)選為betaine0·4-1.0M、D_(+)trehalose0·2-0.5M、L_carnitine0·1-0·4Μ、ΝΡ-400.2-0.6%、DTTl-2.5mM和DMSO1-2.5%(其中的百分含量為體積比）。[0015]所述水為nuclease-freewater(NFW)〇[0016]所有試劑采用分析純及其以上純度。[0017]本發(fā)明提供的emPCR體系優(yōu)化了核酸測(cè)序的體系環(huán)境，試劑的選取增加了微乳液體系的穩(wěn)定性，油水比例適宜，使測(cè)序結(jié)果更精確、均一和穩(wěn)定。該方案制備的微乳液體系熱穩(wěn)定性好，微球在液滴中分布均勾，單克隆比例高。本發(fā)明選取的表面活性劑和助劑的增溶度大，成核效率高，非常有利于提高測(cè)序的反應(yīng)速率?！揪唧w實(shí)施方式】[0018]實(shí)施例1(1)油相，混合PGFE和DC749共400μL。[0019](2)水相，【主權(quán)項(xiàng)】1.一種乳液PCR體系，其特征在于，所述PCR體系為乳液體系，包括水相、油相、表面活性劑與助表面活性劑。2.如權(quán)利要求1所述的乳液PCR體系，其特征在于，所述水相與油相的體積比為4:9-4:7〇3.如權(quán)利要求1所述的乳液PCR體系，其特征在于，所述油相為DC5225C、PGFE、DC749和礦物油中的1種或幾種，優(yōu)選為PGFE和DC749。4.如權(quán)利要求1所述的乳液PCR體系，其特征在于，所述體系中還包括保護(hù)劑。5.如權(quán)利要求1所述的乳液PCR體系，其特征在于，所述表面活性劑為span80、TritonX-lOO、tween80、tween60和tween20中的一種或幾種，優(yōu)選為span80、TritonX-100、tween80和tween60;在微乳液制備時(shí)，span80、tween80、tween60和tween20溶于油相，TritonX-IOO溶于水相。6.如權(quán)利要求1所述的乳液PCR體系，其特征在于，所述表面活性劑占體系的比例為span802.5-5%,TritonX-IOO0.4-1.0%,tween800.2-0.5%,tween600.3-0.5%>tween200?2-0.8%;優(yōu)選為span802.5-3.5%，TritonX-1000?7-0.9%，tween800?3-0.4%，tween600?4-0.5%和tween200?4-0.7%〇7.如權(quán)利要求1所述的乳液PCR體系，其特征在于，所述助表面活性劑為聚乙二醇、山梨醇和丙三醇中的一種或幾種。8.如權(quán)利要求1所述的乳液PCR體系，其特征在于，所述水相中含有emPCR助劑。9.如權(quán)利要求8所述的乳液PCR體系，其特征在于，所述emPCR助劑包括betaine、D-(+)trehalose、L_carnitine、NP-40、DTT和DMSO中的一種或幾種，優(yōu)選為betaine、D_(+)trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT和DMSO010.如權(quán)利要求1所述的乳液PCR體系，其特征在于，體系中所有試劑采用分析純及其以上純度。【專利摘要】本發(fā)明屬于生物
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，具體涉及一種乳液PCR體系。該乳液PCR體系由水相、油相、表面活性劑與助表面活性劑組成。本發(fā)明提供的emPCR體系優(yōu)化了核酸測(cè)序的體系環(huán)境，試劑的選取增加了乳液體系的穩(wěn)定性，使測(cè)序結(jié)果更精確、均一和穩(wěn)定。該方案制備的乳液體系熱穩(wěn)定性好，微球在液滴中分布均勻，單克隆比例高?！綢PC分類】C12N15-10【公開號(hào)】CN104862304【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510299698【發(fā)明人】蔡亦梅,高靜,徐瀟,吳超,張睿,王者馥,王緒敏,殷金龍,任魯風(fēng)【申請(qǐng)人】北京中科紫鑫科技有限責(zé)任公司【公開日】2015年8月26日【申請(qǐng)日】2015年6月4日