一種利用無(wú)色桿菌降解鄰苯二甲酸二異辛酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種利用無(wú)色桿菌降解鄰苯二甲酸二異辛酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鄰苯二甲酸酯，又稱酞酸酯，縮寫PAEs，是鄰苯二甲酸形成的酯的統(tǒng)稱。其中，鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)是一種典型的鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)，在人們?nèi)粘Ｉ钪杏猛痉浅V泛，特別是作為塑料添加劑，在重量上可達(dá)20?50%。由于塑料制品中DEHP極易轉(zhuǎn)移進(jìn)入環(huán)境，從而廣泛存在于大氣、水體、土壤以及生物體中。DEHP在鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)中毒性最強(qiáng)，可以通過(guò)各種途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，嚴(yán)重干擾其內(nèi)分泌、生殖及神經(jīng)系統(tǒng)，并具有極強(qiáng)的致畸性、致突變性、致癌性。目前，DEHP已成為全球最普遍的污染物之一，并被美國(guó)國(guó)家環(huán)保局和中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站列為優(yōu)先控制污染物。
[0003]自然環(huán)境中DEHP的水解、光解和揮發(fā)速率非常緩慢，生物降解成為其從環(huán)境中消失的主要途徑。但由于DEHP的側(cè)鏈較長(zhǎng)，盡管土壤中存在許多能降解DEHP的菌種，其自然降解能力也極弱，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足DEHP環(huán)境污染治理的需要。因此，對(duì)DEHP的處理有待于尋求高效降解菌。
[0004]目前對(duì)于微生物降解DEHP，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開(kāi)展了大量研宄。例如，Kim等篩選分離出的一株尖孢鐮刀菌，及Chao和Cheng等分離出的一株紅球菌均對(duì)DEHP均具有良好的降解效果。但已報(bào)道的菌株對(duì)DEHP的降解速率還不能滿足實(shí)際污染控制的要求，且有關(guān)能降解DEHP的無(wú)色桿菌種質(zhì)資源鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種降解鄰苯二甲酸二異辛酯的方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下方案予以實(shí)現(xiàn)的:
一株無(wú)色桿菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H，所述菌株于2015年I月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC M 2015058，保藏地址為:湖北省武漢市武漢大學(xué)，菌株分類命名為Achromobactersp.MT-H。
[0007]本發(fā)明所述無(wú)色桿菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H來(lái)源于廣州市大坦沙城市污水處理廠的回流污泥，經(jīng)人工富集培養(yǎng)、分離純化得到。該菌株對(duì)DEHP具有很高的降解效率，且在較寬的pH和溫度范圍內(nèi)均能較好地降解DEHP，證明MT-H菌株可以作為優(yōu)良的DEHP降解菌應(yīng)用于DEHP污染的生物處理方面。
[0008]無(wú)色桿菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)七天的菌落為圓形，微凸起，淡黃色，濕潤(rùn)，半透明，邊緣整齊，光滑。掃描電鏡下多為球狀或橢球狀，直徑為0.5—1 μ m0
[0009]無(wú)色桿菌{Achromobactersp.)菌株 MT-H 的 16S rDNA 基因序列如 SEQ ID NO:1所示，通過(guò)NCBI官方網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的BLAST程序與其他已登錄細(xì)菌菌株16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明該菌株與Achromobactersp.相似性最高，同源率達(dá)99%。
[0010]一種降解DEHP的方法，將無(wú)色桿菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H接種到DEHP污染介質(zhì)中，在pH5~10、溫度為20~40°C條件下降解4天以上；所述菌株于2015年I月22日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC M 2015058。
[0011 ] MT-H菌株在降解DEHP時(shí)的優(yōu)選條件為在pH6~9、溫度為30~40 V條件下降解4天以上。
[0012]優(yōu)選地，MT-H菌株在降解DEHP時(shí)，將菌株MT-H制備成菌懸液接種到DEHP污染介質(zhì)中。
[0013]更優(yōu)選地，所述菌懸液的制備方法為將純化后的菌株MT-H接入常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體，用PBS洗菌后重懸調(diào)節(jié)0D_ ? = 0.8-1.2作為菌懸液。
[0014]更優(yōu)選地，所述菌懸液的OD6qq M = 1.0o
[0015]優(yōu)選地，所述常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基、NA液體培養(yǎng)基或PDA液體培養(yǎng)基。
[0016]優(yōu)選地，在制備菌懸液時(shí)，要用PBS洗菌2~4次。
[0017]將OD6tltl M = 1.0的MT-H的菌懸液用于降解DEHP時(shí)，菌懸液的用量根據(jù)污染介質(zhì)中DEHP的濃度來(lái)確定，優(yōu)選地，當(dāng)DEHP的濃度為50~600mg L—1時(shí)，10mL的污染介質(zhì)中加入l~5mL的0D_ M = 1.0的MT-H的菌懸液。
[0018]如上所述方法在修復(fù)DEHP污染介質(zhì)中的應(yīng)用。
[0019]優(yōu)選地，所述介質(zhì)為土壤或水。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明公開(kāi)了一種高效降解DEHP的方法，本發(fā)明將新分離得到無(wú)色桿菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H用于降解DEHP，并優(yōu)化了菌株的降解溫度和pH值，因?yàn)樵摼陮?duì)DEHP具有很高的降解效率，且在較寬的pH和溫度范圍內(nèi)均能較好地降解DEHP，因此，以該菌株建立的降解方法可以用于不同復(fù)雜環(huán)境中DEHP污染的生物修復(fù)。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為MT-H菌在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的生長(zhǎng)形態(tài)特征。
[0022]圖2為MT-H菌的掃描電鏡照片。
[0023]圖3為MT-H菌的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0024]圖4為MT-H菌對(duì)不同濃度的DEHP的降解效果。
[0025]圖5為MT-H菌在不同條件下(pH、溫度和轉(zhuǎn)速)對(duì)DEHP的降解效果。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明。本發(fā)明以下實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明主要闡述所述菌株以及基于所述菌株的應(yīng)用思想，實(shí)施方式中簡(jiǎn)單參數(shù)的替換不能一一在實(shí)施例中贅述，但并不因此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，其他任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，應(yīng)被視為等效的置換方式，包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0027]實(shí)施例中所述培養(yǎng)基配方如下:
無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液(MSM，g/L):K2HP04:5.8，KH 2P04:4.5，(NH 4)2S04:2.0，MgCl 2:0.16，CaCl 2:0.02，Na2MoO4.2H20:0.0024，F(xiàn)eCl3:0.0018，MnCl 2.2H20:0.0015。最終 pH 為 7.5。
[0028]牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB):酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，加超純水至1L，調(diào)節(jié)pH= 7.0 ;121°C滅菌20min。固體平板則添加1.5% (w/v)瓊脂粉。
[0029]實(shí)施例1菌株的分離與鑒定
采集廣州市大坦沙城市污水處理廠的回流污泥，稱取5 g活性污泥樣品于含有50 mL無(wú)菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm培養(yǎng)3天后取5 mL污泥懸液加入到100 mL含有DEHP (50 mg I/1)的上述MSM培養(yǎng)基中。經(jīng)30°C，140 rpm培養(yǎng)7天后，每次按取ImL的接種量連續(xù)富集、轉(zhuǎn)接10次，并相應(yīng)提高培養(yǎng)基中DEHP的含量至1000 mg L'然后將轉(zhuǎn)接10次的培養(yǎng)液稀釋103~105倍涂布于LB固體平板上，30°C倒置培養(yǎng)1~3天。待平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細(xì)菌，編號(hào)MT-H。然后將菌株接種于LB固體平板上30°C倒置培養(yǎng)7天，觀察其菌落形態(tài)。LB平板培養(yǎng)7天的菌落成圓形，微凸起，淡黃色，濕潤(rùn)，半透明，邊緣整齊，光滑(見(jiàn)圖1)。
[0030]掃描電鏡樣品制備與觀察:將純化后的菌株MT-H接入含有10 mL的LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜活化。吸取800 μ L菌液經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入I mL的2.5%戊二醛充分混勻，4°C靜置過(guò)夜。然后再次經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。隨后將菌體分別在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個(gè)梯度約浸泡15 min，然后8000