一種全細(xì)胞催化合成香草醛的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及香料領(lǐng)域，尤其涉及一種全細(xì)胞催化合成香草醛的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 香草醛（4-羥基3-甲氧基-苯甲醛)，俗稱(chēng)香蘭素、香草素、香蘭醛、香茅醛，是全 球最重要的香味物質(zhì)之一，具有濃郁的香子蘭花的氣味，素有"香料皇后"的美譽(yù)。其以游 離態(tài)和葡萄糖苷的形式廣泛存在于自然植物中，如香莢蘭豆、丁香油、天門(mén)冬、甜菜根、安息 香、蘇合香膏，較集中存在于香莢蘭的豆莢中(含量1. 5%_3%)。由于其特殊的香味及結(jié)構(gòu)特 征，被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，其中約60%用作食品、糖果、飲料中的香味物質(zhì)，約33%用作香 料和化妝品中的成分，約7%作為藥物中間體。
[0003] 香草醛每年的需求量在10, 000 t以上。目前市場(chǎng)上的香草醛絕大部分來(lái)自化學(xué) 合成，主要以愈創(chuàng)木酚和木質(zhì)素為合成原料，價(jià)格較低，每公斤約13美元。由香莢蘭中提取 的天然香草醛年產(chǎn)量?jī)H20 t，約占0. 2%的份額，價(jià)格昂貴，每公斤達(dá)4, 000美元。而用微生 物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的香草醛與植物提取的天然香草醛等同，被稱(chēng)為生物香草醛，符合EU和FDA 對(duì)天然香精的食用安全要求，但目前其年產(chǎn)量只有數(shù)噸，每公斤價(jià)格600~1000美元。
[0004] 隨著人們對(duì)健康安全的愈發(fā)重視，天然香草醛的需求不斷上升。微生物轉(zhuǎn)化法生 產(chǎn)香草醛在生產(chǎn)周期上和規(guī)模擴(kuò)大方面要優(yōu)于植物提取法，生產(chǎn)成本低于植物提取法，而 產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)于化學(xué)合成的香草醛，且無(wú)污染、對(duì)環(huán)境友好，是一種極有前景的制備方法，因 此越來(lái)越受到青睞。
[0005] 但是現(xiàn)有技術(shù)中，微生物轉(zhuǎn)化法制備香草醛仍然存在許多不足： 1. 容易生成副產(chǎn)物，產(chǎn)率低。因?yàn)槲⑸锉旧硎且粋€(gè)多酶體系，把它直接加入到反應(yīng) 中，微生物里的某些酶可能與目的酶競(jìng)爭(zhēng)相同的底物，導(dǎo)致底物利用率下降、副產(chǎn)物的生 成、產(chǎn)率低。再者，香草醛生成后也會(huì)被微生物中的酶進(jìn)一步代謝為香草酸或其他代謝產(chǎn) 物； 2. 底物在水溶液中的溶解度很低，并且底物會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)或酶的活性有抑制作 用； 3. 產(chǎn)物香草醛及其他副產(chǎn)物也會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)或酶的活性有抑制作用。
[0006] 因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種全細(xì)胞催化合成香草醛的 方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中香草醛微生物轉(zhuǎn)化合成產(chǎn)量低、容易生成副產(chǎn)物等問(wèn)題。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其中，包括步驟： S1、將保存的菌株CGMCC1347接入種子培養(yǎng)基中活化，32~40°C、100~300rpm振蕩反應(yīng) 6~36h得到種子液； 52、 反應(yīng)結(jié)束后，取2ml種子液接入30~70ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，32~40°C、100~300rpm振蕩 反應(yīng)12~36h得到菌液； 53、 取IOml菌液3000~6000rpm離心5~20min，棄上清，獲得濕菌體； 54、 往濕菌體中加入5~15ml緩沖溶液，重懸菌體并轉(zhuǎn)移至裝有0. 1~0. 5g異丁香酷的錐 形瓶中，蓋上橡膠塞，25~35°C、100~300rpm振蕩反應(yīng)48~96h ; 55、 反應(yīng)結(jié)束后，加入5~15ml95%乙醇以終止反應(yīng)，沉淀蛋白并溶解底物和產(chǎn)物，充分 混勾后 5000~8000rpm 離心 IOmin ; 56、 取離心后的上清液，用乙醇稀釋?zhuān)^(guò)濾后得到香草醛。
[0009] 所述的全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其中，所述步驟S4中，錐形瓶中還添加有 50~15〇μ1離子溶劑。
[0010] 所述的全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其中，所述離子溶劑為離子液體或深度低 共熔溶劑。
[0011] 所述的全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其中，所述離子液體為咪唑型離子液體、銨 鹽離子液體或磷鹽離子液體。
[0012] 所述的全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其中，所述咪唑型離子液體為[麗Im] [MeSO 4]、[EMIm] [MeSO4]、[BMIm] [MeSO4]、[Me (OEt) 3MIm] [Tf2N];所述銨鹽離子液體為 [Choline] [Cl]、[Choline] [H2PO4]、[NMe3] [MeSO3]、[NBu4] [MeSO3]、[NMe3] [H2PO4]、[ETM] [Tf2N];所述磷鹽離子液體為[PBu 4] [Ac]。
[0013] 所述的全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其中，所述深度低共熔溶劑為膽堿醋酸鹽 型DESs或膽堿氯鹽型DESs。
[0014] 所述的全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其中，所述膽堿醋酸鹽型DESs為ChAc/U、 ChAc/A、ChAc/G 或 ChAc/EG〇
[0015] 所述的全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其中，所述膽堿氯鹽型DESs為ChCl/U、 ChCl/A、ChCl/G 或 ChCl/EG〇
[0016] 所述的全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其中，所述步驟S4中，錐形瓶中還添加有 無(wú)機(jī)氮源。
[0017] 所述的全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其中，所述無(wú)機(jī)氮源為尿素。
[0018] 有益效果：本發(fā)明的反應(yīng)體系中，通過(guò)添加離子溶劑或無(wú)機(jī)氮源，使得香草醛的產(chǎn) 率得到大幅提升，同時(shí)通過(guò)選用高特異性的菌株CGMCC1347,其高特異性地轉(zhuǎn)化異丁香酚生 成香草醛，減少了副產(chǎn)物的生成，降低了后期分離純化的成本。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明中添加不同咪唑型離子液體對(duì)香草醛產(chǎn)率的影響對(duì)比圖。
[0020] 圖2為本發(fā)明中添加不同銨鹽離子液體對(duì)香草醛產(chǎn)率的影響對(duì)比圖。
[0021] 圖3為本發(fā)明中添加磷鹽離子液體對(duì)香草醛產(chǎn)率的影響對(duì)比圖。
[0022] 圖4為本發(fā)明中添加不同膽堿醋酸鹽型深度低共熔溶劑對(duì)香草醛產(chǎn)率的影響對(duì) 比圖。
[0023] 圖5為本發(fā)明中添加不同膽堿氯鹽型深度低共熔溶劑對(duì)香草醛產(chǎn)率的影響對(duì)比 圖。
[0024] 圖6為本發(fā)明中添加不同含量尿素對(duì)香草醛產(chǎn)率的影響對(duì)比圖。
[0025] 圖7為本發(fā)明中實(shí)施例4上清液的高效液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明提供一種全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及 效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例 僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027] 本發(fā)明選取了一株高特異性的菌株，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中 心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，保藏編號(hào)是： CGMCC1347,此菌株已于2005年4月8日保存于中國(guó)微生物菌株保藏管理委員會(huì)普通微生 物保藏中心，此菌株屬于紡錘芽孢桿菌Bacillus fusiformis，該菌株能夠高特異性地轉(zhuǎn)化 異丁香酚生成香草醛，無(wú)副產(chǎn)物生成。
[0028] 本發(fā)明所提供的全細(xì)胞催化合成香草醛的方法，其包括步驟： 51、 將保存的菌株CGMCC1347接入種子培養(yǎng)基中活化，32~40°C、100~300rpm振蕩反應(yīng) 6~36h得到種子液； 52、 反應(yīng)結(jié)束后，取2ml種子液接入30~70ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，32~40°C、100~300rpm振蕩 反應(yīng)12~36h得到菌液； 53、 取IOml菌液3000~6000rpm離心5~20min，棄上清，獲得濕菌體； 54、 往濕菌體中加入5~15ml緩沖溶液，重懸菌體并轉(zhuǎn)移至裝有0. 1~0. 5g異丁香酷的錐 形瓶中，蓋上橡膠塞，25~35°C、100~300rpm振蕩反應(yīng)48~96h ; 55、 反應(yīng)結(jié)束后，加入5~15ml95%乙醇以終止反應(yīng)，沉淀蛋白并溶解底物和產(chǎn)物，充分 混勾后 5000~8000rpm 離心 IOmin ; 56、 取離心后的上清液，用乙醇稀釋?zhuān)^(guò)濾后得到香草醛。
[0029] 所述步驟S4中，錐形瓶中還添加有50~15〇μ1離子溶劑，本發(fā)明中所采用的離子溶 劑分為離子液體（ILs)和深度低共熔溶劑（DESs)兩大類(lèi)。
[0030] 其中的離子液體（ILs)是由特定的有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子構(gòu)成的在室 溫或近室溫下呈液態(tài)的熔鹽體系，具有蒸汽壓低、熔點(diǎn)低、不易揮發(fā)、溶解性能優(yōu)良、可設(shè)計(jì) 性高等優(yōu)點(diǎn)，在生物催化領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
[0031] 其中的深度低共熔溶劑（DESs)是由季銨鹽和氫鍵供體按照一定的摩爾比混合而 成的低熔點(diǎn)混合物，是一種新型的離子溶劑，與傳統(tǒng)的離子液體性質(zhì)相近，而且具有原料成 本更低、制備更簡(jiǎn)單、生物相容性更高、溶劑設(shè)計(jì)選擇范圍更廣等優(yōu)點(diǎn)。酶在含有DES的體 系中催化轉(zhuǎn)酯化、脫氨基等反應(yīng)時(shí)，其催化活性和穩(wěn)定性要比在傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑中高。
[0032] 具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明所涉及的離子液體（ILs)有3型共35種（咪唑型離子液體17 種、銨鹽離子液體17種、磷鹽離子液體1種），深度低共熔溶劑（DESs)有2型共24種（膽 堿醋酸鹽深度低共熔溶劑12種、膽堿氯鹽深度低共熔溶劑12種）。通過(guò)添加一定量不同的 離子溶劑，篩選出多種離子溶劑，它們的少量添加即可提高香草醛的產(chǎn)率。本發(fā)明還可通過(guò) 添加結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)氮源，例如尿素，來(lái)提高香草醛的產(chǎn)率。
[0033] 實(shí)施例1 a、將保存的菌株CGMCC1347接入種子培養(yǎng)基中活化，37°C、220rpm振蕩反應(yīng)12h得到種 子液，種子培養(yǎng)基（IL)的配方是：蛋白胨l〇g、酵母膏5g、NaCl 10g，調(diào)整pH至7.0; b、 反應(yīng)結(jié)束后，取2ml種子液接入50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、220rpm振蕩反應(yīng)16h得到 菌液，發(fā)酵培養(yǎng)基（IL):蛋白胨 5g、KH2P04 5.2g、K2HP04.3H20 14g、MgS04.7H20 Ig (ρΗ7·0); c、 取IOml菌液5000rpm離心10min，棄上清，獲得濕菌體； d、 往濕菌體中加入IOml緩沖溶液，重懸菌體并轉(zhuǎn)移至裝有0. 246g異丁香酷和IOOul 離子液體的錐形瓶中，蓋上橡膠塞，30°C、200rpm振蕩反應(yīng)72h ;其中的緩沖溶液為磷酸緩 沖溶液（IL) AH2PO4 5. 2g、K2HPO4 · 3H20 14g ;pH7. 0 (下同）； e、 反應(yīng)結(jié)束后，加入IOml 95% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）乙醇以終止反應(yīng)，沉淀蛋白并溶解底 物和產(chǎn)物，充分混勻后7000rpm離心10min ; f、 取離心后的上清液，用95%乙醇稀釋10倍，過(guò)濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。
[0034] HPLC檢測(cè)采用甲醇和0. 01%乙酸水溶液混合梯度洗脫（0-5min，20%-60% ; 5-15min，60% ; 15-20min，60%-20%)，流速 lml/min，進(jìn)樣量 IOul，波長(zhǎng) 270nm。
[0035] 如圖1所示，CONTROL