一種磁性全細(xì)胞催化劑及制備方法和生產(chǎn)生物柴油的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物和能源化工領(lǐng)域，特別是涉及一種磁性全細(xì)胞催化劑生產(chǎn)生物柴油的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]作為一種清潔的可再生能源，生物柴油的發(fā)展具有廣闊的市場(chǎng)前景。生物柴油的制備主要采用化學(xué)法，它具有工藝簡(jiǎn)單、操作費(fèi)用低、制得的產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。但是，化學(xué)法存在以下缺點(diǎn):反應(yīng)溫度較高、工藝復(fù)雜；能耗高；產(chǎn)品純化復(fù)雜，酯化產(chǎn)物難于回收；副產(chǎn)物難于去除；容易產(chǎn)生廢水，對(duì)環(huán)境造成二次污染等。
[0003]為解決化學(xué)法存在的上述問(wèn)題，人們開始深入研究利用生物法制備生物柴油。一個(gè)很有前景的解決方法是利用全細(xì)胞生物催化劑來(lái)制備生物柴油。例如，中國(guó)專利CN103789364A公開了一種畢赤酵母全細(xì)胞催化制備生物柴油的方法，該方法以脂肪酶基因重組載體和酵母宿主為出發(fā)材料，利用酵母重組表達(dá)和高密度發(fā)酵，基于高效胞內(nèi)表達(dá)脂肪酶制備重組畢赤酵母全細(xì)胞，同時(shí)結(jié)合通透性處理，將通透型酵母全細(xì)胞應(yīng)用于生物柴油催化，制備高得率的生物柴油。中國(guó)專利CN102367459A公開了一種米根霉全細(xì)胞催化蠶蛹油制備生物柴油的方法，該方法將培養(yǎng)的米根霉發(fā)酵混合液減壓抽濾，再將得到的米根霉菌絲體再冷凍干燥8-12h，然后直接把米根霉菌絲體加入到蠶蛹油、甲醇、乙酸鈉緩沖液中反應(yīng)，制備生物柴油。但是，這些利用全細(xì)胞催化劑制備生物柴油的方法，其操作過(guò)程比較復(fù)雜，細(xì)胞沒(méi)有固定化，所以全細(xì)胞催化劑在生物柴油制備反應(yīng)體系中，難于分離。
[0004]中國(guó)專利CN102952754A公開了一種利用固定化細(xì)胞制備生物柴油的方法，該方法分兩步，先制備出多孔多胺化殼聚糖微球載體，再將自制的具有高脂肪酶活力單位的微生物菌種，固定在此微球載體上，然后催化廢棄餐飲油制備出生物柴油，該方法操作復(fù)雜，。中國(guó)專利CN103421716A公開了一種磁性全細(xì)胞催化劑的制備方法，也分兩步，先制備出磁性殼聚糖微球，然后再把產(chǎn)脂肪菌固定在微球載體上，制備過(guò)程比較復(fù)雜，而且凝結(jié)液使用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為20%的NaOH水溶液和體積百分?jǐn)?shù)為30%的甲醛水溶液，高濃度的NaOH水溶液對(duì)容器腐蝕很嚴(yán)重，甲醛有毒，造成環(huán)境污染，安全性低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種穩(wěn)定性好、安全性高、易于回收的并且可以重復(fù)利用的磁性全細(xì)胞催化劑。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種磁性全細(xì)胞催化劑的制備方法。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種磁性全細(xì)胞催化劑生產(chǎn)生物柴油的方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0009]—種磁性全細(xì)胞催化劑的制備方法，包括如下步驟:
[0010](I)將門多薩假單胞菌接種到100-150mL LB培養(yǎng)基中，28_35°C、140_160r/min培養(yǎng)20-30h，在7000-10000r/min離心10_15min，棄去上清液，收集門多薩假單胞菌細(xì)胞；
[0011](2)按比例，取0.5-1.5g S12-Fe3O4納米顆粒，加入到50-100mL質(zhì)量百分比為2.5%-3.5%的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后，再加入步驟(I)獲得的菌細(xì)胞，混勻后得到混合液；所述海藻酸鈉溶液的溶劑為0.5-1.5M氫氧化鈉水溶液；
[0012](3)將步驟⑵獲得的混合液逐滴滴入攪拌條件下的150-200mL l_2mol/L無(wú)菌CaCl2水溶液中，所述攪拌的速率為200-400r/min，待混合液滴加完成后，靜置1.5_3h，用磁鐵吸出磁性微球，并用滅菌水反復(fù)清洗至中性，即獲得磁性全細(xì)胞催化劑。
[0013]門多薩假單胞菌優(yōu)選保藏號(hào)為CGMCC N0.7644的門多薩假單胞菌Pseudomonasmendocina0
[0014]混合液逐滴滴入所使用設(shè)備滴頭的內(nèi)徑優(yōu)選1.19-1.54mm。
[0015]混合液逐滴滴入所使用注射器針頭的內(nèi)徑優(yōu)選1.19-1.54_。
[0016]上述方法制備的磁性全細(xì)胞催化劑。
[0017]用上述磁性全細(xì)胞催化劑生產(chǎn)生物柴油的方法，包括如下步驟:
[0018]按比例，取30-50粒磁性全細(xì)胞催化劑，加入到10-15mL油脂和l_2mL甲醇中，在28-350C、140-160r/min條件下反應(yīng)，每隔10_12h加入l_2mL甲醇，反應(yīng)2-3天，用磁鐵吸出反應(yīng)后的磁性全細(xì)胞催化劑，剩余液體離心后取上清液過(guò)濾，得到含有生物柴油的濾液。
[0019]油脂可以選自棕櫚油、豆油、油菜籽油、棉籽油、玉米油、葵花籽油、麻瘋樹油、工業(yè)豬油、牛油、魚油、地溝油和藻油中至少一種。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0021]1.本發(fā)明的一種磁性全細(xì)胞催化劑的制備方法，為一步法，操作簡(jiǎn)單，避免了傳統(tǒng)兩步法生產(chǎn)中先制備載體后固定細(xì)胞的繁瑣過(guò)程。而且一步法是在制備固定化載體的過(guò)程中，直接添加細(xì)胞，提高了細(xì)胞的負(fù)載量，并且可使制備出的磁性全細(xì)胞催化劑中的細(xì)胞均勻分布在顆粒的內(nèi)部和表面，在生產(chǎn)生物柴油時(shí)內(nèi)部細(xì)胞可以緩慢釋放，提高了全細(xì)胞催化劑的催化能力和重復(fù)利用性。
[0022]2.本發(fā)明的一種磁性全細(xì)胞催化劑的制備方法，制備過(guò)程中涉及到的化學(xué)試劑對(duì)反應(yīng)設(shè)備的腐蝕相對(duì)較小，安全性高，條件溫和，而且對(duì)環(huán)境的污染也相對(duì)較小。
[0023]3.本發(fā)明的一種磁性全細(xì)胞催化劑的制備方法，制備過(guò)程中Fe3O4表面包覆的一層生物相容性高的S12，可使S12-Fe3O4與海藻酸鈉連接更緊密，提高了磁性全細(xì)胞催化劑的成球性和穩(wěn)定性，使多次重復(fù)利用后仍不破碎。而且S12*可使制備出的磁性全細(xì)胞催化劑磁性更強(qiáng)更持久，在生產(chǎn)生物柴油時(shí)更有利于分離。
[0024]4.本發(fā)明的一種磁性全細(xì)胞催化劑的制備方法，制備出的磁性全細(xì)胞催化劑，顆粒直徑在2-6_，生物活性高而且在生物柴油制備反應(yīng)體系中，磁性全細(xì)胞催化劑可以直接用磁鐵分離吸出，由于細(xì)胞分布在顆粒的內(nèi)部和表面，在多次循環(huán)使用后磁性全細(xì)胞催化劑的活性仍很高，用磁性全細(xì)胞催化劑生產(chǎn)生物柴油的方法降低了生物柴油生產(chǎn)工藝的難度，操作簡(jiǎn)單、條件溫和、適用性強(qiáng)、安全性高、適合批量生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為實(shí)施例1制備的磁性全細(xì)胞催化劑。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。下面的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明作任何限制。
[0027]本發(fā)明各實(shí)施例所使用的S12-Fe3O4納米顆粒采用中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?01510312626.0的方法制備。
[0028]各實(shí)施例所使用的門多薩假單胞菌均為保藏號(hào)為CGMCC N0.7644的門多薩假單胞菌 Pseudomonas mendocina。
[0029]門多薩假單胞菌Pseudomonas mendocina，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCC N0.7644，保藏日期為2013年5月27日，建議分類命名為門多薩假單胞菌 Pseudomonas mendocina。
[0030]實(shí)施例1
[0031]—種磁性全細(xì)胞催化劑的制備方法，包括如下步驟:
[0032](I)將保藏號(hào)為CGMCC N0.7644的門多薩假單胞菌Pseudomonas mendocina (以下簡(jiǎn)稱門多薩假單胞菌)接種到10mL LB培養(yǎng)基中，35°C、160r/min培養(yǎng)20h，在9000r/min離心12min，棄去上清液，收集門多薩假單胞菌細(xì)胞；
[0033](2)按比例，取Ig S12-Fe3O4納米顆粒，加入到70mL質(zhì)量百分比為3%的海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后，再加入步驟(I)獲得的菌細(xì)胞，混勻后得到混合液；所述海藻酸鈉溶液的溶劑為IM氫氧化鈉水溶液；
[0034](3)將步驟(2)獲得的混合液用配有內(nèi)徑為1.36mm針頭的注射器逐滴滴入攪拌條件下的150mL 1.5mol/L無(wú)菌CaCl2水