一株可降解多種鄰苯二甲酸酯的微桿菌(Microbacterium sp.)J-1的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術領域，具體涉及一株可同時高效降解多種鄰苯二甲酸酯的新菌株，更具體地，涉及一株可降解多種鄰苯二甲酸酯的微桿菌(Microbac teria?sp.) J-1。
【背景技術】
[0002]眾多研宄表明，鄰苯二甲酸醋類化合物(Phthalic acid ester，PAEs)具有高毒性，致畸性、致癌性和致突變性，以及生殖毒性。PAEs主要被用作塑料工業(yè)的增塑劑，目前已成為全球最普遍的污染物之一，被美國環(huán)境保護局(EPA)和中國環(huán)境監(jiān)測總站列為優(yōu)先控制污染物(pr1rity pollutant)。根據(jù)美國國家癌癥研宄所的研宄結(jié)果，其中鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、甲酸二正丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)和鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)等6種鄰苯二甲酸酯被美國EPA列為優(yōu)先控制污染物。由于塑料制品的大量使用，PAEs廣泛存在于大氣、水體、土壤以及生物體中。由于PAEs是一類疏水性有機污染物，具有較高的辛醇-水分配系數(shù)(Kow)，容易吸附于沉積物和土壤顆粒物上。目前我國農(nóng)業(yè)土壤中PAEs化合物的含量一般在幾yg/kg至幾十mg/kg。已有的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國農(nóng)業(yè)土壤中PAEs化合物有不同程度的超標，部分土壤的個別PAEs化合物超標嚴重，因此PAEs污染土壤的修復問題亟待解決。
[0003]環(huán)境中的PAEs可通過水解、光解和生物降解而消失，其中生物降解是其消失的主要途徑。近年來，PAEs的細菌降解已經(jīng)得到廣泛的研宄，大量高效降解PAEs的菌株已經(jīng)從各類環(huán)境中分離得到，包括紅樹林、土壤、海洋、河流與廢水處理廠的活性污泥等。然而，大多數(shù)已報道的降解菌均是僅對一種鄰苯二甲酸酯具有高效降解能力，而既能夠高效降解簡單的短鏈PAEs又能降解復雜的支鏈或長鏈PAEs的降解菌種質(zhì)資源很少被發(fā)現(xiàn)。同時，關于微桿菌對PAEs污染土壤的修復效果尚無報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是針對當前多種PAEs污染修復技術的不足，提供一種可同時高效降解多種PAEs的降解菌，該菌對PAEs降解效率高，且易培養(yǎng)。
[0005]本發(fā)明的技術方案可通過以下技術實現(xiàn):
一株新的可同時高效降解多種PAEs的降解菌，具體為微桿菌(#icrc^aci6?riwfflsp.)菌株J-1，該菌株于2015年I月22日保藏在中國武漢武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC Ν0:Μ 2015055，分類命名為#icro如Cieri廣sp.J-1。
[0006]本發(fā)明從污水處理廠的活性污泥中分離出一株對多種PAEs具有高效降解能力的微桿菌，并研宄其在多種PAEs污染土壤中的修復效果，結(jié)果表明該菌可有效降低土壤中的PAEs污染，是理想的土壤環(huán)境污染修復微生物，具有十分廣泛的應用前景。
[0007]所述微桿菌(Microbactoriuim^.)菌株J-1在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)七天的菌落較小，呈黃白色，濕潤，凸起，有光澤，邊緣整齊。掃描電鏡下多為球狀或近球狀，直徑0.4~1 μπι。
[0008]所述微桿菌{Microbac ter iump.)菌株 J-1 的 16S rDNA 基因序列如 SEQ ID NO:1所示。通過NCBI官方網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的BLAST程序與其他已登錄細菌菌株16S rDNA序列進行比對，結(jié)果表明該菌株與#icrc^ac?6?ri?? sp.相似性最高，同源率達99%。
[0009]所述微桿菌(JlicrobacteriumiK )菌株J-1能降解多種PAEs，特別是對短鏈PAEs，如DMP和DEP，3天的降解率均分別達到78.92%和71.57%，5天的降解率則達到93.42%和87.02%，7天幾乎全部降解(降解率多98%)。而針對長鏈PAEs，雖然相比短鏈PAEs降解速度較慢，但隨著培養(yǎng)時間的延長，仍能達到較好的降解效果。7天DBP、DOP和DEHP的降解率分別達到95.07%,91.11%和84.61%。
[0010]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明從污水處理廠的活性污泥中首次分離出一株對多種PAEs具有高效降解能力的微桿菌，該菌株能降解多種PAEs，特別是對短鏈PAEs。本發(fā)明提供的降解菌彌補了菌種資源庫中一菌多效菌種資源的不足；而且該菌在自然界中分布廣泛，適應能力強。同時本發(fā)明提供了該菌株在修復污染土壤中的應用研宄，為PAEs 土壤污染的生物處理提供了技術保障。
【附圖說明】
[0011]圖1為J-1菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的生長形態(tài)特征。
[0012]圖2為J-1菌株的掃描電鏡照片。
[0013]圖3為J-1菌株的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0014]圖4為J-1菌株對五種混合PAEs的降解效果。
[0015]圖5為未接菌的污染土壤處理中各PAEs的降解效果。
[0016]圖6為J-1菌株對污染土壤處理中各PAEs的降解效果。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步詳細闡述本發(fā)明。本發(fā)明以下實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，本發(fā)明主要闡述所述菌株以及基于所述菌株的應用思想，實施方式中簡單參數(shù)的替換不能一一在實施例中贅述，但并不因此限制本發(fā)明的保護范圍，其他任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，應被視為等效的置換方式，包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0018]實施例中所述培養(yǎng)基配方如下:
無機鹽培養(yǎng)液(MSM，g/L):K2HP04:5.8，KH 2P04:4.5，(NH 4)2S04:2.0，MgCl 2:0.16，CaCl 2:0.02，Na2MoO4.2H20:0.0024，F(xiàn)eCl3:0.0018，MnCl 2.2H20:0.0015。最終 pH 為 7.5。
[0019]牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB):酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，加超純水至1L，調(diào)節(jié)pH= 7.0 ;121°C滅菌20min。固體平板則添加1.5% (w/v)瓊脂粉。
[0020]實施例1菌株的分離與鑒定
采集污水處理廠的活性污泥，稱取5 g活性污泥樣品于含有50 mL無菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm培養(yǎng)3天后，取5 mL污泥懸液加入含有100 mL PAEs (分別含50mg/L DMP、DEP、DBP、DOP和DEHP )的上述MSM培養(yǎng)基中。經(jīng)30 °C，140 rpm培養(yǎng)7天后，每次按取I mL的接種量連續(xù)富集、轉(zhuǎn)接10次，并相應提高培養(yǎng)基中PAEs含量至800 mg/L。然后將馴化10次的培養(yǎng)液稀釋103~105涂布于LB固體平板上，30°C倒置培養(yǎng)1~3天。待平板上長出單菌落后，挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細菌，編號J-1。然后將菌株接種于LB固體平板上30°C倒置培養(yǎng)7天，觀察其菌落形態(tài)(見圖1)。由圖1可知，J-1菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)七天的菌落較小，呈黃白色，濕潤，凸起，有光澤，邊緣整齊。
[0021]掃描電鏡觀察鑒定:將純化后的J-1菌株接入含有10 mL的LB液體培養(yǎng)基過夜活化。吸取800 μ L菌液經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入I mL 2.5%戊二醛充分混勻，4°C靜置過夜。然后再次經(jīng)8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。隨后將菌體分別在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個梯度約浸泡15 min,然后8000 rpm離心去上清液，最后用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次20 min，方法同上述乙醇脫水過程。經(jīng)過CO2干燥后制片觀察。圖2可見在掃描電鏡下J-1菌體多為球狀或近球狀，直徑0.4~1 μπι。
[0022]菌株的16S rDNA分子鑒定:提取J-1菌株的總DNA，用細菌16S rDNA通用引物對該菌基因組進行PCR擴增。