具有植物毒活性的產(chǎn)黃青霉屬真菌及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有植物毒活性的產(chǎn)黃青霉屬真菌及其制備方法和應(yīng)用，屬于微 生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織報(bào)道，全世界有雜草約5萬(wàn)種，其中農(nóng)田雜草為8000種。雜草是 在長(zhǎng)期適應(yīng)當(dāng)?shù)刈魑?、栽培、耕作、土壤、氣候等生態(tài)環(huán)境及社會(huì)條件中生存下來(lái)的，從多方 面危害作物。它們與農(nóng)作物爭(zhēng)奪水、肥、光等，侵占地上和地下的空間，影響作物光合作用， 干擾作物生長(zhǎng)，影響產(chǎn)量和質(zhì)量。此外，許多雜草又是危害作物的病菌、害蟲的中間宿主，如 稗草是稻飛虱、稻葉蟬、黏蟲等的中間寄主。雜草是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的大敵，雜草不除，最終導(dǎo)致作 物減產(chǎn)，造成的損失則是不容忽視的。
[0003] 化學(xué)除草劑具有作用迅速、使用方便等特點(diǎn)，在雜草治理中發(fā)揮了重要作用（張 玉聚，孫化田，王春生.除草劑及其混用與農(nóng)田雜草化學(xué)防治[M]北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2000:3-6)。但化學(xué)除草劑的不斷應(yīng)用，也引起作物的藥害，耐藥雜草種群的上升，環(huán)境污染 日趨嚴(yán)重。利用微生物代謝產(chǎn)物，特別是植物病原真菌毒素，開(kāi)發(fā)微生物除草劑一般為多靶 標(biāo)作用，不容易引起雜草抗性的產(chǎn)生，具有靶標(biāo)針對(duì)性強(qiáng)、開(kāi)發(fā)成功率高、易于生產(chǎn)加工 等特性，已成為生物除草劑研究的熱點(diǎn)之一，并顯示出良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景(張紅玉.植 物病原真菌毒素除草活性研究現(xiàn)狀.草業(yè)科學(xué)，2009, 26-10,160-164)。
[0004] 松材線蟲病，又稱松樹(shù)萎蔫病、松樹(shù)枯萎病、松材線蟲萎蔫病，是嚴(yán)重危害我國(guó)松 林安全的最主要外來(lái)入侵有害生物病害，是引起松樹(shù)毀滅性的重大森林生物災(zāi)害病害， 素有松樹(shù)"癌癥"之稱，世界四大森林病害之一，并可危害36種松屬植物和8種非松屬植 物。由于該病發(fā)病迅速，危害嚴(yán)重，死亡率高，防治極其困難，世界各國(guó)給予高度重視， 它一直作為我國(guó)對(duì)外和對(duì)內(nèi)的林業(yè)有害生物檢疫對(duì)象，也是全國(guó)林業(yè)有害生物防治工作重 點(diǎn)之一。據(jù)國(guó)家林業(yè)局統(tǒng)計(jì)（2002年），該病發(fā)生817萬(wàn)hm2，累計(jì)造成3500多萬(wàn)株松 樹(shù)死亡，主要威脅著林業(yè)生產(chǎn)和生物多樣性，嚴(yán)重破壞森林生態(tài)效應(yīng)，直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)25 億元，間接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)250億元（陳守常，松材線蟲病病原與致病機(jī)理研究進(jìn)展，四川林業(yè) 科技，2010, 31-1，18-25)。
[0005] 近年來(lái)，我國(guó)許多地方發(fā)現(xiàn)不明原因枯死松樹(shù)現(xiàn)象，經(jīng)研究人員分離，發(fā)現(xiàn)不 少枯死松樹(shù)中存在與松材線蟲形態(tài)極為相似的擬松材線蟲[魏素珍，史延梅，陳鳳毛， 擬松材線蟲及其致病性，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38 ( 36) : 20666- 20667]。從近幾年的研 究結(jié)果看，擬松材線蟲往往比松材線蟲分布范圍更廣，在同一地區(qū)常常是擬松材線蟲先出 現(xiàn)，然后才有松材線蟲出現(xiàn)。在我國(guó)也發(fā)現(xiàn)許多非松材線蟲病疫區(qū)的松樹(shù)上存在擬松材線 蟲，并且一些地方的馬尾松發(fā)生大面積死亡，但死松中卻無(wú)松材線蟲，防治擬松材線蟲 的研究也成為新的研究熱點(diǎn)。
[0006] 植物內(nèi)生真菌來(lái)源于植物體，通過(guò)產(chǎn)生抵抗多種病原菌的抗生素類物質(zhì)或毒素， 幫助宿主植物抵抗生物類侵害，包括病原細(xì)菌、真菌、病毒及線蟲等，是重要的植物病害防 治菌種資源。因此植物內(nèi)生真菌代謝物具有環(huán)境友好性，對(duì)靶標(biāo)生物不易產(chǎn)生抗藥性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供具有植物毒活性的產(chǎn)黃青霉屬真菌及其制備方法和應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明從植物體內(nèi)分離出菌株，并將菌株的代謝物作用于其他植物。
[0009] -種具有植物毒活性的產(chǎn)黃青霉屬真菌，菌株為產(chǎn)黃青霉屬 真菌；該菌株F18已于2013年4月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，保藏中心地址是：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所，郵編是100101，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7451;菌株F18屬產(chǎn)黃青霉屬真菌 具福射狀皺紋，邊緣菌絲體白色，質(zhì)地絨狀，分生孢子結(jié)構(gòu)大 量，藍(lán)綠色，有些許淺黃色滲出液和可溶性色素，菌落反面呈淺黃褐色。
[0010] 一種具有植物毒活性的產(chǎn)黃青霉屬真菌的制備方法，其特征在于該方法先后用酒 精、無(wú)菌水沖洗紅車軸草（/Tra)葉片，然后在無(wú)菌條件下將葉片組織碾碎， 加入無(wú)菌水，獲得紅車軸草葉片組織懸浮液，對(duì)懸浮液進(jìn)行系列梯度稀釋，得到不同濃度的 稀釋液，分別取一定體積的不同濃度稀釋液，均勻涂抹在細(xì)分離馬丁氏培養(yǎng)基平板上，將平 板在特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的真菌菌落后，挑取適合計(jì)數(shù)的濃度平板，進(jìn) 行計(jì)數(shù)，并將所有的菌落在新鮮的馬丁氏培養(yǎng)基上純化，得到純的真菌菌株后，在低溫冰箱 做短期或長(zhǎng)期保存。
[0011] 本發(fā)明所述的制備方法中，將紅車軸草葉片完全浸入酒精中，充分振蕩，然后用無(wú) 菌水反復(fù)沖洗。
[0012] 本發(fā)明所述的制備方法中，紅車軸草葉片組織懸浮液的梯度稀釋方法，以10倍體 積為單位，用無(wú)菌水進(jìn)行系列稀釋，得到濃度梯度為1〇_\1〇_ 2直至1〇_8的系列稀釋液。
[0013] 本發(fā)明所述的制備方法中，取一定體積的系列稀釋液的方法，從濃度梯度為 l(T4-l(r8的系列稀釋倍數(shù)中，分別取0. 1ml均勻涂布在馬丁氏平板培養(yǎng)基上。
[0014] 本發(fā)明所述的制備方法中，馬丁氏真菌分離培養(yǎng)基是由K2HP04 ? 3H20lg， MgS04*7H20 0? 5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，瓊脂 15 ~20g，水 1000mL，自然pH。
[0015] 本發(fā)明所述的制備方法中，特定培養(yǎng)條件為在馬丁氏平板培養(yǎng)基上，28±2°C避光 培養(yǎng)。
[0016] 本發(fā)明所述的制備方法中，選擇適合計(jì)數(shù)的濃度平板方法，在直徑為90mm的培養(yǎng) 皿中，肉眼可見(jiàn)的單個(gè)分散的菌落數(shù)在100-150CFU。
[0017] 所述的真菌菌株保存方法，短期保存可采用馬丁氏斜面培養(yǎng)基劃線在4°C下保存， 如果做長(zhǎng)期保存，可在馬丁氏液體培養(yǎng)基和甘油的混合液中在-70°C下保存，馬丁氏液體培 養(yǎng)基和甘油的體積比為1:1。
[0018] 本發(fā)明提供的產(chǎn)黃青霉屬真菌F18的代謝物對(duì)其他植物具有明顯的植物毒活性。
[0019] 本發(fā)明提供的產(chǎn)黃青霉屬真菌F18的代謝物對(duì)其他植物具有明顯的線蟲觸殺活 性。
[0020] 本發(fā)明的除草劑原材料來(lái)源于植物根際土壤，對(duì)于環(huán)境及植物、人、動(dòng)物等所有生 物無(wú)不良影響，而且生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單，不污染環(huán)境。
[0021] 本發(fā)明對(duì)于雜草的生物防治、微生物除草劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和農(nóng)產(chǎn)品的無(wú)公害生產(chǎn)， 具有極其重要的意義，適合于推廣應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明的線蟲觸殺物質(zhì)原材料來(lái)源于植物內(nèi)生真菌，對(duì)于環(huán)境及植物、人、動(dòng)物等 所有生物無(wú)不良影響，而且生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單，不污染環(huán)境。
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